Nghiên cứu nhân giống in vitro cây dây ký ninh (tinospora crispa (l ) miers)

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY DÂY KÝ NINH (Tinospora crispa (L.) Miers) Ths Huỳnh Thị Kim Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2021 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY DÂY KÝ NINH (Tinospora crispa (L.) Miers) CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ Ths Huỳnh Thị Kim CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ Thành phớ Hờ Chí Minh, tháng 01/2021 TÓM TẮT Cây Dây ký ninh (Tinospora crispa (L.) Miers) loài dược liệu phân bố Châu Á bao gồm: Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Indonesia, Philippin, Singapo, Campuchia, Lào, Việt Nam vùng phía nam Trung Quốc Cây có nhiều hợp chất thứ cấp, có 65 hợp chất phân lập xác định Các nghiên cứu gần dịch chiết từ thân Dây ký ninh cho thấy cấy có khả chống tiểu đường (type 2), chống tăng đường huyết, chống oxy hóa, bảo vệ gan, điều hịa hormone (Rohit Sharma ctv, 2015), ức chế dòng tế bào IR-HepG2 kháng insulin người (Modh ctv, 2017) Trong nghiên cứu nhân giống in vitro Dây ký ninh, nguồn vật liệu sử dụng để khử trùng mẫu đốt thân mang mắt ngủ Mẫu khử trùng Javel 20% 10 phút cho tỷ lệ mẫu đạt 88,33%, tỷ lệ tạo chồi/mẫu đạt 86,67% Môi trường tối ưu cho nhân chồi mơi trường WPM có bổ sung 0,5 mg/l BA với tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 97,78% có 4,62 chồi/mẫu Chồi Dây ký ninh in vitro tăng trưởng tốt môi trường WPM với chiều cao chồi đạt 2,06 cm, mẫu có màu xanh nhạt, phát triển đốt thân mới, mở, hình tim Mơi trường thích hợp cho tạo rễ Dây ký ninh mơi trường WPM có bổ sung 1,5 mg/l IBA cho tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt 100% với 4,53 rễ/mẫu, rễ dài 3,80 cm, có phân nhánh nhiều kéo dài nhanh chóng BM20-QT.QLKH Trang i MỤC LỤC Trang TÓM TẮT .i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH .v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vi THÔNG TIN ĐỀ TÀI .1 MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Dây Ký Ninh 1.1.1 Đặc điểm phân bố: 1.1.2 Tác dụng dược lý: 1.1.3 Thành phần hóa học: .6 1.1.4 Các cơng trình nghiên cứu lồi Tinospora: 11 1.2 Các phương pháp nuôi cấy in vitro .12 1.2.1 Phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân 12 1.2.2 Phương pháp nhân chồi bên 13 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro Dây Ký Ninh 14 1.3.1 Chất điều hòa sinh trưởng auxin 14 1.3.2 Chất điều hòa sinh trưởng cytokinin 14 1.3.3 Ảnh hưởng tượng hóa nâu đến ni cấy in vitro 15 Chương 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .17 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Vật liệu thiết bị 17 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng Javel HgCl2 đến khả khử trùng mẫu Dây ký ninh .18 2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA NAA lên tái sinh chồi từ đốt thân Dây ký ninh in vitro 18 2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Kinetin NAA lên tái sinh BM20-QT.QLKH Trang ii chồi từ đốt thân Dây ký ninh in vitro 19 2.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA NAA riêng lẻ lên rễ từ chồi Dây ký ninh in vitro 21 2.4 Phương pháp xử lý số liệu .22 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Ảnh hưởng Javel HgCl2 đến khả khử trùng mẫu đốt thân Dây ký ninh 23 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BA NAA lên tạo chồi từ chồi in vitro Dây ký ninh 26 3.3 Ảnh hưởng nồng độ Kinetin NAA lên tạo chồi từ đốt thân Dây ký ninh in vitro 31 3.4 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên tăng trưởng chồi Dây ký ninh in vitro 33 3.5 Ảnh hưởng nồng độ IBA NAA riêng lẻ lên rễ từ chồi Dây ký ninh in vitro 37 3.6 Sản phẩm nhiệm vụ nghiên cứu .41 3.6.1 Quy trình nhân giống in vitro Dây ký ninh 41 3.6.2 Cây Dây ký ninh in vitro .42 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .43 4.1 Kết luận 43 4.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO .44 PHỤ LỤC BM20-QT.QLKH Trang iii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1.1 Công dụng Tinosparo crispa Bảng 1.2 Các hợp chất hóa học phân lập từ phận T crispa Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng Javel HgCl2 đến khả khử trùng mẫu đốt thân Dây ký ninh .18 Bảng 2.2 Khảo sát nồng độ BA NAA lên tái sinh chồi từ đốt thân Dây ký ninh in vitro 19 Bảng 2.3 Khảo sát nồng độ Kinetin NAA lên tái sinh chồi từ đốt thân Dây ký ninh in vitro 20 Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tăng trưởng Dây ký ninh in vitro 21 Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA IBA lên rễ từ Dây ký ninh in vitro 22 Bảng 3.1 Ảnh hưởng Javel HgCl2 đến khử trùng mẫu Dây ký ninh 24 Bảng 3.2 Nồng độ BA NAA ảnh hưởng lên tạo chồi Dây ký ninh in vitro sau 60 ngày nuôi cấy 28 Bảng 3.3 Ảnh hưởng Kinetin NAA đến tạo chồi Dây ký ninh in vitro sau 60 ngày nuôi cấy .31 Bảng 3.4 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tăng trưởng chồi Dây ký ninh in vitro sau 60 ngày nuôi cấy .35 Bảng 3.5 Ảnh hưởng IBA NAA riêng lẽ đến tạo rễ in vitro 39 BM20-QT.QLKH Trang iv DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang Hình thái Dây ký ninh Cây giống Dây ký ninh sử dụng để đưa vào nuôi cấy in vitro 16 Ảnh hưởng chế độ khử trùng lên tạo chồi từ mẫu đốt thân 24 3.1 ký ninh 3.2 Mẫu đối chứng chồi Dây ký ninh in vitro 29 3.3 Hình thái chồi Dây ký ninh in vitro môi trường có BA 29 NAA sau 60 ngày ni cấy 3.4 Hình thái chồi Dây ký ninh in vitro mơi trường có Kinetin 32 NAA sau 60 ngày nuôi cấy 3.5 Sự tăng trưởng chồi Dây ký ninh in vitro mơi trường khống 35 3.6 Mẫu rễ Dây ký ninh in vitro mơi trường khơng có IBA NAA 39 3.7 Hình thái rễ Dây ký ninh in vitro mơi trường có IBA 39 3.8 Hình thái rễ Dây ký ninh in vitro mơi trường có NAA 39 3.9 Sản phẩm Dây ký ninh in vitro 41 BM20-QT.QLKH Trang v DANH SÁCH CHỮ VIẾ T TẮT Viết tắt Thuật ngữ đầy đủ ANOVA Analysis of variance BA Benzyladenine CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trưởng thực vật ctv Cộng tác viên CV Coefficient of variation Duncan Duncan’s multiple range test ĐC Đối chứng IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid MS Môi trường Murashige Skoog (1962) NAA α – naphthalene acetic acid SH Môi trường Schenk Hilderbrant (1972) WPM Môi trường Woody plant medium (LJoyd McCown,1981) BM20-QT.QLKH Trang vi THÔNG TIN ĐỀ TÀI Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu nhân giống in vitro Dây Ký Ninh (Tinospora crispa (L.) Miers) Chủ nhiệm đề tài/dự án:  Họ tên: Huỳnh Thị Kim  Năm sinh: 1986  Học vị: Thạc sĩ 2014 Giới tính: Nữ Chun ngành: Cơng nghệ sinh học  Chức danh khoa học: Năm đạt học vị: Năm phong chức danh:  Chức vụ:  Tên quan công tác: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao  Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TPHCM  Điện thoại quan: (028) 8862726 Fax: (028) 37990500  Địa nhà riêng:  Điện thoại nhà riêng: DTDĐ: 0967355357  E-mail: kimhuynhpy@gmail.com Cơ quan chủ trì: - Tên quan chủ trì nội dung nghiên cứu quan chủ quản: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao – Ban Quản lý Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao Tp Hồ Chí Minh - Điện thoại: 028 38862726 - Fax: 028 37990500 - Email: nghiencuu.ahtp@tphcm.gov.vn - Website: www.chta.com.vn - Địa chỉ: Ấp 1, Xã Phạm Văn Cội, Huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh - Số tài khoản: 952721032617 Kho bạc Nhà nước Củ Chi Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2020 đến tháng 12/2020 Kinh phí duyệt: 156.523.383 đồng (Bằng chữ: Một trăm năm mươi sáu triệu năm trăm hai mươi ba ngàn ba trăm tám mươi ba đồng) Mục tiêu: a Mục tiêu tổng quát BM20-QT.QLKH trang TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: [1] Đỗ Huy Bích ctv (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật [2] Lê Văn Hoàng (2008), Giáo trình ni cấy mơ tế bào thực vật, nhà xuất Đại học Đà Nẵng [3] Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, nhà xuất Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh: [4] Bisset N.G., Nwaiwu J (1983), Quaternary alkaloids of Tinospora species, Planta Med, 48, pp 275–79 [5] Cavin A., Hostettmann K., Dyatmyko W., Potterat O (1998), Antioxidant and lipophilic constituents of Tinospora crispa, Planta Med, 64, pp.393–96 [6] Chavalittumrong P., Attawish A., Chuthaputti A., Chuntapet P (1997), Toxicological study of crude extract of Tinospora crispa Mier ex Hook F & Thoms, Thai J Pharm Sci, 21, 199–210 [7] Chittur M.A.I., Gunjan M (2012), Antimicrobial activity of Tinospora crispa root extracts, Int J Res Ayurveda Pharm, 3, pp.417–19 [8] Choudhary M.I., Ismail M., Ali Z., Shaari K., Lajis N.H., (2010), Alkaloidal constituents of Tinospora crispa, Nat Prod Commun, 5, pp 1747–750 [9] Choudhary M I., Ismail M., Shaari K., Abbaskhan A., Sattar S A., Lajis N H (2010b), cis-Clerodane-type furanoditerpenoids from Tinospora crispa, J Nat Prod, 73, pp 541–47 [10] Chuakul W., Saralamp P., Boonpleng A (2002), Medicinal plants used in the Kutchum district, Yasothon Province, Thailand Thai J Phytopharm, pp 9, 22–49 [11] Chung S.Y (2011), Studies on the Constituents of the Dry Stem of Tinospora crispa (Lour.) Merr, Masters dissertation, China Medical University [12] Denis G., Gerard Y., Sahpaz S., Laporte R., Viget N., Ajana F., et al (2007), Malarial prophylaxis with medicinal plants: toxic hepatitis due to Tinospora crispa, Therapie, 62, pp 271–72 BM20-QT.QLKH trang 44 [13] Dweck A.C., Cavin J.P (2006), Andawali (Tinospora crispa) a review, Pers Care Mag, 7, pp 33–39 [14] Froemming G (2011), Anti-proliperative and antioxidant effects of Tinospora crispa (Batawali), Biomed Res, 22, pp 57–62 [15] Fukuda N., Yonemitsu M., Kimura T (1983), Studies on the constituents of the stems of Tinospora tuberculata Beumee I N-trans-and N-cis-feruloyl tyramine, and a new phenolic glucoside, tinotuberide, Chem Pharm Bull, 31, pp 156–61 [16] Fukuda N., Yonemitsu M., Kimura T (1986), Studies on the constituents of the stems of Tinospora tuberculata Beumee, III: new diterpenoids, borapetoside B and borapetol B, Chem Pharm Bull, 34, pp 2868–872 [17] Fukuda N., Yonemitsu M., Kimura T., Hachiyama S., Miyahara K., Kawasaki T (1985), Studies on the constituents of the stems of Tinospora tuberculata Beumee II New diterpenoids, borapetoside A and borapetol A, Chem Pharm Bull, 33, pp 4438–444 [18] Gimlette J.D., Burkill I.H (1930), The Medical Book of Malayan Medicine, Singapore: Botanic Gardens [19] Lam S.H., Ruan C.T., Hsieh P.H., Su M.J., Lee S.S (2012), Hypoglycemic diterpenoids from Tinospora crispa, J Nat Prod, 75, pp 153–59 [20] Li S., Long C., Liu F., Lee S., Guo Q., Li R., et al (2006), Herbs for medicinal baths among the traditional Yao communities of China, J Ethnopharmacol, 108, pp 59–67 [21] Lin Y H (2009), Studies on the Chemical Constituents of Tinospora crispa and Synthesis of the Analogous of Penta-o-Galloyl-d-Glucopyranose, Masters dissertation, China Medical University [22] A Singh, S K Sah, A.i Pradhan, S Rajbahak, Maharajan N (2009), In vitro study of Tinospora cordifolia (Willd.) Miers (Menispermaceae), Botanica Orientalis – Journal of Plant Science, Vol 6, pp 103 – 105 [23] K Mridula, S Parthibhan, T Senthil Kumar, M.V Rao (2017), In vitro organogenesis from Tinospora cordifolia (Willd.) Miers — A highly valuable medicinal plant, South African Journal of Botany, 113, pp 84 – 90 [24] Sheema Dharmapal P, T K Bindu, P S Udayan, Elyas K K (2017), In vitro Conservation of Tinospora formanii Udayan and Pradeep-A Rare Endemic Plant from Western Ghats, IOSR Journal of Biotechnology and Biochemistry, Vol (3), pp 65 – 69 BM20-QT.QLKH trang 45 PHỤ LỤC THÍ NGHIỆM 1: Tỷ lệ mẫu Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value NT Error Total 10 14 398,9 394,7 793,7 99,74 39,47 2,53 0,107 Means NT N Mean StDev 3 3 70,11 81,14 85,20 75,24 79,30 2,51 7,03 7,03 3,18 9,05 95% CI (62,03 78,20) (73,06 89,22) (77,12 93,28) (67,16 83,32) (71,22 87,38) Pooled StDev = 6,28258 Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence NT N Mean Grouping 3 3 85,20 81,14 79,30 75,24 70,11 A A A A A Means that not share a letter are significantly different The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 398.9440313 99.7360078 Error 10 394.7075254 39.4707525 Corrected Total 14 793.6515567 2.53 0.1069 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.502669 Source DF T Tỷ lệ mẫu tạo chồi Analysis of Variance BM20-QT.QLKH 8.034058 6.282575 78.19927 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 398.9440313 99.7360078 2.53 0.1069 Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value NT Error Total 10 14 3475,4 151,6 3627,0 868,85 15,16 57,31 0,000 Means NT N Mean StDev 84,96 57,244 47,416 42,86 47,523 7,45 1,709 0,786 4,00 0,894 95% CI (79,95 89,97) (52,235 62,253) (42,407 52,425) (37,85 47,87) (42,514 52,532) Pooled StDev = 3,89374 Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence NT N Mean Grouping 84,96 A 57,244 47,523 47,416 42,86 B B B C C C Means that not share a letter are significantly different Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3475.405219 868.851305 Error 10 151.612458 15.161246 Corrected Total 14 3627.017677 57.31 F 3475.405219 T 3.893744 56.00072 868.851305 THÍ NGHIỆM 2: (BA) Số chồi tái sinh mẫu (BA) Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value NT_1 Error Total 12 51,6811 26 0,3793 38 52,0604 4,30676 0,01459 295,25 Means NT_1 ĐC NT1 N Mean StDev 95% CI 0,0889 0,0385 (-0,0544 0,2322) 4,622 0,269 (4,479 4,766) BM20-QT.QLKH 0,000 57.31 F Model 12 51.68867692 4.30738974 Error 26 0.37886667 0.01457179 Corrected Total 38 52.06754359 295.25 F 12 51.68867692 Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (BA) Analysis of Variance 5.581970 4.30738974 295.25 F Model 12 15378.07001 1281.50583 Error 26 843.03909 32.42458 Corrected Total 38 16221.10910 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.948028 BM20-QT.QLKH 10.84577 5.694259 52.50213 39.52 F 12 15378.07001 T 1281.50583 39.52 F Model 12 25.09942564 2.09161880 Error 26 0.19586667 0.00753333 Corrected Total 38 25.29529231 278.20 F 12 25.09942564 T 0.086795 1.297692 2.09161880 278.20 F Model 12 11420.85058 951.73755 Error 26 449.63191 17.29353 Corrected Total 38 11870.48249 55.03 F 12 11420.85058 T 4.158550 48.03571 951.73755 55.03 F Model 23.15081926 7.71693975 Error 0.06813186 0.00851648 Corrected Total 11 23.21895112 905.90 F 23.15081926 T 0.092285 1.750000 7.71693975 905.90 F Model 8.60399622 2.86799874 1125.53 F Corrected Total 11 8.62439949 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.997634 Source DF 5.746051 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 8.60399622 T 0.050502 0.878892 2.86799874 1125.53 F Model 6996.922304 2332.307435 Error 74.499467 9.312433 Corrected Total 11 7071.421771 250.45 F 6996.922304 T 2332.307435 250.45 F Model 54.63240000 6.82905000 Error 18 0.49040000 0.02724444 Corrected Total 26 55.12280000 BM20-QT.QLKH 251.64 F 54.63240000 T 0.165059 4.240000 6.82905000 251.64 F Model 2847.098733 355.887342 Error 18 571.722133 31.762341 BM20-QT.QLKH 11.20 F Corrected Total 26 3418.820867 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.832772 Source DF 6.973764 5.635809 80.81444 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 2847.098733 T 355.887342 11.20 F Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 9.87149630 1.23393704 Error 18 0.64666667 0.03592593 Corrected Total 26 10.51816296 34.35 F 9.87149630 1.23393704 34.35