Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đỉnh tùng (cephalotaxus mannii hook f ) (năm thứ 2)

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐỈNH TÙNG (Cephalotaxus mannii Hook.F.) (NĂM THỨ 2) Ths Huỳnh Thị Kim Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2021 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐỈNH TÙNG (Cephalotaxus mannii Hook.F.) (NĂM THỨ 2) CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ Ths Huỳnh Thị Kim CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ Thành phớ Hờ Chí Minh, tháng 01/2021 TÓM TẮT Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook.f.) loại dược liệu quý, thành phần hóa học gồm alkaloid, flavonoid diterpenoid Một số cephalotaxine alkaloid harringtonine, homoharringtonine, isoharringtonine thể hoạt tính kháng số dòng tế bào ung thư mạnh ung thư phổi, ung thư máu, ung thư gan,…và sử dụng làm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh bạch cầu mãn tính Trên giới Việt Nam, Đỉnh tùng xếp vào tình trạng tuyệt chủng Trong nghiên cứu nhân giống in vitro Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook f.), tiếp tục nghiên cứu tạo hoàn chỉnh Kết cho thấy mơi trường thích hợp cho tăng trưởng chồi Đỉnh tùng in vitro mơi trường WPM có bổ sung PVP 0,5 g/l, saccharose 30 g/l, agar g/l, chồi mở to, có màu xanh đậm, chồi cao 2,53 cm Chồi Đỉnh tùng in vitro hình rễ ni cấy mơi trường WPM, có bổ sung 0,5 g/l PVP, 0,5 g/l than hoạt tính nồng độ IBA, IAA, NAA 0,5 – 2,0 mg/l Tỷ lệ sống chồi Đỉnh tùng in vitro đạt 56,67% trồng vườn ươm, với giá thể sử dụng mụn dừa 50% : tro trấu 50% kết hợp xử lý với IBA nồng độ 1000 ppm Từ khóa: Đỉnh tùng, Cephalotaxus, in vitro, nhân giống BM20-QT.QLKH Trang i MỤC LỤC TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi THƠNG TIN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi Cephalotaxus 1.2 Giới thiệu Đỉnh tùng Cephalotaxus mannii Hook.f 1.2.1 Đặc điểm hình thái phân bố 1.2.2 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi chi Cephalotaxus 1.2.3 Các nghiên cứu nước chi Cephalotaxus 10 1.2.4 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro thân gỗ 13 1.3 Ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy nhân giống in vitro 15 thực vật 1.3.1 Mơi trường ni cấy 15 1.3.2 Các chất kích thích sinh trưởng 16 1.3.3 Điều kiện ni cấy 17 Chương 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 2.1.1 Thời gian 18 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Nội dung tăng trưởng Đỉnh tùng 18 2.2.2 Nội dung tạo rễ Đỉnh tùng 19 2.2.3 Nội dung khảo sát tỷ lệ sống Đỉnh tùng in vitro vườn ươm 20 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 21 BM20-QT.QLKH Trang ii Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên tăng trưởng chồi Đỉnh 22 tùng in vitro 3.2 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA, IAA NAA riêng lẻ lên rễ từ 25 chồi Đỉnh tùng in vitro 3.3 Kết ảnh hưởng giá thể trồng lên tỷ lệ sống Đỉnh tùng in vitro 26 vườn ươm 3.7 Sản phẩm đề tài 29 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 4.1 Kết luận 32 4.2 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC BM20-QT.QLKH Trang iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Thuật ngữ đầy đủ ANOVA Analysis of variance B5 Môi trường Gamborg Miller (1986) BA Benzyladenine CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trưởng thực vật ctv Cộng tác viên Duncan Duncan’s multiple range test ĐC Đối chứng IAA 3-Indoleacetic acid Kinetin 6-furfurylaminopurine MS Môi trường Murashige Skoog (1962) NAA α – naphthalene acetic acid PVP Polyvinyl pyrrolidone SH Môi trường Schenk Hilderbrant (1972) SPSS Phần mềm thống kê Statistical Package for the Social Sciences WPM Môi trường Lloyd McCown (1980) WV5 Westvaco WV5, Coke 1996 BM20-QT.QLKH Trang iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 Tên bảng Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên tăng trưởng chồi Đỉnh tùng in vitro Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA, IAA IBA lên rễ từ chồi Đỉnh tùng in vitro Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tăng trưởng Đỉnh tùng in vitro Ảnh hưởng nồng độ NAA, IAA IBA lên rễ từ Đỉnh tùng in vitro Ảnh hưởng giá thể trồng lên tỷ lệ sống Đỉnh tùng in vitro vườn ươm BM20-QT.QLKH Trang 18 19 22 25 27 Trang v DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 3.1 Tên hình Cây, thân cành Đỉnh tùng Ảnh hưởng môi trường khoáng lên tăng trưởng chồi Đỉnh tùng in vitro sau 60 ngày nuôi cấy Trang 24 3.2 Cây Đỉnh tùng tháng trồng vườn ươm 28 3.3 Cây Đỉnh tùng sau tháng trồng vườn ươm 29 BM20-QT.QLKH Trang vi THÔNG TIN ĐỀ TÀI Tên nhiệm vụ/dự án: Nghiên cứu nhân giống in vitro Đỉnh Tùng (Cephalotaxus mannii Hook.f.) (Năm thứ 2) Chủ nhiệm nhiệm vụ/dự án: Chủ nhiệm nhiệm vụ : - Họ tên: Huỳnh Thị Kim - Năm sinh: 1986 - Học vị: Thạc sĩ - Chức danh khoa học: - Chức vụ: Chuyên viên nghiên cứu - Tên quan công tác: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nơng nghiệp Giới tính: Nữ Chun ngành: Công nghệ sinh học Năm đạt học vị: 2014 Năm phong chức danh: Công nghệ cao - Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TPHCM - Điện thoại quan: (028) 8862726 - Địa nhà riêng: 28/10 Đông Hưng Thuận 16, phường Đông Hưng Thuận, Fax: (028) 37990500 quận 12, Tp Hồ Chí Minh - Điện thoại nhà riêng: DTDĐ: 0967 355 357 - E-mail: kimhuynhpy@ gmail.com Cơ quan chủ trì: - Tên quan chủ trì nội dung nghiên cứu quan chủ quản: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao – Ban Quản lý Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao Tp Hồ Chí Minh - Điện thoại: 028 38862726 - Fax: 028 37990500 - Email: nghiencuu.ahtp@tphcm.gov.vn - Website: www.chta.com.vn - Địa chỉ: Ấp 1, Xã Phạm Văn Cội, Huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh - Số tài khoản: 9527 1032617 Kho bạc Nhà nước Củ Chi Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2020 đến tháng 12/2020 Kinh phí sử dụng: 144.591.383 đồng (Bằng chữ: Một tram bốn mươi bốn triệu năm tram chín mươi mốt ngàn ba tram tám mươi ba đồng) BM20-QT.QLKH Trên môi trường bổ sung nồng độ IBA IAA chồi Đỉnh tùng tăng trưởng chậm khơng có hình thành rễ in vitro sau 60 ngày nuôi cấy Trên môi trường bổ sung NAA nồng độ chồi bắt đầu chuyển sang màu vàng khơng có tăng trưởng Trên nghiên cứu nhân giống in vitro Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) tác giả Trần Trung Hiếu ctv (2017) cho thấy khơng có thành lập rễ in vitro mơi trường kích thích rễ với IBA NAA nồng độ – mg/l Sự không thành lập rễ in vitro Đỉnh tùng đặt tính thân gỗ lớn thân gỗ lâu năm, nên nồng độ nồng độ auxin khảo sát thành phần mơi trường ni cấy chưa phù hợp chưa kích thích phát sinh rễ in vitro Sự cải biến bổ sung vào môi trường yếu tố kích ứng giúp cảm ứng phát sinh rễ in vitro vô quan trọng Năm 2007, Bùi Thị Tường Thu Trần Văn Minh nghiên cứu nuôi cấy chồi đỉnh Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Chồi đỉnh đốt thân Thông đỏ (1-2 năm tuổi) sử dụng nuôi cấy in vitro Chồi non phát sinh sau 45 ngày nuôi cấy môi trường MS + 5mg/L BA + 1mg/L KIN Chồi non nuôi cấy phát sinh rễ môi trường WPM + 1mg/L NAA + 50mg/L Rhizopon sau 75 ngày nuôi cấy AgNO3 thích hợp cho ni cấy ức chế hoá nâu mẫu Như vậy, chồi Đỉnh tùng in vitro khơng có hình thành rễ in vitro ni cấy mơi trường WPM, có bổ sung 30 g/l saccharose, g/l agar, 0,5 g/l PVP, 0,5 g/l than hoạt tính nồng độ IBA, IAA, NAA 0,5 – 2,0 mg/l 3.3 Ảnh hưởng giá thể trồng lên tỷ lệ sống Đỉnh tùng in vitro vườn ươm Giá thể đóng vai trị quan trọng giai đoạn đầu đưa in vitro điều kiện tự nhiên Ngoài việc giữ cho đứng, giá thể cịn đảm bảo mơi trường thuận lợi nước, khơng khí dinh dưỡng để bén rễ tiếp tục sinh trưởng, phát triển Nhằm tìm loại giá thể phù hợp cho Đỉnh tùng, bố trí trồng chồi Đỉnh tùng giá thể 100% mụn dừa (G1), 50% mụn dừa + 50% tro trấu (G2), 50% mụn dừa + 50% vỏ trấu (G3) 40% mụn dừa + 30% tro trấu + 30% vỏ trấu (G4) Chồi Đỉnh tùng in vitro có chiều cao từ 3,5 cm xử lý ngâm với IBA nồng BM20-QT.QLKH 26 độ 1000 ppm nhằm tăng khả kích thích tạo rễ vườn ươm Đồng thời, phun xen kẽ IBA nồng độ 1000 ppm, phân kích thích rễ vitamin B1 phân vơ 30-10-10 với tần suất lần/tuần Kết thí nghiệm sau 90 ngày trồng vườn ươm bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng giá thể trồng lên tỷ lệ sống Đỉnh tùng in vitro vườn ươm Nghiệm Tỉ lệ sống Chiều cao Số Chiều dài thức (%) (cm) (lá) (cm) G1 26,67a 4,76a 2,30b 1,80 Cây thấp, yếu, xanh G2 56,67b 6,03b 4,30c 1,96 Cây cao, thân Hình thái khỏe, xanh G3 23,33a 4,64a 1,40a 1,84 Cây thấp, yếu, xanh G4 33,33a 4,80a 2,30b 1,82 Cây thấp, yếu, xanh Ftính 20,33** 76,91** 62,17** ns CV (%) 11,59 13,49 16,17 ns Trong nhóm trung bình, số có chữ theo sau giống khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê; **: khác biệt có ý nghĩa mức P ≤ 0,01; ns khơng có khác biệt thống kê Bảng kết cho thấy, tỷ lệ sống giảm theo chiều giảm tỷ lệ tro trấu bổ sung Tỷ lệ sống đạt cao 56,67% giá thể mụn dừa : tro trấu (tỷ lệ : 1), nghiệm thức G4 tro trấu chiếm 30% cho tỷ lệ sống giảm 33,33%, nghiệm thức lại G1 G3 khơng có phối trộn tro trấu cho tỷ lệ sống giảm 26,67% 23,33% Ở giai đoạn đầu đưa trồng vườn ươm, độ xốp giá thể nhân tố quan trọng Độ xốp giá thể vừa đảm bảo cung cấp khơng khí, vừa thoát nước tốt phần gốc giữ ẩm cung cấp dưỡng chất giúp tạo điều kiện cho rễ nhanh – yếu tố định tỷ lệ sống Sự kết hợp giá thể mụn sơ dừa tro trấu (tỉ lệ : 1) cho độ xốp vừa phải thích hợp cho hình thành rễ sinh trưởng Nghiên cứu nhân giống in vitro Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) tác giả Trần Trung Hiếu ctv (2017), cho thấy cụm chồi phát sinh tăng trưởng chậm đạt chiều cao từ 1-3 cm sau tháng nuôi cấy Đồng thời cụm BM20-QT.QLKH 27 chồi không thành lập rễ sau tháng nuôi cấy môi trường tạo rễ chứa IBA NAA có nồng độ 1-5 mg/l, có 51% cụm chồi (đã xử lý mơi trường tạo rễ) có khả thích nghi, tạo thân sau tháng nuôi trồng vườn ươm Giá thể ảnh hưởng đến chiều cao cách có ý nghĩa thống kê, với giá thể mụn dừa tro trấu (tỉ lệ : 1) cho chiều cao đạt cao 6,03 cm số đạt cao 4,3 Ở giá thể lại có chiều cao tương đương 4,76 cm, 4,64 cm 4,80 cm Đối với chiều dài khơng chịu ảnh hưởng nhiều giá thể, có màu xanh đậm theo thời gian Hình 3.2 Cây Đỉnh tùng tháng trồng vườn ươm (thang đo cm) Như vậy, Đỉnh tùng chuyển trồng vườn ươm tỷ lệ giá thể mụn dừa 50% : tro trấu 50% với kết hợp xử lý IBA nồng độ 1000 ppm thích hợp cho sinh trưởng phát triển BM20-QT.QLKH 28 3.7 Sản phẩm đề tài: - Quy trình nhân giống in vitro Đỉnh tùng, với thông số kỹ thuật mơi trường, nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thực vật thích hợp giai đoạn nhân nhanh - 100 Đỉnh Tùng ex vitro, có chiều cao – cm, – rễ, có cặp Hình 3.3 Cây Đỉnh tùng sau tháng trồng vườn ươm BM20-QT.QLKH 29 Quy trình nhân giống in vitro Đỉnh tùng (Đề xuất) Từ kết luận đề xuất quy trình nhân giống in vitro Đỉnh tùng sau: Cây Đỉnh tùng (Cây năm tuổi, khỏe mạnh) Chồi 15 đốt Khử trùng mẫu lần (Với javel 25% javel 10%, ngâm PVP 0,5g/l) 10- 12 tháng -3 tháng Tạo chồi in vitro (Môi trường B5 + BA 0,5 mg/l+ PVP 0,5 g/l) – tháng Tăng trưởng chồi Đỉnh tùng in vitro (Môi trường WPM) Cây Đỉnh tùng in vitro không tạo rễ (WPM + 0,5 – 2,0 mg/l IBA/IAA) tuần Huấn luyện thích nghi Trồng vườn ươm (Mụn dừa : tro trấu = 1:1) Thuyết minh quy trình Giai đoạn khử trùng mẫu: Các đốt thân Đỉnh tùng vị trí đốt số đến đốt số 15 tính từ chồi rửa vịi nước chảy liên tục phút để làm bụi bẩn đất bám mặt ngồi, sau lắc với dung dịch xà phịng lỗng 10 phút, rửa lại với nước cất vô trùng -5 lần chuyển mẫu vào tủ cấy tiến hành khử BM20-QT.QLKH 30 trùng Ngâm lắc mẫu với cồn 70o 30 giây đến phút, rửa mẫu với nước cất vô trùng – lần Khử trùng lần 1, ngâm lắc mẫu với dung dịch Javel Mỹ Hảo với nồng độ 25% có bổ sung giọt Tween 20, sau 10 phút khử trùng tiến hành rửa lại với nước hấp vô trùng – lần, nhằm khử loại loại vi khuẩn nấm mốc Khử trùng tiếp lần 2, ngâm lắc mẫu với dung dịch Javel Mỹ Hảo với nồng độ 10% có bổ sung giọt Tween 20, sau phút khử trùng tiến hành rửa lại với nước hấp vô trùng – lần, loại bỏ loại vi khuẩn nấm mốc Ngâm mẫu dung dịch PVP 0,5 g/l (Polyvinyl pyrrolidone) 10 phút, rửa lại nước cất vơ trùng nhằm mục đích giúp mẫu giảm tiết hợp hợp chất phenol, tăng tỷ lệ sống mẫu Sau đó, cắt bỏ phần mẫu bị tổn thương cấy vào môi trường nuôi cấy B5 (Gamborg Miller, 1986) có bổ sung PVP (Polyvinyl pyrrolidone) 0,5 g/l, 30 g/l saccharose, 8g/l agar Sau 15 ngày loại bỏ mẫu nhiễm, mẫu dùng để tái sinh chồi in vitro Giai đoạn tạo chồi in vitro từ đốt thân (2-3 tháng): Đốt thân nuôi cấy môi trường B5 bổ sung 0,5 mg/l BA, PVP 0,5 g/l, 30 g/l sucrose, g/l agar Sau tuần nuôi cấy chồi tạo thành, sau 10 tuần nuôi cấy chồi thục sử dụng cho giai đoạn tăng trưởng Giai đoạn tăng trưởng (2 - tháng): Chồi có kích thước đồng khoảng 1,5 cm nuôi cấy môi trường WPM bổ sung PVP 0,5 g/l, 30 g/l sucrose, g/l agar Sau tuần nuôi cấy, chồi sử dụng cho giai đoạn tạo rễ Giai đoạn tạo rễ: Ở giai đoạn chồi in vitro khơng có hình thành rễ, nên chồi in vitro đạt kích thước từ 3,5 cm huấn luyện thích nghi để chuẩn bị cho giai đoạn kích rễ trồng ngồi vườn ươm Giai đoạn trồng vườn ươm: Chồi in vitro có kích thước từ 3,5 cm sau huấn luyện thích nghi đưa trồng vườn ươm Chồi xử lý ngâm với chất kích thích rễ IBA nồng độ 1000 ppm 30 phút, sau tiến hành trồng vào chậu với tỉ lệ giá thể mụn sơ dừa : tro trấu (1:1) Hằng ngày, tưới phun sương, giữ ẩm Phun xen kẽ IBA nồng độ 1000 ppm, phân kích thích rễ vitamin B1 phân vơ 30-10-10 lần/tuần Điều kiện trồng vườm ươm: vườn ươm thiết kế nhà lưới cắt mưa (nilon trắng + lưới 50% ánh sáng) ẩm độ 60 - 65% BM20-QT.QLKH 31 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực nghiên cứu nhân giống in vitro Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook.f.), số kết ghi nhận sau: - Mơi trường thích hợp cho tăng trưởng chồi Đỉnh tùng in vitro mơi trường WPM có bổ sung PVP 0,5 g/l, saccharose 30 g/l, agar g/l Chồi mở to, có màu xanh đậm, chồi cao 2,53 cm - Chồi Đỉnh tùng in vitro khơng có hình thành rễ ni cấy mơi trường WPM, có bổ sung 30 g/l saccharose, g/l agar, 0,5 g/l PVP, 0,5 g/l than hoạt tính nồng độ IBA, IAA, NAA 0,5 – 2,0 mg/l - Tỷ lệ sống chồi Đỉnh tùng in vitro đạt 56,67% trồng vườn ươm, với giá thể sử dụng mụn dừa 50% : tro trấu 50% IBA nồng độ 1000 ppm 4.2 Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu yếu tố kích thích rễ in vitro Đỉnh tùng BM20-QT.QLKH 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007), Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bảo tồn phát triển Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc), Hội nghị Khoa học công nghệ 2007 [2] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh [3] Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Trung Thành (2014), Khảo sát khả nhân giống Trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy) in vitro, Tạp chí khoa học Tự nhiên Công nghệ, tập 30, số 3: 17 – 25 [4] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1, NXB trẻ, 228 [5]Trần Trung Hiếu, Huỳnh Văn Chung, Bùi Thị Linh Huệ, Lương Thị Mỹ Ngân, Bùi Lan Anh Bùi Văn Lệ (2017), Nhân giống in vitro Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.), Tạp chí phát triển Khoa học công nghệ, tập 20, số T2: 4857 [6] Võ Văn Chi (1996), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, 479 Tài liệu tiếng nước [7] Enaksha R W and Richard N A (1991), Organogensis from Cephalotaxus harringtonina callus: establishment of shoots and root cultures, Hort Science, 26, pp 479 [8] Janick J and Whipkey A., Kitto (1994), Micropropagation of Cephalotaxus harringtonia, Horts Science, 29, pp 120 – 122 [9] Sawsan S Sayd and Zeinab T Abd EI Shakour (2014), phenolic content and related antioxidant activities in in vitro cultures of Cephalotaxus harringtonina L grown in Egypt, Life Science journal, 11 [10] Lü Mei, Ruihui W., Jiwu C., Lihui Y., Chunlin L (2010), Callus induction of Cephalotaxus oliveri, Hunan forestry science and technology [11] Powell R.G., Micolajczak K.L., Weisleder D., and Smith C.R (1972), “Alkaloids of Cephalotaxus Wilsoniana”, Phytochemistry, 11, pp 3317–320 [12] Takano I., Yasuda M., Nishifima Y., Hitotsuyanagi K., Takeya H (1996), Phytochemistry, 43, pp 299-303 BM20-QT.QLKH 33 [13] Tran van Loc, Nguyen Thi Lieu, Tran Thi Phuong Thao, Nguyen Thi Luu, Ho Ngoc Anh, Le thi Thu Ha, Tran van Chien, Pham Thi Ninh, Dinh Thi Phong, Tran Van Sung (2017), The Alkaloidal constituents of Cephalotaxus mannii in Lam Dong province, Vietnam, chemistry of natural compounds, 53, pp 1122 – 126 [14] Wojciech C., Irena M and Michal G (2005), “Investigation of the essential oils from three Cephalotaxus species”, Acta Poloniae Pharmaceutica – Drug Research, 62 (6), pp 461 – 463 [15] Yao-Haur K.,Shy-Yuan H.,Li-Ming Y K.,Yi-Ling L.,Shyh-Yuan L I., and YaChing S (2002), “A Novel Cytotoxic C-Methylated Biflavone, Taiwanhomoflavone-B from the Twigs of Cephalotaxus wilsoniana”, Chem Pharm Bull, 50(12), pp 1607608 [16] Yong-ChengLi (2014), Enhanced cephalotaxine production in Cephalotaxus mannii suspension cultures by combining glycometabolic regulation and elicitation, Process Biochemistry, 49, pp 2279 – 284 Trang web [17] http://www.vast.ac.vn/component/detai/?view=detai&id=1004 [18] http://vncreatures.net/chitiet.php?page=1&loai=2&img=1&ID=3314 BM20-QT.QLKH 34 PHỤ LỤC Thí nghiệm 1: Kết ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tăng trưởng đỉnh tùng in vitro Descriptives 95% Confidence Interval for Mean Std N chieu_cao_choi Deviation Std Error Upper Bound Bound Minimum Maximum 1.678 1202 0401 1.585 1.770 1.5 1.8 1.578 0833 0278 1.514 1.642 1.5 1.7 2.533 2449 0816 2.345 2.722 2.2 3.0 1.567 0707 0236 1.512 1.621 1.5 1.7 1.989 1833 0611 1.848 2.130 1.7 2.2 45 1.869 3982 0594 1.749 1.989 1.5 3.0 1.00 000 000 1.00 1.00 1 1.00 000 000 1.00 1.00 1 2.67 500 167 2.28 3.05 1.00 000 000 1.00 1.00 1 1.67 500 167 1.28 2.05 45 1.47 726 108 1.25 1.68 Total so_la_moi Mean Lower Total Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic chieu_cao_choi so_la_moi df1 df2 Sig 2.948 40 032 48.000 40 000 ANOVA Sum of Squares chieu_cao_choi Between Groups Within Groups Total so_la_moi Between Groups Within Groups Total BM20-QT.QLKH df Mean Square 6.016 1.504 960 40 024 6.976 44 19.200 4.800 4.000 40 100 23.200 44 F Sig 62.671 000 48.000 000 I Homogeneous Subsets chieu_cao_choi Subset for alpha = 0.05 NT Duncana N 1.567 1.578 1.678 9 1.989 2.533 Sig .158 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 9.000 so_la_moi Subset for alpha = 0.05 NT Duncana N 1.00 1.00 1.00 9 Sig 1.67 2.67 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 9.000 BM20-QT.QLKH II Thí nghiệm 3: Kết ảnh hưởng giá thể trồng lên tỷ lệ sống đỉnh tùng in vitro vườn ươm Kết thống kê tỷ lệ sống Descriptives ty_le_song_cay 95% Confidence Interval for Mean Std N Mean Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 26.67 5.774 3.333 12.32 41.01 20 30 56.67 5.774 3.333 42.32 71.01 50 60 3 23.33 5.774 3.333 8.99 37.68 20 30 33.33 5.774 3.333 18.99 47.68 30 40 12 35.00 14.460 4.174 25.81 44.19 20 60 F Sig Total ANOVA ty_le_song_cay Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 2033.333 677.778 266.667 33.333 2300.000 11 20.333 000 Homogeneous Subsets ty_le_song_cay Subset for alpha = 0.05 NT Duncana N 3 23.33 26.67 33.33 Sig 56.67 076 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 BM20-QT.QLKH III Kết thống kê chiều cao số Descriptives 95% Confidence Interval for Mean Std N chieu_cao_cay so_la_moi Mean Deviation Std Error Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum 10 4.760 2319 0733 4.594 4.926 4.5 5.2 10 6.030 3020 0955 5.814 6.246 5.7 6.5 10 4.640 1430 0452 4.538 4.742 4.4 4.8 10 4.800 2357 0745 4.631 4.969 4.5 5.2 Total 40 5.058 6147 0972 4.861 5.254 4.4 6.5 10 2.30 483 153 1.95 2.65 10 4.30 483 153 3.95 4.65 10 1.40 516 163 1.03 1.77 10 2.30 483 153 1.95 2.65 Total 40 2.58 1.174 186 2.20 2.95 ANOVA Sum of Squares chieu_cao_cay Between Groups Mean Square 12.749 4.250 1.989 36 055 Total 14.738 39 Between Groups 45.075 15.025 8.700 36 242 53.775 39 Within Groups so_la_moi df Within Groups Total F Sig 76.916 000 62.172 000 Homogeneous Subsets chieu_cao_cay Subset for alpha = 0.05 N Duncana N 10 4.640 10 4.760 10 4.800 10 Sig 6.030 159 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed BM20-QT.QLKH IV chieu_cao_cay Subset for alpha = 0.05 N Duncana N 10 4.640 10 4.760 10 4.800 10 6.030 Sig .159 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000 so_la_moi Subset for alpha = 0.05 N Duncana N 3 10 10 2.30 10 2.30 10 Sig 1.40 4.30 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000 Kết thống kê chiều dài lá: Descriptives chieu_dai_la 95% Confidence Interval for Mean Std N Mean Deviation Std Error Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum 10 1.800 1633 0516 1.683 1.917 1.6 2.1 10 1.960 1776 0562 1.833 2.087 1.7 2.2 10 1.840 1578 0499 1.727 1.953 1.6 2.1 10 1.820 1751 0554 1.695 1.945 1.6 2.1 Total 40 1.855 1739 0275 1.799 1.911 1.6 2.2 BM20-QT.QLKH V ANOVA chieu_dai_la Sum of Squares Between Groups df Mean Square 155 052 Within Groups 1.024 36 028 Total 1.179 39 F 1.816 Sig .162 Homogeneous Subsets chieu_dai_la Subset for alpha = 0.05 N Duncana N 1 10 1.800 10 1.820 10 1.840 10 1.960 Sig .059 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000 BM20-QT.QLKH VI ... alkaloidal từ vỏ Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook f. ) thu hái cao nguyên tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam, là: cephalotaxin ( 1), isoharringtonine ( 2), norisoharringtonine ( 3), desoxyharringtonine ( 4), nordesoxyharringtonine... alkaloidal từ vỏ Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook f. ) thu hái cao nguyên tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam, là: cephalotaxin ( 1), isoharringtonine ( 2), norisoharringtonine ( 3), desoxyharringtonine ( 4), nordesoxyharringtonine... 3.3 Cây Đỉnh tùng sau tháng trồng vườn ươm BM20-QT.QLKH 29 Quy trình nhân giống in vitro Đỉnh tùng (Đề xuất) Từ kết luận chúng tơi đề xuất quy trình nhân giống in vitro Đỉnh tùng sau: Cây Đỉnh tùng