Nghiên cứu nhân giống in vitro cây khôi nhung (ardisia sylvestris pitard)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  TRÀ THANH LIN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY KHÔI NHUNG (ARDISIA SYLVESTRIS PITARD) KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Đà Nẵng- 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  TRÀ THANH LIN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY KHÔI NHUNG (ARDISIA SYLVESTRIS PITARD) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 7420201 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Giảng viên hướng dẫn: TS Võ Châu Tuấn Đà Nẵng - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả Trà Thanh Lin i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khố luận tốt nghiệp này, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn – thầy giáo tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh – Môi trường giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình tơi thực đề tài khố luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Đà Nẵng, tháng 05 năm 2021 Sinh viên thực Trà Thanh Lin ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Khôi nhung .4 1.1.1 Đặc điểm sinh thái .4 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá trị dược liệu 1.1.4 Sự tạo mô sẹo .5 1.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến nhân giống in vitro thực vật 1.2.1 Điều kiện nuôi cấy .6 1.2.2 Môi trường nuôi cấy 1.3 Những nghiên cứu ni cấy in vitro lồi thuộc chi Ardisia, họ Đơn nem 1.3.1 Nghiên cứu giới 1.3.2 Nghiên cứu nước 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 iii 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.2 Nguyên liệu nghiên cứu 11 2.3 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu vật 12 2.3.2 Phương pháp tái sinh chồi in vitro từ mẫu thân .12 2.3.3 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 13 2.3.4 Phương pháp tạo rễ in vitro – Tạo in vitro hoàn chỉnh .13 2.3.5 Phương pháp xử lí thống kê .13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .14 3.1 Đánh giá hiệu khử trùng mẫu vật 14 3.2 Ảnh hưởng TDZ IBA đến khả tạo chồi in vitro từ callus mẫu thân khôi nhung 15 3.3 Ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh chồi in vitro khôi nhung 17 3.4 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro khôi nhung 20 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 Kết luận 23 Đề nghị 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 PHỤ LỤC 26 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA : 6-benzyl adenine BAP : 6-benzylaminopurine Cs : Cộng NAA : 1-Naphthaleneacetic acid ĐHST : Điều hòa sinh trưởng IBA : Indole 3-butyric acid L : Lít MS : Murashige Skoog (1962) TDZ : Thidiazuron v DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 5% đến hiệu khử trùng mẫu thân khôi nhung sau tuần nuôi cấy 14 3.2 Ảnh hưởng TDZ IBA đến khả phát sinh chồi in vitro từ callus mẫu thân khôi nhung sau tuần nuôi cấy 16 3.3 3.4 Ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh chồi in vitro từ callus sau 10 tuần nuôi cấy Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro sau tuần nuôi cấy vi 18 20 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình 1.1 Tên hình Thân, hoa khơi nhung ngồi tự nhiên khu Bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng Trang 2.1 Cây khôi nhung tự nhiên mẫu thân 11 2.2 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 12 3.1 Chồi in vitro tái sinh từ callus môi trường sau tuần nuôi cấy 17 3.2 Cụm chồi in vitro từ callus môi trường sau 10 tuần nuôi cấy 18 3.3 Chồi tạo rễ in vitro khôi nhung sau tuần ni cấy 21 vii TĨM TẮT Khơi nhung có tên khoa học Ardisia silvestris Pitard, thuộc chi Ardisia họ Myrsinaceae, loại thảo dược quý, khôi nhung sử dụng rộng rãi loại dược liệu có tác dụng việc điều trị dày tá tràng, làm giảm bớt ợ chua, nóng rát vùng thượng vị, kích thích lên da non làm lành dày, tá tràng Thực trạng cho thấy nhu cầu sử dụng khôi nhung ngày tăng dẫn đến tượng khai thác mức làm cho số lượng tự nhiên giảm nhanh Mặc dù khơi nhung có khu phân bố rộng, số lượng cá thể khả tái sinh hạt bị khai thác làm dược liệu với số lượng lớn nên nguồn hạt để tái sinh Nghiên cứu nhân giống in vitro khôi nhung phương pháp nuôi cấy in vitro nhằm tạo số lượng lớn thời gian ngắn việc làm thật cần thiết Kết nghiên cứu ra, khử trùng mẫu thân khơi nhung ethanol 70% phút, sau khử trùng dung dịch NaClO 5% phút cho hiệu khử trùng tốt nhất, nuôi cấy mẫu thân môi trường MS cho tỷ lệ mẫu phát sinh callus 54,33% sau tuần nuôi cấy Mơi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 0,25 mg/L TDZ + 0,5 mg/L IBA môi trường thích hợp để hình thành chồi in vitro từ callus thân khôi nhung, với tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 55,55%, sau tuần nuôi cấy Môi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung mg/L BAP mơi trường thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro khôi nhung, với tỷ lệ mẫu phát sinh cụm chồi 91,10%, hệ số nhân chồi đạt 8,2 chồi/mẫu, chiều cao đạt 5,42cm sau 10 tuần nuôi cấy Mơi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 0,7 mg/L NAA thích hợp để tạo rễ in vitro Sau tuần nuôi cấy, tỷ lệ rễ 100% đạt (4,64 rễ/chồi, chiều dài 5,2 cm/rễ) viii 2.3.3 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro Các mẫu chồi in vitro phát sinh môi trường tái sinh chồi tốt (6 tuần tuổi) nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung 3% saccharose; 0,8% agar, pH=5,8; bổ sung 0,5 – mg/L BAP để nhân nhanh chồi Đánh giá khả nhân nhanh chồi in vitro thông qua tiêu: số chồi/mẫu, chiều cao chồi, số lá/chồi sau 10 tuần nuôi cấy 2.3.4 Phương pháp tạo rễ in vitro – Tạo in vitro hoàn chỉnh Các chồi in vitro ( dài khoảng cm) tách từ cụm chồi in vitro (10 tuần tuổi) ni cấy mơi trường: MS có 3% saccharose; 0,8% agar; bổ sung NAA (0,2 – 1,0 mg/L) Đánh giá khả hình thành rễ chồi in vitro sau tuần nuôi cấy thông qua: Tỉ lệ mẫu chồi tạo rễ, số rễ/chồi, chiều dài rễ, Các môi trường nuôi cấy in vitro chỉnh pH = 5,8 trước khử trùng 121°C; 1,0 atm 20 phút Các thí nghiệm ni cấy in vitro trì nhiệt độ 25 ± 2°C, điều kiện chiếu sáng 2000 Lux thời gian chiếu sáng 12h/ngày 2.3.5 Phương pháp xử lí thống kê Mỗi thí nghiệm bố trí lại lần Các số liệu thực nghiệm xử lí thống kê theo phương pháp phân tích phương sai yếu tố (ANOVA) 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá hiệu khử trùng mẫu vật Tạo nguồn vật liệu ban đầu khâu quan trọng, định thành công việc nuôi cấy mô Việc lựa chọn nguồn mẫu ban đầu phương pháp khử trùng mẫu phù hợp bước quan trọng định đến thành cơng quy trình nhân giống Thân khôi nhung tiếp xúc với nhiều điều kiện bên nên lớp vỏ chứa vi khuẩn nấm Phương thức vô trùng nuôi cấy thông dụng hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn như: NaClO, H2O2, HgCl2 …Trong NaClO đánh giá có hiệu diệt khuẩn nấm tốt (Su, 2008) Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát hiệu khử trung mẫu vật với NaClO 5% với thời gian khử trùng khác Kết khử trùng mẫu trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 5% đến hiệu khử trùng mẫu thân khôi nhung sau tuần nuôi cấy Hiệu khử trùng Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu chết Tỷ lệ mẫu sống (%) (%) (%) phút 62,21a ± 0,64 15,55a ± 0,65 37,67c ± 0,86 phút 53,33ab ± 0,87 19,9a ± 0,74 40,67b ± 0,92 phút 48,88b ± 0,72 28,9ab ± 0,85 54,33a ± 0,97 10 phút 44,44b ± 0,78 39,9b ± 0,87 51,67a ± 0,93 Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thông kê p