Nghiên cứu quá trình tạo màng biocellulose trên môi trường bổ sung tảo xoắn arthrospira platensis (spirulina)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI ************ VŨ THỊ LOAN NGHIÊN CỨU Q TRÌNH TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRÊN MƠI TRƯỜNG BỔ SUNG TẢO XOẮN ARTHROSPIRA PLATENSIS (SPIRULINA) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60 42 01 20 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung, người tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân quan tâm giúp đỡ, động viên suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2017 Học viên Vũ Thị Loan LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn Thạc sỹ: “Nghiên cứu q trình tạo màng Biocellulose mơi trường bổ sung tảo xoắn Arthrospira platensis (Spirulina)” Kết nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Nội dung khóa luận khơng trùng với viết, cơng trình nghiên cứu tác giả khác Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2017 Học viên Vũ Thị Loan MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu .2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn Điểm đề tài Bố cục luận văn .3 Chương .4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tảo xoắn Spirulina 1.1.1 Lịch sử 1.1.2 Đặc điểm hình thái tảo Spirulina 1.1.3 Thành phần hóa học tảo xoắn Spirulina 1.2 Đặc điểm phân loại chi Gluconacetobacter 1.2.1 Danh pháp vị trí phân loại .7 1.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 1.3 Ảnh hưởng dinh dưỡng đến chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 1.3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon .9 1.3.2 Ảnh hưởng nguồn Nitơ 1.3.3 Ảnh hưởng photpho 1.4 Điều kiện nuôi cấy .10 1.4.1 Nhiệt độ .10 1.4.2 Độ pH 10 1.4.3 Đợ thơng khí 10 1.4.4 Thời gian nuôi cấy 10 1.5 Biocellulose 10 1.5.1 Cấu trúc 10 1.5.2 Một số tính chất 11 1.5.3 Cơ chế tổng hợp 12 1.5.4 Chức cellulose vi khuẩn Gluconacetobacter 14 1.6 Ứng dụng màng Biocellulose 15 1.6.1 Ứng dụng màng Biocellulose một số lĩnh vực 15 1.6.2 Ứng dụng màng Biocellulose vào mặt nạ dưỡng da 16 1.7 Tình hình nghiên cứu sản xuất .17 1.7.1 Trên giới 17 1.7.2 Tại Việt Nam .19 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 Đối tượng thiết bị nghiên cứu .21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Thiết bị hóa chất 21 2.1.3 Môi trường 22 2.2 Phạm vi nghiên cứu 22 2.3.Thời gian nghiên cứu: 22 2.4 Nội dung nghiên cứu 22 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Phương pháp vi sinh 23 2.5.2 Phương pháp hóa sinh 26 2.5.3 Phương pháp vật lý (xác định độ bền học) 28 2.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng dinh dưỡng đến khả tạo màng 29 2.5.5 Phương pháp xác định trọng lượng tươi màng 30 2.5.6 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 30 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .32 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tạo màng môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina .32 3.1.1 Phân lập vi khuẩn giấm từ môi trường tảo xoắn Spirulina 32 3.1.2 Tuyển chọn vi khuẩn giấm có khả tạo màng Biocellulose 37 3.2 Nghiên cứu động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn G xylinus AG7 40 3.3 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng tới khả tạo màng chủng vi khuẩn G xylinus AG7 43 3.3.1 Ảnh hưởng cacbon .43 3.3.2 Ảnh hưởng nitơ 45 3.3.3 Ảnh hưởng KH2PO4 .47 3.3.4 Ảnh hưởng MgSO4.7H2O .48 3.4 Ảnh hưởng điều kiện môi trường tới khả tạo màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G xylinus AG7 49 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 49 3.4.2 Ảnh hưởng pH .51 3.5 Khảo sát khả tạo màng môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 Kết luận 55 Kiến nghị .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU : Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) g/l : gam lít G xylinus : Gluconacetobacter xylinus Spirunina : Arthrospira platensis OD : aptical density mm : milimet STT : số thứ tự AG2 : Gluconacetobacter xylinus AG2 AG4 : Gluconacetobacter xylinus AG4 AG6 : Gluconacetobacter xylinus AG6 AG7 : Gluconacetobacter xylinus AG7 UV : Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Bảng 1.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến tạo màng Biocellulose Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn giấm phân lập 33 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thành màng cellulose chủng Gluconacetobacter 38 Bảng 3.3 Hàm lượng axit axetic tạo thành chủng Gluconacetobacter 38 Bảng 3.4 Kết đo độ bền học màng Biocellulose 39 Bảng 3.5 Quá trình sinh trưởng chủng G.xylinus AG7 (x106 tế bào/ml) 41 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tạo màng Biocellulose chủng G xylinus AG7 44 Bảng 3.7 Ảnh hưởng hàm lượng glucose đến trình tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G xylinus AG7 45 Bảng 3.8 Ảnh hưởng hàm lượng (NH 4)2SO4 đến trình tạo màng Biocellulose 46 Bảng 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng KH 2PO4 đến trình tạo màng Biocellulose 47 Bảng 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả tạo màng Biocellulose chủng G xylinus AG7 48 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hình thành màng Biocellulose chủng G xylinus AG7 49 Bảng 3.12 Ảnh hưởng pH tới trình lên men tạo màng chủng G xylinus AG7 51 Bảng 3.13 Khảo sát khả tạo màng môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina 53 Bảng 3.14 Các bước xử lý màng Biocellulose 54 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình dạng tảo Spirulina quan sát kính hiển vi Hình 1.2 Sợi cellulose thực vật 11 Hình 1.3 Sợi cellulose màng Biocellulose qua xử lí vi khuẩn 11 Hình 1.4 Con đường chuyển hóa cacbon vi khuẩn Gluconacetobacter 14 Hình 3.1 Dịch tảo xoắn lên men .32 Hình 3.2 Khuẩn lạc vi khuẩn giấm mẫu phân lập 32 Hình 3.3 Hoạt tính catalase khuẩn Gluconacetobacter 36 Hình 3.4 Màng thu 320C 50 Hình 3.5 Màng thu pH: .52 Đồ thị 2.1 Tương quan giá trị OD610 với số lượng tế bào vi khuẩn G.xylinus AG7 26 Đồ thị 3.1 Động thái sinh trưởng phát triển chủng G.xylinus AG7 41 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Ngày nay, quốc gia giới công nghệ sinh học khơng ngành mẻ mà trở thành ngành kinh tế chủ đạo phát triển khoa học kĩ thuật công nghệ Là phận công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh phát triển mạnh mẽ, ngày có nhiều ứng dụng thiết thực vào sống Như biết, tảo xoắn Spirulina loại vi sinh vật có hình xoắn sống nước mà người ta quen gọi Tảo xoắn với tên khoa học Spirulina platensis, sinh khối chúng giàu dinh dưỡng có nhiều tác dụng chữa bệnh nên nuôi trồng quy mô công nghiệp sản xuất dạng viên để phòng chống nhiều loại bệnh tật Đặc biệt thành phần dinh dưỡng sinh khối Tảo xoắn giàu dinh dưỡng, đáng ý chỗ sinh khối chứa tới 50- 62 % protein với đủ loại axít amin cần thiết cho nhu cầu dinh dưỡng thể Ngồi chứa phong phú vitamin B12, Beta-carotene, xanthophyll nhiều ngun tố khống Chính xem tảo xoắn nguồn dinh dưỡng cao sử dụng làm mặt nạ dưỡng da Một chủng vi khuẩn sử dụng rộng rãi công nghệ lên men vi sinh vi khuẩn Gluconacetobacter Vi khuẩn Gluconacetobacter nuôi cấy môi trường dịch lỏng điều kiện nuôi cấy tĩnh, tạo nên lớp màng bề mặt dung dịch, màng có chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter – gọi màng sinh học Màng có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả giữ hình dạng ban đầu, khả giữ nước hút nước cao Màng có ứng dụng đa dạng nhiều lĩnh vực y học, thực phẩm, mỹ phẩm, bảo vệ môi trường, công nghiệp [2], [3] Ở Việt Nam, từ năm 2000 nhóm nghiên cứu tác giả Nguyễn Văn Thanh cộng có số cơng trình nghiên cứu màng Biocellulose từ Gluconacetobacter bước đầu nghiên cứu đặc tính màng thu sở để chế tạo màng sinh học dùng trị bỏng Việt Nam [10] 46 nitơ nhiều vi khuẩn không sử dụng hết làm ô nhiễm mơi trường, hàm lượng nitơ q không đủ để cung cấp cho hoạt động sống vi khuẩn Do xác định đủ hàm lượng nitơ điều cần thiết cho trình sản xuất đạt hiệu Vi khuẩn sử dụng nguồn nitơ vô muối amoni như: (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 Theo nghiên cứu trước đây, nguồn nitơ vô (NH4)2SO4 cho khối lượng màng Biocellulose lớn (NH4)2SO4 xem yếu tố kích thích sinh trưởng vi khuẩn G xylinus AG7, nguồn (NH4)2SO4 thích hợp làm khối lượng màng Biocellulose tăng lên, hàm lượng (NH4)2SO4 thấp không đủ nitơ cung cấp cho sinh trưởng vi khuẩn G xylinus AG7 nên làm cho khối lượng màng Biocellulose giảm Vì vậy, tơi tiếp tục tiến hành thí nghiệm tìm nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp cho phát triển vi khuẩn G xylinus AG7 Pha môi trường với nồng độ (NH4)2SO4 từ 0,9 - 2,1 (g/l) Kết thu bảng 3.8 sau: Bảng 3.8 Ảnh hưởng hàm lượng (NH4)2SO4 đến trình tạo màng Biocellulose Hàm lượng (NH4)2SO4(g/) 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9 2,1 Khối lượng tươi màng (g) 2,28 ± 0,01 2,48 ± 0,02 2,62 ± 0,01 2,86 ± 0,01 2,40 ± 0,02 1,90 ± 0,01 1,76 ± 0,01 Đặc điểm màng Màng mỏng, dai Màng mỏng, dai, Màng mỏng, độ dai chưa cao nhẵn (1,2 – 1,6 mm) Qua biểu đồ thấy việc tăng hàm lượng (NH4)2SO4 làm khối lượng màng Biocellulose tăng mức khác Khối lượng màng đạt cực đại hàm lượng (NH4)2SO4 1,5 (g/l), vượt 1,5 (g/l) khối lượng màng lại giảm xuống Như khối lượng màng Biocellulose lớn hàm lượng (NH4)2SO4 1,5(g/l) Chúng định sử dụng nguồn (NH4)2SO4 1,5(g/l) cho nghiên cứu Nguồn (NH4)2SO4 thích hợp cho chủng vi khuẩn G xylinus AG7 1,5(g/l) 47 3.3.3 Ảnh hưởng KH2PO4 Nguồn photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn Photpho nguyên tố tham gia cấu trúc nên tế bào vi khuẩn: cấu trúc nên màng tế bào (photpholipit), cấu trúc nên cấu trúc giàu lượng (ATP, ADP, NADH, NADPH)…trong môi trường lên men sử dụng KH2PO4 làm nguồn photpho chính, KH2PO4 nhân tố kích thích sinh trưởng cho tế bào vi khuẩn G xylinus AG7 Để xác định ảnh hưởng nguồn photpho tới khả tạo màng Chúng tiến hành khảo sát ảnh hưởng KH2PO4 đến khả tạo màng vi khuẩn G xylinus AG7 Nồng độ chất môi trường giữ nguyên thay đổi hàm lượng KH2PO4 mức 0,2- 1,6 (g/l) Kết thí nghiệm dẫn bảng 3.9 sau: Bảng 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 đến trình tạo màng Biocellulose Nồng độ KH2PO4 (g/l) Khối lượng tươi màng (g) Đặc điểm màng 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,93 2,18 2,55 2,75 2,83 2,70 2,63 2,30 ±0,02 ±0,01 ±0,01 ±0,02 ±0,02 ±0,01 ±0,01 ±0,02 Màng mỏng, dai Màng mỏng, dai nhẵn Màng mỏng, (độ dày 1,2 – 1,6mm) dai Kết nghiên cứu phát triển tế bào vi khuẩn G.xylinus AG7 môi trường có chứa KH2PO4 từ hàm lượng 0,2 – 1,6(g/l) gần nhau, chênh lệch (0,2 g/l) Nhưng khả tạo màng vi khuẩn từ nồng độ 0,2 – 1,6 (g/l) lại có chênh lệch lớn Ở hầu hết nồng độ vi khuẩn G.xylinus AG7 có khả tạo màng nồng độ thích hợp cho q trình tạo màng G.xylinus AG7 1(g/l) với khối lượng màng thu 2,83 g/l Kết phù hợp với kết Nguyễn Thị Kim Ngoan nghiên cứu vi khuẩn G Xylinus T9 nồng độ KH2PO4 (g/l) [14] 48 Hàm lượng KH2PO4 thích hợp cho quá trình tạo màng vi khuẩn G.xylinus AG7 (g/l) 3.3.4 Ảnh hưởng MgSO4.7H2O Magie mang tính chất cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến q trình phosphoryl hóa Ngồi magie giữ vai trò quan trọng việc làm liên kết tiểu phần riboxom với [11] Tiến hành khảo sát ảnh hưởng MgSO4.7H2O đến trình hình thành màng vi khuẩn G xylinus AG7 môi trường tảo xoắn nồng độ khác Sau ngày nuôi cấy điều kiện tĩnh thu kết bảng 3.10 : Bảng 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả tạo màng Biocellulose chủng G xylinus AG7 Hàm lượng MgSO4.7H2O (g/l) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,60 1,80 2,40 2,70 2,98 2,81 2,50 2,35 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,01 ± 0,01 Khối lượng tươi màng (g); X± m Đặc điểm màng Màng mỏng, dai Màng mỏng, dai, nhẵn Màng mỏng, (1,2 – 1,6 mm) dai Từ bảng 3.10 ta thấy MgSO4.7H2O hàm lượng 0,8 (g/l) cho khối lượng màng tươi phù hợp để phục vụ cho nghiên cứu Theo Đinh Thị Kim Nhung magie nhân tố tham gia vào việc tạo thành enzyme, enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa chất q trình hình thành màng Nếu lượng magie không đủ cung cấp cho việc tạo thành enzyme ảnh hưởng tới trình hình thành cellulose nên khối lượng màng thấp Ngược lại lượng magie cao gây ức chế cho q trình tạo màng [16] Vì tơi định sử dụng MgSO4.7H2O hàm lượng 0,8 (g/l) nghiên cứu Hàm lượng MgSO4.7H2O thích hợp cho trình lên men tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G.xylinus AG7 0,8 (g/l) 49 Nguồn dinh dưỡng thích hợp cho q trình tạo màng Biocellulose vi khuẩn G.xylinus AG7(g/l) gồm: glucose:12; (NH4)2SO4 : 1,5; KH2PO4: 1,0; MgSO4.7H2O : 0,8 3.4 Ảnh hưởng điều kiện môi trường tới khả tạo màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G xylinus AG7 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng mà định khả hình thành màng chủng G.xylinus AG7 Trong q trình ni cấy, nhiệt độ thấp vi khuẩn sinh trưởng chậm, thời gian nuôi cấy phải kéo dài làm giảm khả tổng hợp cellulose Nhiệt độ cao dẫn đến hô hấp mạnh, ảnh hưởng đến trình tổng hợp cellulose Để xác định nhiệt độ tốt cho lên men, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn G xylinus AG7 pH: tủ ấm Binder (Đức) với mức nhiệt độ khác nhau, thu hồi xác định trọng lượng thô màng sau ngày nuôi cấy Kết thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hình thành màng Biocellulose chủng G xylinus AG7 STT Nhiệt độ (0C) Đặc điểm màng Biocellulose X ±m δ 16± Hình thành màng chậm 20± 24± Màng mỏng, trong, dai, nhẵn 2,60 ±0,01 0,02 28± Màng mỏng, dai, nhẵn 2,83 ±0,015 0,03 32± Màng trong, mỏng, dai, nhẵn 2,89 ±0,01 0,02 36± Màng mỏng, trong, nhẵn 2,45±0,005 0,01 40± Hình thành màng chậm Sợi cellulose mảnh lơ lửng dung dịch 50 Hình 3.4 Màng thu 320C Từ kết bảng 3.10 cho thấy: Cũng loài sinh vật khác yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng lớn tới chủng G xylinus AG7 Trên thực tế vi khuẩn Gluconacetobacter đơn bào nên chúng mẫn cảm với biến hóa nhiệt độ thường bị biến hóa với biến hóa nhiệt độ môi trường xung quanh Một nhân tố định ảnh hưởng tới sinh trưởng vi khuẩn tính mẫn cảm với nhiệt độ phản ứng xúc tác nhờ enzyme Trong điều kiện nhiệt độ thấp 160C ± - 200C ± phản ứng xúc tác nhờ enzyme bị ngưng trệ diễn chậm chạp khiến vi khuẩn không sinh trưởng sinh trưởng chậm dẫn đến màng hình thành chậm tạo thành sợi cellulose lơ lửng dung dịch Khi nhiệt độ tăng lên làm tăng tốc độ sinh trưởng vi khuẩn, phản ứng xúc tác nhờ enzyme giống phản ứng hóa học nói chung, nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng thúc đẩy mạnh hơn, toàn hoạt động trao đổi chất tăng lên, vi khuẩn sinh trưởng nhanh cho khối lượng màng Biocellulose cao (24  10C: 2,60 ± 0,01 g; 28  10C: 2,83 ± 0,015 g; 32  10C: 2,89 ± 0,01 g; 36  10C: 2,45  0,005 g) Khi đến mức định nhiệt độ tăng vi khuẩn sinh trưởng hệ enzyme bị thay đổi hoạt tính nhiệt từ 420C trở lên màng Biocellulose khơng hình thành Mỗi chủng vi sinh vật có ngưỡng nhiệt phát triển khác nhau, chủng vi khuẩn G xylinus AG7 sinh trưởng tổng hợp cellulose thích hợp khoảng nhiệt độ 240C– 360C Khả hình thành màng cellulose lớn 32  10C Nhiệt độ 360C bắt đầu ức chế hoạt động tổng hợp Biocellulose nhiệt độ cao làm bay axit axetic tạo thành môi trường làm tăng pH dịch ni cấy ảnh hưởng tới q trình tạo màng Kết nghiên cứu 51 phù hợp với tác giả Neelobon S., Jiraporn B, Suwanncee T.,.(2007) 42 nhiệt độ thích hợp vi khuẩn Acetobacter xylinum sinh trưởng 300C Các tác giả Đặng Thị Hồng (2007),[4] hay Nguyễn Thị Thuỳ Vân (2009) 25 đưa nhiệt độ tối ưu cho chủng vi khuẩn 300C Nhiệt đợ thích hợp cho q trình lên men tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G xylinus AG7 320C ± 3.4.2 Ảnh hưởng pH Độ pH đo nồng độ ion H+ OH- có mơi trường, pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp gián tiếp đến tính chất sinh lí tế bào nên ảnh hưởng đến khả hình thành màng vi khuẩn G xylinus AG7 [18] Để xác định pH thích hợp cho tế bào sinh trưởng tạo màng, tiến hành ni cấy vi khuẩn mơi trường có giá trị pH khác 320C ngày Kết thu bảng 3.12: Bảng 3.12 Ảnh hưởng pH tới trình lên men tạo màng chủng G xylinus AG7 Độ pH Đặc điểm màng Bioceelulose X ±m δ 3,5 Màng mỏng, trong, nhẵn 2,00 ± 0,01 0,02 4,0 Màng mỏng, độ dai 2,42 ± 0,015 0,03 4,5 Màng mỏng, dai, nhẵn 2,61 ± 0,05 0,01 5,0 Màng mỏng, trong, nhẵn, dai 2,89 ± 0,01 0,02 5,5 Màng mỏng, trong, nhẵn, dai 2,83 ± 0,01 0,02 6,0 Màng mỏng, dai 2,42 ± 0,01 0,02 6,5 Màng mỏng, nhớt nhiều 1,58 ± 0,01 0,02 7,0 Màng hình thành chậm dễ tan 7,5 Màng khơng hình thành 52 Hình 3.5 Màng thu pH: Từ kết bảng 3.12 cho thấy: Tại giá trị pH khác lượng cellulose thu khác nhau, điều chứng tỏ pH yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp cellulose Gluconacetobacter Trong q trình lên men tạo màng vi khuẩn có khả sinh lượng axit định đủ làm trung hòa bớt nồng độ [OH-] đưa pH mơi trường ngưỡng thích hợp cho tạo màng Khi pH giá trị 5-5,5 lượng cellulose tạo ngang ( 2,89g ± 0,01; 2,83g± 0,01) màng có đặc tính dai, nhẵn Khi pH cao 5,5 lượng cellulose giảm (pH = 6: 2,42g ± 0,01; pH=6,5: 1,58g ± 0,01) Khi pH thấp tạo thành cellulose giảm Cụ thể (pH = 4,5: 2,61g ± 0,05; pH= 4: 2,42g ± 0,015; pH= 3,5: 2,00g ± 0,01) Mặt khác trình tổng hợp cellulose, oxi hóa glucose xảy cung cấp cho q trình trao đổi chất điện tử làm cho phần glucose dùng cho việc tạo thành cellulose giảm Các sản phẩm phụ tạo glucose bị oxi hóa số enzyme giải thích nguồn cacbon khác chủng vi sinh vật khác có hiệu suất sinh tổng hợp cellulose khác giá trị pH khác Chủng vi khuẩn G xylinus AG7 nuôi cấy môi trường dịch tảo xoắn vòng ngày giá trị pH: 7,0 màng hình thành chậm dễ tan; pH: 7,5 khơng xuất màng Ở giá trị lại pH: 3,5 – 6,5 màng tạo thành có độ dày khác Kết phù hợp với nghiên cứu Hong - Jon Son, Moon - Su Heo, Yong- Gyun Kim, Sang- Joon Lee năm 2001 [40] Đinh Thị Kim Nhung [16] xác định giá trị pH tối ưu 5,0 - 5,5 Vì để hạn chế tối đa 53 thay đổi nồng độ ion môi trường nuôi cấy định sử dụng pH: 5- 5,5 để nuôi cấy chủng G xylinus AG7 Đợ pH thích hợp cho q trình lên men tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G xylinus AG7 5- 5,5 3.5 Khảo sát khả tạo màng môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina Để tiến hành khảo sát khả tạo màng nguồn dinh dưỡng thích hợp cho q trình lên men tạo màng MT bổ sung tảo xoắn Spirulina chủng G xylinus AG7 môi trường lựa chọn (g/l): glucose: 12; (NH4)2SO4:1,5; KH2PO4: 1; MgSO4.7H2O: 0,8; nhiệt độ 320C ± 1; pH: 5- 5,5; (bột Tảo 20 (g/l); hàm lượng giống: 10% theo MT chuẩn MT3) Chúng lên men tạo màng nuôi điều kiện tĩnh theo dõi trình lên men từ ngày thứ ngày thứ sau thu kết bảng 3.13: Bảng 3.13 Khảo sát khả tạo màng môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina Ngày Quan sát đặc điểm màng Khối lượng màng ( X ± m) δ Chưa thấy màng xuất Màng bắt đầu xuất 0,13 ± 0,008 0,016 Màng mỏng, dai 2,10 ± 0,012 0,024 Màng mỏng, trong, dai 2,81 ± 0,015 0,03 Màng mỏng, trong, dai, nhẵn 2,85 ± 0,019 0,038 Màng mỏng, đục, dai, nhẵn 2,85 ± 0,012 0,024 Màng mỏng, đục, dai, 2,85 ± 0,011 0,022 Tiến hành thí nghiệm đánh giá khả tạo màng môi trường lựa chọn Sau ngày nuôi cấy tiến hành thu màng kiểm tra chất lượng màng Biocellulose thấy chất lượng màng tốt (mỏng, dai, nhẵn), ngày thứ chất lượng màng cao phù hợp với việc làm mặt nạ dưỡng da Những ngày số lượng vi khuẩn G xylinus AG7 giảm nhiều số lượng vi khuẩn G xylinus AG7 sinh làm cho tổng vi khuẩn dịch nuôi cấy giảm nhanh giảm nhanh chóng 54 nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, sản phẩm độc sản sinh trình trao đổi chất tăng Trong trình sinh trưởng, G.xylinus AG7 tích luỹ lượng axit axetic định dịch lên men làm cho giá trị pH môi trường giảm dần theo thời gian 22 Do màng Biocellulose tạo thành nhiều thành phần dư mơi trường bám vào nên mục đích trình xử lý màng loại bớt sản phẩm dư (thành phần đường dư), giảm độ pH, làm khuẩn đồng thời phần giúp màng đạt hiệu mặt cảm quan: màu trắng trong, dai bền hơn… Màng Biocellulose lên men cần xử lý đơn giản, hiệu tốn Màng Biocellulose thu trực tiếp từ dịch nuôi cấy qua bước xử lý bảng 3.14 sau: Bảng 3.14 Các bước xử lý màng Biocellulose STT Cách xử lý Rửa nước máy lần Đun với NaOH 0,5% 1000C thời gian 30 phút Trung hoà nước chanh loãng Kết Loại bỏ bớt axit axetic Màu sắc màng: vàng, khét Màu sắc màng từ vàng sậm chuyển sang trắng Ngâm với NaOH 0,5N nhiệt độ Màng phòng Trung hồ lại nước chanh lỗng Biocellulose trắng trong, khơng mùi đạt cảm quan Màng Biocellulose trắng Sau thu màng sấy màng nhiệt độ 450C khoảng để làm bớt nước có màng Nhìn chung, thời gian để sấy màng phụ thuộc nhiều vào độ dày màng, nên sấy màng nhiệt độ 450C đến 500C để màng nước chậm, giúp tăng tính dẻo dai màng, sấy màng nhiệt độ cao màng bị giòn, giảm tính dẻo dai Qua khảo sát khả tạo màng Biocellulose môi trường bổ sung tảo xoắn Arthrospira platensis (Spirulina) chủng vi khuẩn G.xylinus AG7 ổn định thu màng ngày thứ 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Phân lập 12 chủng vi khuẩn giấm từ môi trường bổ sung tảo xoắn Arthrospira platensis (Spirulina) sơ tuyển chủng AG4, AG6, AG7 AG8 thuộc chi Gluconacetobacter, họ Acetobacteriaceae Căn vào khả tạo màng mỏng, dai nhẵn, thời gian hình thành màng ngắn độ bền học, lựa chọn chủng G xylinus AG7 làm đối tượng nghiên cứu 1.2 Xác định động thái sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn G.xylinus AG7: Pha tiềm phát diễn từ bắt đầu nuôi cấy đến 24h, pha cấp số mũ từ 24- 48h, pha cân động từ 48h- 72h, pha suy vong từ 72h trở 1.3 Nguồn dinh dưỡng điều kiện thích hợp cho trình tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G.xylinus AG7 (g/l) : glucose:12; (NH4)2SO4:1,5; KH2PO4:1,0; MgSO4.7H2O : 0,8, pH: 5- 5,5 nhiệt độ 32 ± 10C 1.4 Đã tiến hành khảo sát khả tạo màng môi trường bổ sung tảo xoắn Arthrospira platensis (Spirulina) cho chủng vi khuẩn G.xylinus AG7 ổn định thu màng ngày thứ Kiến nghị Do giới hạn thời gian điều kiện làm thí nghiệm nên đề tài nhiều hạn chế Nếu tiếp tục nghiên cứu với điều kiện tốt hơn, xin đề nghị số ý kiến sau: Nghiên cứu tỉ lệ S/V cho chủng vi khuẩn G.xylinus AG7, tiến hành sản xuất màng quy mô pilot để ứng dụng vào công nghiệp 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Tạ Thị Mai Anh, Nguyễn Thị Lan, Vũ Văn Khoan, Đào Văn Kiên, Nguyễn Thị Thùy Vân, Đinh Thị Kim Nhung (2010) Nghiên cứu phương pháp xử lý màng BC ứng dụng điều trị bỏng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 Kỷ yếu Hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học Các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ V, năm 2010 Đại học Đồng Tháp, Bộ Giáo dục và Đào tạo [2] Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1- 2- 3, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội [3] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb giáo dục, tr 17-34, 63-74, 89-92 [4] Đặng Thị Hồng (2007) Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội [5] Đặng Thị Hồng, Đinh Thị Kim Nhung.(2007) Tuyển chọn chủng Acetobacter xylinum tạo màng sinh học (BC) Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Hội nghị khoa học toàn quốc lần Qui Nhơn 2007, trang 728-731 [6] Đặng Đình Kim, Đặng Hồng Phước Hiền (1999), Công nghệ sinh học vi tảo, Nxb Nông nghiệp [7] Lô Thị Bảo Khánh, Đào Thị Nữ, Phạm Thị Quyên, Hoàng Thị Thảo, Đinh Thị Kim Nhung (2008) Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng Acetobacter xylinum G6, chế tạo màng BC Kỷ yếu Hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học Các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ IV, năm 2008 Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường ĐHSP- Đại học Huế, Nxb Đại học Huế, trang 224-230 [8] Lô Thị Bảo Khánh, Đinh Thị Kim Nhung, Dương Minh Lam.( 2011) Nghiên cứu xử lý bảo quản màng Bacterial cellulose (BC) từ chủng vi khuẩn 57 Acetobacter xylinum BHN2 Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ sinh thái tài nguyên sinh vật Hà Nội, ngày 21/10/2011, trang 1181-1184 [9] Lô Thị Bảo Khánh, (2011) Nghiên cứu xử lý bảo quản màng Bacterial Cellulose từ chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội [10] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh.(2006) Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí dược học, số 5, năm 2006 [11] Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ Vi sinh vật tập 1-2-3, Nxb Đại học Quốc Gia TP.HCM [12] Trần Thị Mai, Nguyễn Thị An, Nguyễn Thị Ngọc Mai, Đoàn Thị Thủy, Bùi Thị Thủy, Đinh Thị Kim Nhung (2012) Nghiên cứu khả tạo màng BC cho chủng Gluconacetobacter phương pháp gây đột biến tia UV Kỷ yếu toàn văn Hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học Các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ VI, năm 2012 Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường ĐHSP Hà nội 2, Nxb Đại học Sư Phạm Hà Nội, trang 590-597 [13] Lê Năm, Lâm Thị Đan Chi, Chu Anh Tuấn, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2010) Tác dụng điều trị chỗ vết thương bỏng nông màng Acetul Tạp chí Y học thảm họa bỏng, số 4, 2010, trang 77-137 [14] Nguyễn Thị Kim Ngoan (2016), Ảnh hưởng số nhân tố sinh thái tới trình tạo màng Biocellulose môi trường Tảo xoắn Spirulina Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường ĐHSP Hà nội [15] Nguyễn Thị Nguyệt (2008), Nghiên cứu vi khuẩ Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Luận văn Thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội [16] Đinh Thị Kim Nhung (1996) Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men acid acetic theo phương pháp chìm Luận án Tiến sỹ Sinh học Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 58 [17] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân (2010) Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetorbacter xylinum phân lập từ số nguồn nguyên liệu Việt Nam Tạp chí thơng tin Y dược-Bợ Y tế , trang 62-65 [18] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Hoàng Thị Thảo (2011), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetorbacter xylinum sinh tổng hợp màng Bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, Tạp chí Y học thảm họa bỏng Viện bỏng Quốc Gia, Hội bỏng Việt Nam, trang 122-127 [19] Đinh Thị Kim Nhung, Trần Thị Mai, Phạm Thị Hương, Đỗ Thị Nga, (2012) Nghiên cứu số đặc tính màng BC tạo từ chủng Bacterial cellulose Kỷ yếu Hội nghị khoa học trẻ lần thứ VII năm 2012 Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường ĐHSP Hà nội 2, Nxb ĐH Sư Phạm, trang 193-198 [20] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân (2012) Tối ưu hóa điều kiện ni cấy cho vi khuẩn Acetobacter xylinum D9 Tạp chí sinh học 2012, 34(3) trang 337 - 342 [21] Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp [22] Nguyen Van Thanh et al (2005), Study on preparation bacterial cellulose from Acetobacter xylinum for treating burns and wounds, Proceedings of the 4-th Indochina Conf on Pharmaceutical Sciences, Nov 10-13, Univ of Medicine and Pharmacy of HCM City, Vietnam [23] Trần Linh Thước (2006) Phương pháp phân tích vi sinh vật Nxb giáo dục, trang 1- 29, 40- 69 [24] Lê Thế Trung (1997) Bỏng - kiến thức chuyên ngành Nxb y học Hà Nội, tr 21 -109, 206 -209, 297 - 310, 453 - 482 [25] Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), Nghiên cứu đặc tính sinh học khả tạo màng Bacterial cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ một số nguồn nguyên liệu Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ khoa học sinh học, trường ĐHSP Hà Nội 59 Tài liệu nước [26] Alaban C.A (1967), Studies on the optimum conditions for ‘nata de coco’ bacterium or ‘nata’ formation in coconut water, The Philippnie Agriculturist, v.45 p 490-515 [27] Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) Polysaccharides and polyamides in the food industry, www.wiley.vch pp 31-85 [28] Blanc, P J (1996) Characterization of the tea fungus metabolites.Biotechnol Lett 18, 139–142 (3) [29] Boesch, C., Trček, J., Sievers, M & Teuber, M (1998) Acetobacter intermedius sp nov Syst Appl Microbiol 21, 220–229 [30] Brown R.M (1999), Cellulose structure and biosynthesis, Pure Appl Chem (5), p 765-775 (5) [31] Brown R.M., Cousins S.K., Krystyna Kudlicka (1992), “Gravity effects on cellulose assembly”, American journal of botany 70 (11), pp 1247 - 1258 [32] Bworn E (2007) Bacterial cellulose Thermoplastic polymer nanocomposites Master of science in chemical engineering, Washington state university [33] Ben- Hayyim G, Ohad I, Ph.D Synthesis of cellulose by Acetobacterxylinum: VIII On the formation and oriention of bacterial cellulose fibril in the presence of acidic polysaccharides, (1965) Vol 25, The Journal of Cell Biology [34] Bergey H, John G Holt.( 1992) Bergey’s manual of dererminativa bacteriology Wolters kluwer health, p.71- 84 [35] Canon, R.E and Anderson, S.M (1991), “Biogenesis of Bacterial cellulose”, Critical Reviews in Microbiology, Vol 17, pp 435 – 447 [36] Chao Y., Ishida T., Sugano Y., Shoda M (2000), Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum in a 50 L internal-loop airlift reactor, Biotechnol Bioeng 68 (3), p 345-352 [37] Dieter K, Dieter S ,Ulrike U (2001) Bacterial synthesized cellulose- artificial blood vessels for microsurgery Vol 26, Inssue 9, Progress in polymer science, 2001, p 1561-1603 60 [38] Frateur J (1950), Essai sur la systématique des Acétobacter, La cellule, Vol 53, pp 278-398 [39] Haigler C.H., Chanzy H (1988), Elecrton diffraction analysis of the altered cellulose synthesized by Acetobacter xylinum in the presence of fluorescent brightening agents and direct dyes, Ultrastruct Mol Struct Res 98, p 299-311 [40] Hong - Jon Son, Moon - Su Heo, Yong- Gyun Kim, Sang- Joon Lee (2001) Optimization of fermetation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp A9 in shaking cultures Vol 33, Biotechnol.Appl Biochem, 2001, p 1-5 [41] Kouda T., Yano H., Yoshinaga F (1997), Effect of agitator configuration on bacterial cellulose productivity in aerated and agitated culture, Ferment Bioeng 83, p 371-376 [42] Neelobon S., Jiraporn B, Suwanncee T.,.(2007) “Effect of culture conditions on bacterial cellulosee (BC) production from Acetobacter xylinum TISTR976 o and physical properties of BC parchment paper”, Vol 14, N 4, Suranaree J.Sci Technol, 2007, p 357- 365 [43] Wojciech K Czaja, David J Young, Marek Kawecki, Malcolm Brown R, Jr.(2007) The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications Vol.8, No.1 Biomacromolecules, 2007, p.1-12 [44] ZipporaGromet-Elhanan, ShlomoHestrin, (1996), Synthesis of cellulose of o Acetobacter xylinum, VI Vol 85, N 2, JBacteriol Tài liệu mạng [45] https://taospirulina.wordpress.com/2013/03/27/tao-spirulina-tong-quan-vetao-xoan-spirulina/ [46] http://japanhealthylife.com/tin-tuc/tao-spirulina-phan-2-thanh-phan-hoa-hocva-dac-diem-sinh-hoc [47] http://www.taoxoantuoi.com.vn/2014/10/tao-xoan-spirulina-la-gi-tao-mattroi.html [48] http://luanvan.net.vn/luan-van/de-tai-protein-trong-tao-va-ung-dung-trongcong-nghiep-47668/ ... màng mỏng dai, sau tuyển chọn chủng cần nghiên cứu trình bổ sung tảo xoắn chủng vi khuẩn tuyển chọn Chính tơi định chọn đề tài Nghiên cứu trình tạo màng Biocellulose môi trường bổ sung tảo xoắn. .. mía, nước vo gạo Các loại môi trường bước đầu nghiên cứu Nghiên cứu Nguyễn Thị Kim Ngoan (2016) môi trường bổ sung tảo xoắn tạo sản phẩm màng từ dịch tảo xoắn màng tạo dày chưa khảo sát đặc tính... khả tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G xylinus AG7 môi trường bổ sung tảo xoắn Spirunina - Ảnh hưởng điều kiện môi trường tới khả tạo màng chủng vi khuẩn G xylinus AG7 môi trường bổ sung tảo