Nghiên cứu quá trình lên men axit gluconic từ rỉ đường bằng Aspergillus niger

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHẠM THỊ THÙY TRANG NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT GLUCONIC TỪ RỈ ĐƯỜNG BẰNG ASPERGILLUS NIGER Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Đồ uống Mã số: 60.54.02 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đặng Minh Nhật Phản biện 1: GS TS Đào Hùng Cường Phản biện 2: PGS TS Lê Thị Liên Thanh Luận văn ñược bảo vệ trước Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ kỹ thuật họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 17 tháng 11 năm 2012 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Có thể tìm hiểu luận văn tại: − Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng Đà Nẵng, Năm 2012 Footer Page of 126 − Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng Header Page of 126 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trên giới, nghiên cứu sản xuất axit gluconic ngày ñược quan tâm mạnh mẽ, glucose ñược sử dụng nguồn cacbon cho Axit gluconic axit hữu yếu, ñược phát lần ñầu hầu hết loài vi sinh vật sản xuất axit gluconic, nhiên ñể tạo tiên vào năm 1870 Hasiwetz Habermann Axit gluconic sản phẩm thương mại vừa ñảm bảo chất lượng vừa ñảm bảo hiệu muối gluconat có tự nhiên phổ biến ñược hình thành kinh tế cao nguyên liệu ñóng vai trò ñặc biệt quan trọng, từ trình oxy hóa glucose Vào kỷ thứ 18, axit ñược biết nguồn nguyên liệu ñáp ứng yếu tố rỉ ñến, nhiên ngày axit gluconic ñang ñược ứng dụng rộng rãi ñường, với ưu ñiểm chứa 48-56% ñường tổng số, ñó nguồn cacbon nhiều lĩnh vực công nghệ hóa học, thực phẩm, dược phẩm, rẻ tiền, rỉ ñường lựa chọn hàng ñầu nhà nghiên dệt, luyện kim, thuộc da, vật liệu xây dựng nhiều ngành công cứu sản xuất axit gluconic nghiệp khác Hằng năm giới sản xuất khoảng 50.000-100.000 Theo báo cáo Hiệp hội mía ñường Việt Nam nước có axit gluconic tổng tất loại muối gluconat khoảng khoảng 40 nhà máy sản xuất ñường, với tổng công suất 105.750 65.000-100.000 tấn, ñó gồm loại muối natri gluconat, mía/ngày, bình quân ñạt khoảng 2.500 mía/ngày/nhà máy, lượng kali gluconat, canxi gluconat hay este glucono-δ-lacton rỉ ñường tạo chiếm 3-5% trọng lượng ép, tổng khối lượng rỉ phụ gia thực phẩm ñược chứng nhận an toàn sử dụng ñường nước lớn, khoảng 3-5 tấn/ngày Rỉ ñường mía Mỹ Châu Âu (theo Cục Quản Lý Thực Phẩm Dược Phẩm Hoa ñược dùng làm nguyên liệu công nghiệp lên men ñể sản xuất Kỳ), ñược sử dụng làm chất ñiều vị, phụ gia sản xuất bánh rượu, cồn, dung môi axeton, sinh khối nấm men, axit xitric, axit nướng, sữa ñậu nành, sữa chua, phomat, bánh mỳ lactic glyxerin, phần ñược dùng làm thức ăn gia súc Sản xuất axit gluconic ñường vi sinh ñã ñược nghiên Hiện nay, Việt Nam chưa có sở sản xuất axit cứu ứng dụng rộng rãi nhiều thập kỷ qua, ñó trình gluconic, tất axit gluconic có ñều phải nhập từ nước với lên men Aspergillus niger (A niger) ñược nghiên cứu sử dụng giá thành cao Vì vậy, việc sử dụng axit ngành công nhiều A niger phổ biến tự nhiên tìm thấy nghiệp nước ta gặp khó khăn mặt giá thành chúng khô, thảm thực vật mục nát, ñất, trồng A niger có tốc ñộ sinh ta không chủ ñộng ñược nguồn cung cấp trưởng phát triển nhanh, dễ dàng phân lập ñiều kiện thông Xuất phát từ vấn ñề trên, thực ñề tài thường, phòng thí nghiệm Do khả sinh tổng hợp enzym "Nghiên cứu trình lên men axit gluconic từ rỉ ñường cao nên A niger ñược dùng rộng rãi công nghiệp thực phẩm ñể Aspergillus niger", nhằm khảo sát ñiều kiện lên men thích hợp thu nhận chế phẩm enzyme amylase, protease, pectinase, cho trình sinh tổng hợp axit gluconic glucose oxydase,… axit hữu axit xitric, axit gluconic, axit fumaric, Footer Page of 126 Đề tài mở thêm hướng triển vọng cho việc thu nhận axit gluconic từ phụ phẩm trình sản xuất, không Header Page of 126 có ý nghĩa kinh tế mà mở khả giải vấn - Phương pháp toán học: ñề chất lượng sản phẩm, vấn ñề giải pháp kỹ thuật cách Sử dụng quy hoạch thực nghiệm toàn phần yếu tố ñể khảo sát ảnh hưởng yếu tố thành phần ñến hàm lượng axit gluconic hiệu Sử dụng phương pháp leo dốc ñể tối ưu hóa yếu tố ảnh MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác ñịnh thông số công nghệ tốt như: tỉ lệ giống, thời gian lên men, hàm lượng nitơ bổ sung trình lên men - Đề xuất quy trình kỹ thuật lên men axit gluconic từ rỉ ñường chủng nấm mốc A niger ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Sử dụng rỉ ñường ñược thu nhận công ty Đường Kon Tum Km 2, xã Vinh Quang, Thành phố Kon Tum, tỉnh Kon Tum - Chủng nấm mốc A niger phòng thí nghiệm khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng - Nghiên cứu lên men axit gluconic từ rỉ ñường chủng hưởng Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Xác ñịnh số thành phần hóa học rỉ ñường hàm lượng axit gluconic phương pháp (PP) phân tích ñại - Xác ñịnh ñiều kiện lên men tốt thu ñược hàm lượng axit gluconic cao - Xây dựng ñược quy trình lên men gluconic từ rỉ ñường quy mô PTN Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Nghiên cứu ñã giúp sử dụng phế phẩm trình nấm mốc A niger qui mô phòng thí nghiệm (PTN) sản xuất ñường tạo nguồn nguyên liệu sản xuất axit PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU gluconic, mang lại lợi ích kinh tế cho nhà sản xuất ñường - Phương pháp vật lý: Xác ñịnh nồng ñộ chất khô Bx kế - Phương pháp hóa học: Xác ñịnh hàm lượng ñường khử phương pháp Bectran Xác ñịnh hàm lượng nitơ tổng phương pháp kjehldal - Phương pháp hóa lý: Xác ñịnh pH rỉ ñường pH môi trường nuôi cấy trước sau lên men Xác ñịnh axit gluconic máy sắc ký lỏng hiệu - Phương pháp vi sinh: Phương pháp hoạt hóa giống Phương pháp lên men chìm Footer Page of 126 - Giảm lượng axit gluconic ngoại nhập, chủ ñộng sản xuất - Mở rộng ứng dụng công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm số lĩnh vực khác CẤU TRÚC LUẬN VĂN Ngoài phần mở ñầu, kết luận, tài liệu tham khảo phụ lục, luận văn gồm có chương sau : Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Header Page of 126 CHƯƠNG TỔNG QUAN Axit gluconic có cấu trúc hoá học bao gồm chuỗi sáu cacbon với năm nhóm hydroxyl kết thúc nhóm chức 1.1 AXIT GLUCONIC cacboxyl (-COOH) Trong dung dịch nước nồng ñộ 1/1000 axit 1.1.1 Giới thiệu axit gluconic cacboxylic pH gần trung tính, axit cacboxylic tạo ion Axit gluconic axit hữu yếu, có tính sát khuẩn, gluconat muối axit gluconic gọi chung gluconat không bay hơi, không ñộc, tính ăn mòn, có nguồn gốc từ β- Khi hòa tan nước axit nhanh chóng chuyển sang trạng thái cân D-glucose tạo thành phản ứng oxy hóa xúc tác ñộng với vòng glucono-δ-lacton, làm cho dung dịch trở thành enzym glucose oxidase Axit gluconic có mặt tự nhiên loại hỗn hợp axit với glucono-δ-lacton quả, mật ong, trà kombucha (nấm hồng trà) rượu vang 1.1.3 Tính chất axit gluconic muối gluconat Trong công nghiệp thực phẩm axit gluconic ñược sử dụng 1.1.4 Lịch sử phát triển axit gluconic chất ñiều vị, có khả tạo hương vị chua dịu nhẹ 1.1.5 Ứng dụng axit gluconic muối gluconat ñược sử dụng phụ gia ñiều chỉnh vị chua (E574) dùng cho 1.1.6 Sản xuất axit gluconic muối gluconat sản phẩm rượu vang, nước ép trái cây, sữa chua,.… 1.1.6.1 Sản xuất axit gluconic từ enzyme glucose oxidase Tên khoa học: 1.1.6.2 Sản xuất axit gluconic từ vi khuẩn (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahyñroxyhexanoic axit 1.1.6.3 Sản xuất axit gluconic từ A niger Penicillium luteum 1.1.2 Cấu tạo axit gluconic Axit gluconic hợp chất hữu có công thức phân tử C6H12O7, công thức cấu tạo là: Axit gluconic C6H12O6 + H2O + O2 → C6H12O7 + H2O2 Hình 1.1 Cấu tạo phân tử axit gluconic Footer Page of 126 Hình 1.2 Sơ ñồ chuyển hóa glucose thành axit gluconic A niger Header Page of 126 10 1.2 CƠ SỞ QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT GLUCONIC 1.2.1 Giới thiệu Aspergillus niger CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2.2 Các phương pháp lên men 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.2.2.1 Phương pháp lên men bề mặt 2.1.1 Rỉ ñường 1.2.2.2 Phương pháp lên men bề sâu Rỉ ñường lấy từ công ty Đường Kon Tum ñược xử lý 1.2.3 Sự sinh trưởng phát triển vi sinh vật ñiều kiện phòng thí nghiệm trước lên men Rỉ ñường ñược pha loãng nuôi cấy tĩnh với tỷ lệ rỉ ñường:nước 2:1 kg/kg, tiến hành xử lý nhiệt 85-90oC 1.2.3.1 Pha mở ñầu (pha tiềm phát) thời gian 45-60 phút, ñiều kiện hầu hết tạp khuẩn ñều 1.2.3.2 Pha logarit (pha lũy tiến) bị tiêu diệt Sau xử lý nhiệt tiến hành ly tâm nguyên liệu 8oC, tốc 1.2.3.3 Pha ổn ñịnh (pha cân bằng) ñộ 5500 vòng/phút, thời gian 30 phút, tách chất không hòa tan 1.2.3.4 Pha tử vong chất keo khỏi rỉ ñường Kết thúc trình xử lý rỉ ñường ñược 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng ñến trình lên men axit gluconic bảo quản 4oC 1.2.4.1 Ảnh hưởng cacbon 2.1.2 Chủng vi sinh vật 1.2.4.2 Ảnh hưởng nitơ Chủng nấm mốc A niger ñược nuôi cấy giữ giống 1.2.4.3 Ảnh hưởng thời gian PTN khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng 1.2.4.4 Ảnh hưởng oxy 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 1.2.4.5 Ảnh hưởng nhiệt ñộ 2.2.1 Hóa chất 1.2.4.6 Ảnh hưởng PH 2.2.2 Thiết bị 1.2.4.7 Ảnh hưởng tỷ lệ giống 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3 NGUYÊN LIỆU RỈ ĐƯỜNG 2.3.1 Phương pháp vật lý 1.3.1 Giới thiệu nguyên liệu rỉ ñường 2.3.2 Phương pháp hóa lý 1.3.2 Mục ñích xử lý rỉ ñường trước lên men 2.3.3 Phương pháp hóa học 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AXIT GLUCONIC Ở VIỆT 2.3.4 Phương pháp vi sinh NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 2.3.5 Phương pháp toán học 1.4.1 Các công trình nghiên cứu nước 1.4.2 Các công trình nghiên cứu nước Footer Page of 126 Header Page of 126 11 12 CHƯƠNG (g/100ml) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RỈ ĐƯỜNG Sắc ký ñồ Bảng 3.1 Kết khảo sát thành phần hóa học rỉ ñường Thành phần Giá trị Bx 84.41 Như vậy, ñiều kiện có cố ñịnh nấm mốc lên men axit pH 5.40 gluconic máy lắc, cản trở chất mang oxy khó hòa tan, 3.64 (% chất khô) trình lên men diễn chậm, thời gian lên men kéo dài tạo sản Đường khử 22.70 (% khối lượng) phẩm phụ Lên men môi trường lỏng máy lắc tạo ñiều kiện Đường tổng 54.50 (% khối lượng) cho oxy tiếp xúc chất, trình lên men diễn toàn khối Đường saccarose 30.21 (% khối lượng) dịch lên men, thời gian lên men ngắn, hiệu suất lên men cao Từ kết Protein 3.2 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN trên, lựa chọn phương pháp lên men môi trường AXIT GLUCONIC lỏng máy lắc làm phương pháp nghiên cứu Bảng 3.2 Kết nghiên cứu lựa chọn phương pháp lên men axit gluconic 3.3 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH Thông số Chuẩn bị lên men Xử lý sau lên men Phương pháp cố ñịnh nấm mốc A niger Phương pháp HÀM LƯỢNG AXIT GLUCONIC BẰNG MÁY HPLC không cố ñịnh 3.3.1 Nghiên cứu xây dựng ñường chuẩn HPLC cho axit gluconic nấm mốc A niger 3.3.1.1 Nghiên cứu tỷ lệ pha ñộng cố ñịnh pH mẫu phân tích 7.0 Xử lý xơ dừa, cố ñịnh Hoạt hóa nấm mốc nấm mốc 20 máy lắc 20 ñiều kiện tĩnh Lọc ép chân không Vdịch lên men (ml/100ml) Chiều cao peak (mAU) Axit gluconic Footer Page of 126 50 ml Lọc tách bã Bảng 3.3 Nghiên cứu tỷ lệ pha ñộng cố ñịnh pH mẫu phân tích 7.0 Tên quy pH mẫu Tỷ lệ pha ñộng Đồ thị ñịnh tính trình phân tích 75 ml 266.95 2.53 Acetonitrile:nước pH = 7.0 3:7 (v/v) Acetonitrile:nước pH = 7.0 7:3 (v/v) 380.26 3.59 Acetonitrile 100% pH = 7.0 Header Page of 126 13 14 Dựa vào kết phân tích cho thấy sắc ký ñồ có hình dạng 3.3.1.3 Nghiên cứu pH pha ñộng cố ñịnh pH mẫu phân tích 2.5 phức tạp Khi sử dụng NaOH tinh khiết ñể ñiều chỉnh pH mẫu phân Chúng tiến hành ñiều chỉnh pH pha ñộng 2.5, cách tích 7.0, lúc mẫu phân tích tồn hợp chất (axit gluconic, bổ sung H3PO4 vào nước pha ñộng tỷ lệ axit H3PO4:nước (1:1000 glucono-δ-lacton, muối gluconat), ñó dung dịch tồn hỗ v/v), tỷ lệ pha ñộng acetonitrile:nước (3:7 v/v) Trong ñiều kiện biến dạng ñồng phân Thay ñổi tỷ lệ pha ñộng làm thay xuất peak Như vậy, môi trường H+ ñổi chuyển hóa chất, chất tồn nhiều cho hình glucono-δ-lacton mở vòng chuyển hóa axit gluconic, lúc dung dạng peak cao Kết sắc ký ñồ tồn nhiều peak phức tạp dịch ñi qua cột axit gluconic ñồng nhất, sắc ký ñồ cho 3.3.1.2 Nghiên cứu tỷ lệ pha ñộng cố ñịnh pH mẫu phân tích 2.5 peak Kết nghiên cứu thể bảng 3.5 Bảng 3.4 Nghiên cứu tỷ lệ pha ñộng cố ñịnh pH mẫu phân tích 2.5 Tên quy trình phân tích Acetonitrile:nước Đồ thị ñịnh tính pH = 2.5 3:7 (v/v) Acetonitrile:nước Đồ thị ñịnh tính Cơ chế chuyển hóa glucono-δ δ-lacton thành axit gluconic pH = 2.5 7:3 (v/v) Acetonitrile pH mẫu Tỷ lệ pha ñộng Bảng 3.5 Nghiên cứu pH pha ñộng cố ñịnh pH mẫu phân tích 2.5 pH = 2.5 100% Như vậy, xây dựng ñược quy trình phân tích axit gluconic sau pha tĩnh cột C18, tốc ñộ dòng 0.5 ml/phút, bước sóng 210 nm, tỷ lệ pha ñộng: acetonitrile:nước (3:7 v/v), pHnước = 2.5 Khi cố ñịnh pH mẫu phân tích 2.5 mặt lý thuyết axit 3.3.1.4 Xây dựng ñường chuẩn axit gluconic gluconic tồn dạng mạch thẳng Tuy nhiên, pha ñộng có pH trung tính, hiệu pha loãng pha ñộng ảnh hưởng lớn ñến pH mẫu ñi qua cột làm tái xác lập cân dạng ñồng phân Axit gluconic nhanh chóng chuyển sang trạng thái cân với vòng glucono-δ-lacton Khi thay ñổi tỷ lệ pha ñộng làm thay ñổi tỷ lệ axit gluconic glucono-δ-lacton Khi mẫu qua cột sắc ký ñồ xuất peak tương ñối rõ Hình 3.1 Đường chuẩn axit gluconic Footer Page of 126 Header Page of 126 15 16 Phương trình ñường chuẩn axit gluconic: y = 212,6.x - 2,032 (3.1) Trong ñó: y: Chiều cao peak (mAU) 3.4.1 Xác ñịnh số lượng bào tử trước hoạt hóa giống Chúng sử dụng buồng ñếm hồng cầu ñếm bào tử nấm Sau xác ñịnh mật ñộ bào tử nấm mốc ñạt 106-107 bào tử/ml, x: Nồng ñộ axit gluconic (g/l) 3.3.2 Nghiên cứu xử lý dịch lên men thu nhận axit gluconic tiến hành lắc liên tục máy lắc ñể ñảm bảo huyền phù 3.3.2.1 Nghiên cứu xử lý dịch lên men ñịnh lượng axit gluconic ñồng nhất, sau ñó giống ñược chuyền vào môi trường hoạt hóa Dịch sau lên men gồm axit gluconic tự do, canxi gluconat, 3.4.2 Ảnh hưởng tỉ lệ giống ñến hàm lượng axit gluconic nấm mốc, khoáng dư, sản phẩm phụ khác Kết thúc trình lên men, nâng nhiệt ñộ ñến 90oC nồi cách thủy Sau ñó tiến hành lọc, loại bỏ bã, tế bào chết thu hồi dịch Dịch sau lọc kết tủa canxi gluconat cồn 96o, sau ñó lọc ñể thu kết tủa canxi gluconat, hòa tan kết tủa giấy lọc H2SO4 0.2 M, lọc tách bỏ CaSO4, dung dịch axit gluconic thu ñược ñịnh lượng máy HPLC 3.3.2.2 Nghiên cứu kết tủa canxi gluconat cồn 96o Bảng 3.6 Khảo sát tỷ lệ cồn 96o thích kết tủa canxi gluconat Dịch lên 5:1 5:2 5:3 5:4 5:5 5:6 5:7 men: cồn (v/v) mcanxi gluconat (g/l) 26.0 30.4 34.7 38.5 39.0 40.2 40.2 Như vậy, kết tủa canxi gluconat cồn 96o cho kết tốt với tỷ lệ 5:6 (dịch sau lên men:cồn v/v), 10 Bảng 3.7 Khảo sát thời gian kết tủa canxi gluconat cồn 96o Thời gian kết tủa (h) mcanxi gluconat (g/l) 16,5 21.3 34,9 38.2 10 12 40.5 40.5 Sau 10 kết tủa canxi gluconat cồn 96o, thu Hình 3.4 Ảnh hưởng tỉ lệ giống ñến hàm lượng axit gluconic Đồ thị hình 3.4 cho thấy ban ñầu tỷ lệ giống tăng dần, hàm lượng axit gluconic sinh tăng Tuy nhiên, tỉ lệ giống cao hàm lượng axit gluconic giảm Khi tỷ lệ giống so với lượng chất lượng enzyme sinh Do ñó, thời gian lên men kéo dài, tốn lượng, hiệu kinh tế không cao tạo sản phẩm phụ không mong muốn rượu, andehyt,… Ban ñầu bổ sung lượng giống cao, xảy cạnh tranh dinh dưỡng, làm tiêu hao ñược kết tối ưu 40,5 (g/l) lượng lớn chất cho trình tăng sinh khối Do ñó, hiệu 3.4 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN chuyển hóa chất thành axit gluconic không cao Đồng thời, nguồn HÀM LƯỢNG AXIT GLUCONIC TẠO THÀNH TRONG QUÁ dinh dưỡng nghèo ñi dẫn ñến lượng axit gluconic tạo thành TRÌNH LÊN MEN Footer Page of 126 Header Page of 126 17 18 giảm Kết tỷ lệ giống bổ sung 10% với mật ñộ bào tử 106-107 3.4.4 Ảnh hưởng hàm lượng nitơ bổ sung ñến hàm lượng bào tử/ml thu ñược kết tốt 30.24 g/100g mật rỉ axit gluconic 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit gluconic Hình 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng nitơ bổ sung Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit gluconic ñến hàm lượng axit gluconic Qua quan sát hình 3.5 cho thấy ban ñầu thời gian lên men Qua nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng nitơ bổ sung ñến tăng, hàm lượng axit gluconic sinh tăng, thời gian lên men kéo hàm lượng axit gluconic tạo thành, dựa vào ñồ thị hình 3.6 cho thấy dài hàm lượng axit gluconic giảm Thời gian ñầu nấm mốc sử dụng nguồn nitơ có sẵn nguyên liệu không ñảm bảo cho trình chất ñể tăng sinh khối, ñồng thời tiết enzyme ñể chuyển hóa sinh trưởng phát triển vi sinh vật Trong giai ñoạn ñầu hàm chất Khi lượng tế bào lớn lượng enzyme tiết nhiều, lượng nitơ bổ sung tăng hàm lượng axit tăng lên rõ rệt, ñạt giá trị cao lượng axit gluconic sinh tăng theo thời gian Ở thời ñiểm 96 29.18 g/100g mật rỉ với hàm lượng (NH4)2HPO4 g/l Tiếp tục quần thể vi sinh vật bước vào pha cân hàm lượng axit tăng hàm lượng (NH4)2HPO4, hàm lượng nitơ cao dẫn ñến gluconic sinh lớn Nếu tiếp tục kéo dài thời gian lên men, lượng sinh khối tạo ngày nhiều, xảy tượng cạnh tranh nguồn dinh dưỡng cạn kiệt với sản phẩm axit gluconic tạo dinh dưỡng ảnh hưởng ñến hiệu suất lên men Hàm lượng axit nhiều ức chế phát triển vi sinh vật Nấm mốc bắt ñầu sử gluconic sinh giảm dần thấp 23.97 g/100g mật rỉ hàm dụng sản phẩm sinh làm chất, tạo sản phẩm phụ gây tổn lượng (NH4)2HPO4 g/l Kết hàm lượng axit gluconic tạo thành thất sản phẩm ñồng thời gây khó khăn cho trình tinh lớn 29.18 g/100g mật rỉ hàm lượng (NH4)2HPO4 bổ sung sản phẩm Kết sau 96 hàm lượng axit gluconic lớn là g/l, 30.81 g/100g mật rỉ 3.5 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐỒNG THỜI CỦA BA YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT GLUCONIC Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 19 20 3.5.1 Chọn yếu tố ảnh hưởng T2 10 96 0 0 0 32.49 3.5.2 Chọn ñiều kiện thí nghiệm T3 10 96 0 0 0 33.31 Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 (3.2) Bảng 3.8 Các ñiều kiện thí nghiệm 3.5.4 Tính hệ số hồi quy Các mức Yếu tố Mức Mức sở Mức -1 +1 Z1 10 12 Z2 84 96 Z3 Khoảng Bảng 3.11 Giá trị hệ số b phương trình hồi quy y b0 27.03 b12 - 1.49 b1 - 1.02 b13 - 0.10 b2 1.64 b23 0.28 108 12 b3 2.02 b123 0.19 biến thiên 3.5.5 Kiểm ñịnh tính ý nghĩa hệ số hồi quy tương thích phương trình 3.5.3 Tổ chức thực thí nghiệm Bảng 3.12 Giá trị chuẩn Student thực nghiệm ttn Bảng 3.9: Kết thí nghiệm quy hoạch nhân tố toàn phần Các nhân tố theo tỷ lệ xích tự nhiên t0 124.713 t12 6.859 t1 4.728 t13 0.461 y t2 7.550 t23 1.315 t3 9.302 t123 0.895 Các nhân tố hệ toạ ñộ không thứ nguyên TT Z1 Z2 Z3 x1 x2 x3 x1x2 x1x3 x2x3 x1x2x3 84 - - - + + + - 22.90 12 84 + - - - - + + 24.42 108 - + - - + - + 28.97 Do t13 , t23 , t123 < tp(f) nên hệ số b13, b23, b123 ý Tra bảng phân bố phân vị chuẩn Student (tb) với mức ý nghĩa p = 0,05 bậc tự o f = ta có: t0,05;2 = 4,3 12 108 + + - + - - - 23.76 84 - - + + - - + 26.95 nghĩa, ta loại khỏi phương trình, lúc phương trình hồi quy có 12 84 + - + - + - - 27.29 dạng: 108 - + + - - + - 33.38 12 108 + + + + + + + 28.55 T1 10 96 0 0 0 33.69 Footer Page 10 of 126 y = 27.03 - 1.02x1 + 1.64x2 + 2.02x3 - 1.49x1x2 Bảng 3.13 Các giá trị ñể tính ñộ lệch dư (3.9) Header Page 11 of 126 21 22 STN yu yu 22.90 24.68 3.17 24.42 25.68 1.59 28.97 27.39 23.76 yu − y u Thí nghiệm Các yếu tố ảnh hưởng Hàm mục tiêu Ký hiệu Z1,% Z2, Z3, g/l Y mẫu 1(TN tâm) 10 96 31.00 M12 9.6 99.6 3.4 33.91 M13 2.50 9.2 103.2 3.8 31.17 M14 25.34 2.50 8.8 106.8 4.2 28.88 M15 8.4 110.4 4.6 28.16 M16 26.95 28.15 1.42 27.29 26.10 1.42 33.38 31.99 1.94 28.55 29.94 1.94 Căn vào kết qui hoạch thực nghiệm cho thấy theo hướng leo dốc thí nghiệm thứ cho kết tốt với hàm lượng axit gluconic 33.91 g/100g mật rỉ cao tương ứng với tỷ lệ giống bổ sung 9,6%, thời gian lên men 99.6 giờ, hàm lượng (NH4)2HPO4 3.4 g/l 3.5.7 Thí nghiệm kiểm chứng Suy Fb = F(0,05; 3; 2) = 19.13, Ftn < Fb(f1f2), phương trình thu Kết thu ñược hàm lượng axit gluconic 33.62 g/100g mật ñược tương thích với thực nghiệm phương trình ñược sử dụng ñể rỉ, kết gần thỏa mãn giá trị tối ưu tìm kiếm tối ưu PTHQ (3.9) hoàn toàn tuyến tính nên ta tìm ñiều 3.5.8 Kết luận kiện tối ưu phương pháp leo dốc (phương pháp Box-Wilson) Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm ñã xây 3.5.6 Tối ưu hoá thực nghiệm dựng ñược phương trình ñộng học mô tả mối tương quan yếu Bảng 3.14 Các ñiều kiện cần thiết ñể tiến hành thí nghiệm leo dốc tố trình lên men ñến hàm lượng axit gluconic Các tiêu Z1,% Z2, h Z3, g/l Mức sở 10 96 Khoảng biến thiên (λj) 12 Hệ số bj - 1.02 1.64 2.02 bj λj - 2.04 19.68 2.02 bjλ j 2.04 19.68 2.02 Bước chuyển ñộng ( δ j ) - 0.373 3.6 0.369 Làm tròn bước chuyển ñộng ( δ j ) - 0.4 3.6 0.4 Bảng 3.15 Kết thí nghiệm theo hướng leo dốc Footer Page 11 of 126 Header Page 12 of 126 23 24 3.6 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN AXIT 3.6.2 Thuyết minh quy trình GLUCONIC TỪ RỈ ĐƯỜNG BẰNG ASPERGILLUS NIGER Ở Rỉ ñường: Được thu nhận từ nhà máy sản xuất ñường QUY MÔ PTN Pha loãng: Pha loãng rỉ ñường:nước (2:1 kg/kg) nhằm thuận 3.6.1 Quy trình công nghệ Rỉ ñường lợi cho trình ly tâm tách tạp chất, gia nhiệt tiêu diệt tạp khuẩn Gia nhiệt: Gia nhiệt 85-90oC, giữ nhiệt ñộ ñó khoảng Pha loãng 45-60 phút, hầu hết tạp khuẩn bị tiêu diệt, sau ñó lý tâm Ly tâm: Nguyên liệu ñược ly tâm tách chất không hòa Gia nhiệt tan mật rỉ Nguyên liệu sau xử lý ñược bảo quản 4oC Tiệt trùng: Mục ñích trình tiệt trùng môi trường Ly tâm Khoáng chất tiêu diệt vi sinh vật ảnh hưởng ñến trình lên men Tiệt trùng môi trường nhiệt 121oC thời gian 30 phút Chuẩn bị môi trường lên men Lên men: Thành phần môi trường chuẩn bị với hàm lượng chất mật rỉ 150 g/l, (NH4)2HPO4 g/l, KH2PO4 0.5 g/l, Tiệt trùng MgSO4.7H2O 0,1 g/l, CaCO3 40 g/l Điều chỉnh pH 6.0 H2S04 o A.niger Hoạt hóa Bã t = 30 C T= 96 pH = 6.0 Lên men theo dõi pH môi trường lên men lần Giống: Giống sau hoạt hóa ñảm bảo mật ñộ 106-107 bào tử/ml với tỉ lệ giống 10% (v/v) Môi trường lên men tiệt trùng xong Tách bã Cồn 96o Dịch 2.0 M, tiến hành lên men nhiệt ñộ 30oC, thời gian lên men 96 giờ, ñể nguội nhiệt ñộ môi trường tiến hành bổ sung giống Tách bã: Sau 96 lên men tiến hành lọc bã, thu hồi dịch canxi gluconat Bổ sung cồn kết tủa canxi gluconat Lọc tách dịch Tách dịch: Sau kết tủa canxi gluconat cồn, lọc thu H2SO4 0.2 M kết tủa loại bỏ dịch, rửa kết tủa giấy lọc H2SO4 0.2 M Tách kết tủa: Rửa kết tủa canxi gluconat giấy lọc ↓ CaSO4 Lọc tách kết tủa Dung dịch axit gluconic Hình 3.15 Quy trình lên men axit gluconic Footer Page 12 of 126 H2SO4 0.2 M, tiến hành loại kết tủa CaSO4, thu ñược axit gluconic Header Page 13 of 126 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 KIẾN NGHỊ 1) Nên tiếp tục nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng khác ñến KẾT LUẬN 1) Rỉ ñường nhà máy ñường Kon Tum có chất lượng phù hợp với lên men axit gluconic có thành phần hóa học sau: trình lên men: nhiệt ñộ lên men, nồng ñộ mật rỉ, nồng ñộ oxy, Từ ñó xây dựng phương trình tối ưu hóa trình lên men ñể Bx: 84.41 mạnh dạn ñề xuất quy trình công nghệ lên men axit gluconic từ rỉ pH: 5.40 ñường chủng nấm mốc A niger quy mô pilot Protein: 3.64 (% chất khô) 2) Nghiên cứu xử lý màu sản phẩm Đường khử: 22.70 (% khối lượng) 3) Nghiên cứu kết tinh sản phẩm ñể tạo sản phẩm dạng rắn Đường tổng: 54.50 (% khối lượng) 4) Nghiên cứu tận dụng bã thải môi trường sau lên men Đường saccarose: 30.21 (% khối lượng) 2) Đã xây dựng phương pháp xác ñịnh axit gluconic máy HPLC (Dionex - Mỹ) với thông số sau: Sử dụng pha tĩnh cột C18, tốc ñộ dòng 0,5 ml/phút, bước sóng phát 210 nm, tỷ lệ pha ñộng acetonitrile:nước (3:7 v/v), tỷ lệ axit H3PO4: nước (1:1000 v/v), (pHnước = 2.5), mẫu phân tích có pH = 2.5 3) Sau nghiên cứu ảnh hưởng ñồng thời yếu tố ñến hiệu suất thu hồi axit gluconic: tỷ lệ giống, gian lên men, hàm lượng nitơ bổ sung phương pháp quy hoạch thực nghiệm, TYT23 phương trình hồi quy thu ñược là: y = 27.03 - 1.02x1+1.64x2+ 2.02x3 - 1.49x1x2 4) Khi tối ưu hóa thực nghiệm phương pháp leo dốc với thông số lên men tối ưu: tỷ lệ giống 9.6%, thời gian lên men 99.6 giờ, lượng (NH4)2HPO4 từ 3.4 g/l Kết thu ñược từ thí nghiệm ñối chứng hàm lượng axit gluconic ñạt 33.62 g/100g mật rỉ 5) Đã ñề xuất qui trình lên men axit gluconic từ rỉ ñường sử dụng Aspergillus niger qui mô PTN Footer Page 13 of 126 ñể làm thức ăn gia súc, phân bón vi sinh  ... chất, trình lên men diễn toàn khối Đường saccarose 30.21 (% khối lượng) dịch lên men, thời gian lên men ngắn, hiệu suất lên men cao Từ kết Protein 3.2 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN trên,... QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN AXIT 3.6.2 Thuyết minh quy trình GLUCONIC TỪ RỈ ĐƯỜNG BẰNG ASPERGILLUS NIGER Ở Rỉ ñường: Được thu nhận từ nhà máy sản xuất ñường QUY MÔ PTN Pha loãng: Pha loãng rỉ. .. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2.2 Các phương pháp lên men 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.2.2.1 Phương pháp lên men bề mặt 2.1.1 Rỉ ñường 1.2.2.2 Phương pháp lên men bề sâu Rỉ ñường lấy từ công ty Đường Kon