NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ (PLYCIAS FRUTICOSA L.HARM)

Nguồn tài nguyên cây thuốc của Việt Nam rất phong phú, đa dạng và có nhiều cây thuốc quý. Trong số đó có cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa). Đinh lăng (PolysciasfruticosaL.Harms) có tác dụng hồi phục sức khỏe, chống stress, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể, giảm rối loạn tiền đình, phòng chống nhiễm ký sinh trùng sốt rét, bức xạ siêu cao. Đinh lăng còn có tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động mạch dựa trên tác dụng hạ cholesterol toàn phần và lipid toàn phần trong huyết thanh. Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ…. Trong đó loài đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời. Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng thuốc sắc, rượu ngâm hoặc bột khô để chữa ho, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè. Đặc biệt rượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng để chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực. Trong dân gian, ngoài công dụng ăn gỏi cá có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho ra máu, thông tiểu, thông sữa, kiết lỵ nặng. Tại Ấn Độ, theo K. M. Naikairai, Đinh lăng được dùng chữa sốt, làm săn da (Đỗ Tất Lợi, 2004) Trong Đinh lăng có 2 hợp chất chính và quan trọng là polyacetylen và saponin (Vo et al., 1998). Hợp chất saponin, đặc biệt là triterpen có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống stress và các triệu chứng trầm cảm. Hợp chất polyacetylen có vai trò chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm. Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa 20 acid amin và các loại acid amin không thay thế được như lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985).

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ (PLYCIAS FRUTICOSA L.HARM) i DANH MỤC VIẾT TẮT MS: Murashingge & Skoog BA: 6-benzyladenine GA33: Gibberellin acid NAA: α-napthaleneacetic acid BAP: N-66-benzylaminoburine TB: trung bình ii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ MS đến khả nhân nhanh chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 21 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 23 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ Gibberellic đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 24 Hình 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 26 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các vi lượng thông dụng sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 Bảng 1.2 Bốn loại vitamin thường dùng 13 Bảng 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ MS đến khả nhân nhanh chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 20 Bảng 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 22 Bảng 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Gibberellic (GA3) đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 24 Bảng 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 25 iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined NHẬN XÉT CỦA ĐƠN VỊ THỰC TẬP Error! Bookmark not defined NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Error! Bookmark not defined DANH MỤC VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG .iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc vị trí phân loại Đinh lăng 1.2 Đặc điểm sinh thái 1.3 Đặc điểm hình thái 1.4 Thành phần hóa học 1.5 Tình hình sử dụng Đinh lăng Việt Nam giới 1.5.1 Trên giới 1.5.2 Ở Việt Nam 1.6 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.6.1 Sơ lược lịch sử nuôi mô tế bào thực vật 1.6.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.6.3 Tầm quan trọng nuôi cấy mô tế bào 1.6.4 Tính tồn tế bào thực vật 1.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.7.1 Vật liệu nuôi cấy 10 1.7.2 Điều kiện nuôi cấy 10 1.7.3 Thành phần môi trường nuôi cấy 11 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Nguồn mẫu: 17 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu: 17 2.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 17 2.2.1 Hóa chất 17 2.2.2 Thiết bị sử dụng 17 v 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 17 2.3.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 18 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 20 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số loại môi trường lên sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 20 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 21 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Gibberillic (GA3) đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 23 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 25 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27 4.1 Kết luận 27 4.2 Đề nghị 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 vi Mở đầu MỞ ĐẦU Nguồn tài nguyên thuốc Việt Nam phong phú, đa dạng có nhiều thuốc quý Trong số có Đinh lăng (Polyscias fruticosa) Đinh lăng (PolysciasfruticosaL.Harms) có tác dụng hồi phục sức khỏe, chống stress, tăng khả chịu đựng thể, giảm rối loạn tiền đình, phịng chống nhiễm ký sinh trùng sốt rét, xạ siêu cao Đinh lăng cịn có tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động mạch dựa tác dụng hạ cholesterol toàn phần lipid toàn phần huyết Đinh lăng có nhiều lồi thuộc chi Polyscias, Đinh lăng trổ, Đinh lăng ráng, Đinh lăng trịn Đinh lăng nhỏ… Trong lồi đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) loài dân gian sử dụng rộng rãi làm thuốc tăng cường sức khỏe hoạt huyết dưỡng não từ lâu đời Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta dùng Đinh lăng nhỏ dạng thuốc sắc, rượu ngâm bột khô để chữa ho, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho đô vật dịp hội hè Đặc biệt rượu nước sắc rễ Đinh lăng nhỏ lương y dùng để chữa chứng suy nhược thể, làm thuốc bổ tăng lực Trong dân gian, ngồi cơng dụng ăn gỏi cá có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho máu, thông tiểu, thông sữa, kiết lỵ nặng Tại Ấn Độ, theo K M Naikairai, Đinh lăng dùng chữa sốt, làm săn da (Đỡ Tất Lợi, 2004) Trong Đinh lăng có hợp chất quan trọng polyacetylen saponin (Vo et al., 1998) Hợp chất saponin, đặc biệt triterpen có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống stress triệu chứng trầm cảm Hợp chất polyacetylen có vai trị chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn kháng nấm Ngoài Đinh lăng chứa 20 acid amin loại acid amin không thay lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985) Trong đó, hai hợp chất polyacetylen panaxynol hepadeca 1,8 (e) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol Đinh lăng có chủ yếu nhân sâm, điều cho thấy có khả sử dụng Đinh lăng để thay cho nhân sâm (Nguyễn Trần Châu cs, 2007) Trong đó, nguyên nhân khiến cho sản phẩm chứa Đinh lăng cịn thị trường nguồn cung cấp giống chủ yếu giâm cành, chất lượng giống lại không cao, trồng theo phương pháp tự nhiên 3-5 năm Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đức Đạt Mở đầu thu hoạch rễ hàm lượng saponin triterpen tự nhiên không đủ đáp ứng nhu cầu dược liệu Việc đáp ứng nhanh bền vững nguồn giống có chất lượng tốt yêu cầu cấp bách Việc ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro Đinh lăng phương pháp ưu việt nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu ổn định, giống đồng đều, bệnh, làm tăng hoạt chất sinh học so với nguyên liệu ban đầu Phương pháp áp dụng rộng rãi giới Việt Nam hướng tương đối mới, cho nhiều tiềm kinh tế nhà khoa học nhà nhân giống quan tâm từ mức độ nghiên cứu đến quy mô sản xuất thương mại Để đáp ứng nhu cầu thực tế trên, định thực đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro đinh lăng nhỏ (Polycias fruticosa L Harm)” Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đức Đạt Chương Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc vị trí phân loại Đinh lăng Đinh lăng có nguồn gốc vùng đảo Polynésie thuộc cộng hịa Pháp nằm phía nam Thái Bình Dương Tên khoa học Đinh lăng Polyscias fruticosa L.Harms, L.Harms mô tả định tên vào năm 1894 Ngồi ra, Đinh lăng cịn có tên gọi khác gỏi cá hay Nam dương lâm - Loài: P fruticosa - Chi: Polyscias - Phân họ: Aralioideae - Họ: Araliaceae - Họ ngũ gia bì - Bộ: Apiales - Lớp: Dicolyledoneae - Lớp hai mầm - Ngành: Magnoliophyta - Ngành Mộc lan - Giới: Plantae - Giới thực vật Chi Polyscias có gần 100 loài, phân bố rải rác vùng nhiệt đới cận nhiệt, số đảo Thái Bình Dương Ở Việt Nam, có lồi, trồng (Đỡ Huy Bích cs, 2004) 1.2 Đặc điểm sinh thái Đinh lăng loại chịu hạn, không ưa nước, phát triển tốt vùng đất, tơi xốp có độ ẩm trung bình (Nguyễn Bá Hoạt, 2005) Cây chịu bóng râm, trồng nhiều loại đất, chí với lượng đất chậu nhỏ, sống theo kiểu cảnh bonsai (Đỡ Huy Bích cs, 2004) Đinh lăng sinh trưởng mạnh vào mùa xuân hè, hoa vào tháng đến tháng Cây trồng tỉnh phía bắc có tượng tàn lụi vào mùa đơng khí hậu lạnh, thường trồng cành sau đến năm có quả, hạt Đinh lăng có khả tái sinh dinh dưỡng mạnh chưa quan sát mọc từ hạt Cây thường trồng cách giâm cành, đến tuổi trở lên cho nhiều hoạt chất (Đỡ Huy Bích cs, 2004) 1.3 Đặc điểm hình thái Đinh lăng (Polyscias fruticosa L Harm.) thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) nên mang số đặc điểm chung họ như: Là thân gỗ hay bụi, thân thảo sống lâu năm, chúng thường có kép hình lơng chim hay hình chân Chương Tổng quan tài liệu vịt có hoa nhỏ mọc thành chùy lớn, rễ có dáng người gồm rễ nhiều rễ phụ Tuy nhiên, Đinh lăng có số đặc điểm riêng dùng để phân biệt với loài khác sau:  Thân Đinh lăng loại gỗ nhỏ, dạng bụi, xanh tốt quanh năm, thường cao 1,5 m (có thể cao đến 2m hơn) Vỏ thân màu trắng nhạt, xám, thân nhẵn, khơng có gai, phân nhánh, phân cành thấp, thân mang nhiều vết sẹo to hình chữ V, máu xám nốt lỡ vỏ, vỏ thân có mùi thơm nhẹ (Đỡ Tất Lợi, 2003)  Lá Lá kép ba lần lông chim, mọc so le, dài 20 - 40 cm, khơng có kèm rõ Lá chét có cuống nhỏ mảnh dài - 15 cm, dạng màng, phiến chét có cưa không đều, chia thùy, gốc đầu thn nhọn, có chóp nhọn, dài - 10 cm, rộng 0,6 - cm Cuống dài, phát triển thành bẹ to phần cuối Lá có mùi thơm vị nát (Đỡ Tất Lợi, 2003)  Hoa Hoa nhỏ thành cờ, tán ngắn dài - 18 cm, cụm hoa mọc thành chùy ngắn mang nhiều tán, mỡi tán có 15 - 20 hoa nhỏ, bắc rộng, sớm rụng Đài hoa hình chén, gồm đài Hoa nhỏ, màu lục nhạt trắng xám, có cánh hình trứng thn dài - mm, có nhị, nhị ngắn mảnh, dài khoảng 1,5 mm, bao phấn kéo dài, bầu hạ, ơ, có rìa trắng nhạt (Đỡ Tất Lợi, 2003)  Quả Quả dẹt, hình trứng rộng, màu tráng bạc, dài - mm, rộng mm dày 1,5 - mm, có vịi tồn Hạt hình thận hình khối cạnh màu trắng, kích thước - mm, vỏ hạt lồi lõm Cây hoa, vào tháng đến tháng (Từ điển bách khoa dược học, 1999)  Rễ Rễ hình củ cà rốt, cong queo, dài 15 - 30 cm, đường kính 0,5 - 2,5 cm, đầu to, phía thn nhỏ Mặt ngồi màu trắng xám, có nhiều nếp nhăn dọc, nhiều lỡ bì nằm ngang, nhiều vết tích rễ đoạn rễ cịn sót lại Thường hợp thành bó rễ củ, thể chất cứng giòn, dễ bẻ gãy, mặt bẻ lởm chởm, mặt cắt ngang màu vàng, gỡ chiếm 2/3 bán kính, tia ruột từ tỏa ra, mùi thơm nhẹ, vị (Từ điển bách khoa dược học, 1999) Chương Tổng quan tài liệu chức nhiều chúng có tác động chồng chéo hỡ trợ Cịn số nhóm khác điều khiển giai đoạn sinh trưởng định Trong nuôi cáy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng dẫn xuất auxin, cytokinin giberelin Nhóm Auxin Auxin nhóm chất kích thích sinh trưởng nhà sinh lý học thực vật phát quan tâm sớm Auxin hormon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào phân hóa quan, kiểu tác động liên quan đến làm chuyển đổi mềm hóa màng tế bào Chính chức người ta sử dụng đánh giá hoạt tính Nhóm auxin bao gồm chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α naphtylaxetic (α - NAA), Indolaxetic axit (IAA), 2,4D dễ gây độc có tác dụng kích thích q trình phân chia tế bào thường sử dụng nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho Tuy nhiên, tầm quan trọng chất điều tiết sinh trưởng đánh giá thơng qua số cơng trình nghiên cứu chúng Nhóm Cytokinin Việc phát xytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi mô tế bào thực vật Năm 1955 Miller Skoog phát chiết xuất từ tinh dịch cá thu hợp chất có khả kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ nuôi cấy mô gọi kinetin (6 - furfuryl - aminopurin - C10H 9N 5O) Letham Miller (1963) lần tách xytokinin tự nhiên dạng kết tinh từ hạt ngơ gọi zeatin có hoạt tính tương tự kinetin Sau người ta phát xytokinin có tất loại thực vật khác nhóm phytohormone quan trọng Trong loại xytokinin loại sau phổ biến nhất: Kinetin (6 - furfuryl - aminopurin), - benzin - aminopurin Hiện người ta phát nhiều loại xytokinin phận sinh trưởng Nhiều nghiên cứu khẳng định xytokinin hình thành chủ yếu hệ thống rễ Ngồi số quan cịn non sinh trưởng mạnh có khả tổng hợp xytokinin chồi, non, non, tầng phát sinh Người ta phát kinetin loại xytokinin có nhiều nước dừa Xytokinin vận chuyển khơng phân cực auxin, vận chuyển theo 14 Chương Tổng quan tài liệu hướng hướng gốc Xytokinin dạng tự dạng liên kết tương tự phytohormone khác Ở chúng bị phân giải tác dụng enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng urê Các xytokinin tổng hợp sử dụng kỹ thuật ni cấy mơ kinetin benzyladenin Vai trị đặc trưng xytokinin kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ Vì người ta xem chúng chất hoạt hóa phân chia tế bào, nguyên nhân xytokinin hoạt hóa mạnh mẽ trình tổng hợp axit nucleic protein dẫn đến kích phân chia tế bào Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên hình thành phân hóa quan thực vật, đặc biệt phân hóa chồi Người ta chứng minh cân tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) xytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa định q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy in vitro nguyên vẹn Nếu tỷ lệ auxin cao xytokinin kích thích rễ, cịn tỷ lệ xytokinin cao auxin kích thích chồi Ðể tăng hệ số nhân giống, người ta thường tăng nồng độ xytokinin môi trường nuôi cấy giai đoạn tạo chồi Ở rễ quan tổng hợp xytokinin chủ yếu nên rễ phát triển mạnh hình thành nhiều xytokinin kích thích chồi mặt đất hình thành nhiều Xytokinin kìm hãm q trình già hóa quan nguyên vẹn Nếu tách rời xử lý xytokinin trì hàm lượng protein chlorophin thời gian lâu tồn màu xanh lâu Hiệu kìm hãm già hóa, kéo dài tuổi thọ quan chứng minh cành dâm rễ rễ tổng hợp xytokinin nội sinh kéo dài thời gian sống lâu Hàm lượng xytokinin nhiều làm cho xanh lâu tăng q trình vận chuyển chất dinh dưỡng nuôi Trên nguyên vẹn rễ sinh trưởng tốt làm cho trẻ sinh trưởng mạnh, rễ bị tổn thương quan mặt đất chóng già Xytokinin số trường hợp ảnh hưởng lên nảy mầm hạt củ Vì xử lý xytokinin phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ hạt củ mầm Nhóm cytokinin nhóm chất hóa học có ảnh hưởng định đến kích thích phân chia tế bào Đại diện cho nhóm gồm: - benzyl aminopurine (BAP), Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin Rất nhiều cytokinin phát nghiên cứu liên quan đến ni cấy mơ, kích thích phân hóa quan tế bào khơng phân chia Nhiều 15 Chương Tổng quan tài liệu nghiên cứu nhà khoa học sử dụng kết hợp BAP NAA để tạo chồi từ mắt ngủ hay đỉnh sinh trưởng Rachael keolanui sử dụng BAP để tạo chồi khoai môn từ mắt ngầm đỉnh sinh trưởng Nhóm Gibberellin Giberelin tách chiết lần từ dịch tiết nấm nhà khoa học Nhật Bản vào năm 1935-1938 Gibberellin tổng hợp mô đỉnh, tồn hạt non phát triển Gibberellin có tác dụng việc hoạt hóa phân bào mơ phân sinh lóng, kéo dài lóng Nó kích thích kéo dài tế bào, tăng kích thước chồi nuôi cấy GA3 loại gibberellin sử dụng nhiều (Trần Thị Lệ cs, 2008) 16 Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Nguồn mẫu: Là chồi đinh lăng có chiều cao từ - cm có từ 3- ni cấy in vitro phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Thực vật Trường Đại học Yesrin Đà Lạt 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu: Tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Thực vật Trường Đại học Yesrin Đà Lạt 2.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 2.2.1 Hóa chất - Mơi trường MS - Sacharose - Agar - Các chất kích thích sinh trưởng: Kinetin, BA, GA3 - Nước dừa tươi 2.2.2 Thiết bị sử dụng - Máy chuẩn pH Hanna HI2210 - Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu) - Lò vi sóng Sanyo - Tủ sấy Memmert - Nồi hấp vơ trùng - Tủ cấy vô trùng - Micropipet 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Bố trí thí nghiệm - Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn, mỡi thí nghiệm lặp lại lần, mỡi lần bịch, mỗi bịch chồi - Các bịch nuôi cấy in vitro đặt phịng ni cấy có chế độ chiếu sáng 16h sáng/8h tối với cường độ chiếu sáng 2000- 2500 lux - Nhiệt độ phịng ni cấy:25± 20 C - Độ ẩm khơng khí: 65 – 70 % 17 Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.3.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật + Sử dụng môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962) bổ sung đường 30g/l + agar 7g/l, pH điều chỉnh 5.8 + Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm Auxin, Cytokinin, Giberelin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác tùy thí nghiệm + Nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác tùy thí nghiệm + Mơi trường hấp khử trùng 1210C, áp suất 1,1 atm 30 phút sau chia vào bịch ni cấy nylon 120 x 250 mm khơng thống khí hấp vô trùng, mỗi bịch 50-60ml 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng số loại môi trường lên sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro - Vật liệu: Là chồi đinh lăng có chiều cao từ - cm có từ 3- - Môi trường: (MS; 1/2 MS; 1/4 MS; 3/4 MS) + 2mg/l BAP + nước dừa (15%) + 7g agar + 30g đường sau điều chỉnh Ph 5.8 - Chỉ tiêu theo dõi:  Số chồi: trung bình số chồi hình thành cụm chồi  Chiều cao chồi: trung bình chiều cao chồi tạo thành  Số lá: trung bình tổng số chồi tạo thành 2.3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro - Vật liệu: Là chồi đinh lăng có chiều cao từ - cm có từ 3- - Môi trường: Môi trường MS bổ sung 2mg/l BAP nước dừa nồng độ: (0; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%) + 7g agar + 30g đường sau điều chỉnh pH 5.8 - Chỉ tiêu theo dõi:  Số chồi: trung bình số chồi hình thành cụm chồi  Chiều cao chồi: trung bình chiều cao chồi tạo thành  Số lá: trung bình tổng số chồi tạo thành 18 Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.3.3.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Gibberillic (GA3) đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro - Vật liệu: Là chồi đinh lăng có chiều cao từ - cm có từ 3- - Môi trường: Môi trường MS bổ sung 2mg/l BAP, 15% nước dừa non, GA3 nồng độ: (0 – 0.5 – – 1.5 – – 2.5 – 3) mg/l + 7g agar + 30g đường/l, sau điều chỉnh pH 5.8 - Chỉ tiêu theo dõi:  Số chồi: trung bình số chồi hình thành cụm chồi  Chiều cao chồi: trung bình chiều cao chồi tạo thành  Số lá: trung bình tổng số chồi tạo thành 2.3.3.4 Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro - Vật liệu: Là chồi Đinh lăng có chiều cao từ - cm có từ 3- - Mơi trường: Mơi trường MS bổ sung mg/lBAP, 15% nước dừa, Kinetin nồng độ: (0 – 0.5 – – 1.5 – – 2.5 – 3)mg/l + 7g/l agar + 30g/l đường sau điều chỉnh pH 5.8 - Chỉ tiêu theo dõi:  Số chồi: trung bình số chồi hình thành cụm chồi  Chiều cao chồi: trung bình chiều cao chồi tạo thành  Số lá: trung bình tổng số chồi tạo thành 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu - Các số liệu thu sau 60 ngày nuôi cấy - Các số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel - Quá trình xử lý số liệu thực máy tính theo phần mềm thống kê IBM SPSS Statistics 22 19 Chương Kết luận biện luận CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số loại môi trường lên sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro Mục đích thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng số loại môi trường đến khả nhân nhanh chồi, chiều cao số Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro Việc xác định mơi trường ni cấy thích hợp cho trình sinh trưởng phát triển chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) vấn đề cần khảo sát suốt q trình ni cấy in vitro Các chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) có chiều cao 1-2 cm nuôi cấy loại môi trường rắn khác (1/4 MS, 1/2 MS, 3/4MS MS,) có bổ sung đường 30 g/l; 2,0 mg/l BAP, 15% nước dừa non; 7,0 g/l agar pH điều chỉnh mức 5,8 Kết ảnh hưởng loại môi trường khác lên sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) in vitro thể Bảng 3.1 Kết thể Bảng 3.1 Hình 3.1 Bảng 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ MS đến khả nhân nhanh chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro Số chồi TB/ Chiều cao chồi CT Môi trường A1 MS 1,53 2,67 1,47 A2 3/4 MS 2,73 1,62 A3 1/2 MS 2,46 3,33 1,66 A4 1/4 MS 3,4 3,4 2,26 cụm Số TB/ chồi TB (cm) Sau tháng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng khác nhau, sinh trưởng phát triển chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) cho thấy có khác rõ rệt Trong đó, mơi trường có thành phần khống đa lượng thấp CT A4 cho số chồi TB/ cụm 3,4; số TB/ chồi 3,4; chiều cao TB 2,26cm thích hợp cho q trình sinh trưởng phát triển chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) với hình thái chồi phát triển triển thể rõ hình thái chồi với thân to, khỏe, phát triển đều, xanh to (Bảng 3.1; Hình 3.1) Đặc biệt, kết thu môi trường MS 1/4 cho thấy 20 Chương Kết luận biện luận tiêu theo dõi vượt trội so với môi trường khao sát (MS, MS 1/2, MS 1/4, MS 3/4) Cụ thể, chồi nuôi cấy môi trường MS sinh trưởng phát triển khơng tốt chồi mơi trường cịn lại thể Bảng 3.1, với tiêu chiều cao TB chồi 1,47cm, số TB/ chồi 2,67, số chồi TB/ cụm 1,53, cho thấy sinh trưởng phát triển thể rõ hình thái với thân to, khỏe, phát triển đều, xanh khơng nhân chồi (Hình 3.1) Điều cho thấy, q trình sinh trưởng phát triển Đinh lăng (Polyscias fruticosa) cần mơi trường giàu khống vitamin để phụ vụ cho trình sinh trưởng phát triển Như vậy, nghiên cứu này, mơi trường MS 1/4 có bổ sung 2mg/l BAP + nước dừa 15% + 7g agar + 30g đường điều chỉnh Ph 5,8 môi trường tốt cho sinh trưởng phát triển chồ Đinh lăng (Polyscias fruticosa) in vitro Mơi trường sử dụng thí nghiệm Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ MS đến khả nhân nhanh chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro Nước dừa xác định giàu hợp chất hữu cơ, chất khoáng chất kích thích sinh trưởng, sử dụng rộng rãi lĩnh vực nuôi cấy mô nhân giống in vitro Đinh lăng (Polyscias fruticosa) Nước dừa sử dụng rộng rãi thành phần thúc đẩy tăng trưởng môi trường nuôi cấy mô nửa kỉ trước, Overbeek cộng (1956) lần giới thiệu nước dừa thành phần môi trường dinh dưỡng cho nuôi cấy mô sẹo Một số thành 21 Chương Kết luận biện luận phần quan trọng có nước dừa tập hợp phytohormone; đó, quan trọng hữu ích cytokinin, Jean cộng (2009) Theo George cộng sựu (2008), nước dừa bao gồm nhiều axit amin, hợp chất đạm, hợp chất vô cơ, axit hữu cơ, nguồn carbon, vitamin có khả điều chỉnh phát triển cytokinin auxin Yong cộng (2009) cho thấy nước dừa chứa 94 % nước chất thúc đẩy tăng trưởng chồi Trong số loài thực vật, trình tái sinh gia tăng cách bổ sung nước dừa vào mơi trường ni cấy Ngồi ra, nước dừa báo cáo có khả làm tăng trình sinh trưởng phát triển hoa lan ống nghiệm có liên quan đến diện loại cytokinin theo nghiên cứu Bhasker (1996) Kết phù hợp với nghiên cứu Shantz cộng (1952) bổ sung nước dừa có tác dụng kích thích q trình nhân nhanh tế bào mơ nước dừa có chứa số yếu tố tăng trưởng Trong thí nghiệm này, nước dừa bổ sung nồng độ khác (0%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%) vào môi trường nuôi cấy MS 1/4 kết ảnh hưởng hàm lượng nước dừa lên sinh trưởng phát triển Đinh lăng (Polyscias fruticosa) trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro Số chồi TB/ Chiều cao TB CT Nồng độ B1 0% 1,2 2,4 1,04 B2 5% 1,6 2,8 1,32 B3 10% 2,8 3,2 1,7 B4 15% 4,2 2,88 B5 20% 2,2 2,6 1,6 B6 25% 1,4 1,8 1,08 cụm Số TB/ chồi (cm) Kết sau tháng nuôi cấy rằng, việc bổ sung nước dừa với nồng độ thích hợp vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến trình nhân chồi chất lượng chồi, ni cấy mơi trường có bổ sung nước dừa cho chồi xanh đậm khoẻ hơn, nhìn chung sinh trưởng tốt môi trường bổ sung 15% nước dừa vào mơi trường (Hình 3.2) 22 Chương Kết luận biện luận Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro Phân tích sinh trưởng phát triển công thức cho thấy, sinh trưởng tăng dần lên bổ sung từ 0%, 5% 10% nước dừa môi trường, đạt sinh trưởng tốt bổ sung 15% nước dừa vào môi trường, tiêu chiều cao TB 2,88cm, số TB 6, số chồi TB 4,2 Nếu bổ sung vào môi trường nhiều nước dừa ảnh hưởng không tốt tới sinh trưởng bổ sung nước dừa nồng độ 25% tiêu theo dõi giảm rõ rệt chiều cao TB 1,08cm, số TB 1,8, số chồi TB 1,4 (Bảng 3.2) Kết cho thấy hàm lượng nước dừa cao giảm tăng trưởng gây bất thường hình thái chồi Như vậy, chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) sinh trưởng phát triển tốt môi trường MS 1/4 + 2mg/l BAP + 15% nước dừa + 7g agar + 30g đường chỉnh ph 5,8 Kết sử dụng vào nghiên cứu 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Gibberillic (GA3) đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro Gibberellic (GA3) có vai trị thúc đẩy kéo dài tế bào, để thân thon dài, phát triển cao có tác dụng thúc đẩy hoa đậu Hiệu sinh lý Gibberellic kích thích mạnh mẽ sinh trưởng kéo dài thân, vươn dài lóng Hiệu có Gibberellic kích thích mạnh lên pha giãn tế bào theo chiều dọc Vì sử lý Gibberellic cho làm tăng nhanh sinh trưởng dinh dưỡng nên làm tăng sinh khối Dưới tác động Gibberellic làm cho thân tăng chiều cao mạnh 23 Chương Kết luận biện luận Trong thí nghiệm này, Gibberellic bổ sung nồng độ khác kết ảnh hưởng hàm lượng Gibberellic lên sinh trưởng phát triển Đinh lăng (Polyscias fruticosa) trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Gibberellic (GA3) đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro CT Nồng độ (mg/l) Số chồi TB/cụm Số TB/ Chồi Chiều cao TB (Cm) C1 C2 0,5 1,2 1,6 2,2 2,4 1,08 1,38 C3 2,4 2,8 1,54 C4 1,5 3,6 4,4 2,06 C5 C6 2,5 2,2 7,4 3,4 3,6 1,58 C7 1,6 2,4 1,4 Kết sau tháng nghiên cứu cho thấy thí nghiệm đối chứng khơng bổ sung Gibberellic cho kết tiêu theo dõi thấp với số chồi TB/ cụm 1,2, số lá/ chồi 2,2, chiều cao TB chồi 1,08 cm, chồi thu bé; ngắn nhỏ (Hình 3.3) Các tiêu theo dõi tăng dần nghiệm thức từ C1 đến C5 đạt cao C5 với số số chồi TB/ cụm 5; số lá/ chồi 7,4; chiều cao TB chồi 3,6 cm, chồi thu to, mập, nhiều, chồi nhiều cao (Hình 3.3) Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ Gibberellic đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 24 Chương Kết luận biện luận Ở thí nghiệm C6 C7 tăng nồng độ Gibberellic cho tiêu theo dõi giảm dần, bổ sung thêm Gibberellic vào môi trường ảnh hưởng không tốt tới sinh trưởng cây, nồng độ 3mg/l tiêu theo giỏi giảm rõ rệt chiều cao TB chồi đạt 1,4cm, số TB/ chồi đạt 2,4, số chồi TB/ cụm 1,6 (Bảng 3.3) Kết cho thấy hàm lượng Gibberellic cao giảm tăng trưởng gây tượng bất thường làm giảm số chồi Như vậy, chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) sinh trưởng phát triển tốt môi trường MS 1/4 + 2mg/l BAP + 15% nước dừa non + 2mg/l GA3 + 7g/l agar + 30g đường/l điều chỉnh ph 5.8 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro Kinetin thành phần nhóm hợp chất gọi cytokinins, lớp nhân tố điều hòa sinh trưởng thực vật Ở loài thực vật, Kinetin thúc đẩy phân chia tế bào hoạt động quy trình sinh trưởng biệt hóa tế bào Chức chất kháng xi hóa, ngăn chặn tổn thuongo xi hóa gây gốc tự Kinetin thường sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật dể kích ứng hình thànhcủa mô sẹo để tái tạo chồi từ mô sẹo Trong thí nghiệm này, Kinetin bổ sung nồng độ khác kết ảnh hưởng hàm lượng Kinetin lên sinh trưởng phát triển Đinh lăng (Polyscias fruticosa) trình bày (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro Số chồi TB/ Số TB/ Chiều cao cụm chồi TB (cm) 1,2 2,2 1,12 D2 0,5 1,4 2,6 1,42 D3 1,4 2,6 1,56 D4 1,5 1,4 2,6 1,64 D5 1,6 1,98 D6 2,5 1,4 1,46 D7 1,4 1,44 CT Nồng độ D1 25 Chương Kết luận biện luận Kết sau tháng nghiên cứu cho thấy thí nghiệm không bổ sung Kinetin cho kết tiêu theo giỏi thấp với số chồi TB cụm 1,2; số TB chồi 2,2; chiều cao TB 1,12cm; chồi thu bé; ngắn; gầy; nhỏ khơng có rễ (Hình 3.4) Các tiêu theo dõi tăng dần nghiệm thức từ D1 đến D5 đạt cao D5 với số số chồi TB/ mẫu 2; số lá/ chồi 1,6; chiều cao TB chồi 1,98 cm, nghiên cứu tập trung hình thành cây; to; khỏe; xanh đậm hình thành nhiều rễ (Hình 3.4) Hình 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) ni cấy in vitro Ở thí nghiệm D6 D7 tăng nồng độ Kinetin vào môi trường ảnh hưởng không tốt tới sinh trưởng cây, nồng độ 3mg/l tiêu theo giỏi giảm rõ rệt chiều cao TB chồi đạt 1,44cm, số TB chồi 1,4, số chồi TB cụm (Bảng 3.4) Kết cho thấy hàm lượng Kinetin cao giảm tăng trưởng gây tượng bất thường làm giảm số chồi Như vậy, chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) sinh trưởng phát triển tốt môi trường MS 1/4 + BAP + 15% nước dừa + Kinetin 2mg/l + 7g agar + 30g đường điều chỉnh ph 5.8 26 Chương Kết luận đề nghị CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu nhân nhanh Đinh lăng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng khác rút số kết luận sau: Mơi trường MS 1/4 có bổ sung 2mg/l BAP + nước dừa + 7g agar + 30g đường điều chỉnh ph 5.8 môi trường tốt cho sinh trưởng phát triển chồ Đinh lăng (Polyscias fruticosa) in vitro Với nồng độ 15% nước dừa giúp chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) sinh trưởng phát triển tốt môi trường MS 1/4 + 2mg/l BAP + 15% nước dừa + 7g agar + 30g đường điều chỉnh ph 5.8 Với nồng độ GA3 2mg/l giúp chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) sinh trưởng phát triển tốt môi trường MS 1/4 + BAP + 15% nước dừa + 2mg/l GA3 + 7g agar + 30g đường điều chỉnh ph 5.8 Với nồng độ Kinetin 2mg/l giúp chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) sinh trưởng phát triển tốt môi trường MS 1/4 + BAP + 15% nước dừa + 2mg/l Kinetin + 7g agar + 30g đường điều chỉnh ph 5.8 4.2 Đề nghị Cần nghiên cứu thêm ảnh hưởng môi trường nuôi cấy bổ sung kết hợp với chất hữu đến khả nhân nhanh chồi Đinh lăng Nghiên cứu ảnh hưởng số loại Auxin đến khả hình thành rễ đinh lăng ni cấy in vitro, nhàm hồn thiện quy trình nhân nhanh Đinh lăng Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng phát triển in vitro vườn ươm 27 Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỡ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương,Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mái,Phạm Kim Mãn, Đàm Thị Như, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc, Tập I, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Trang 793-796 [2] Ngơ Xn Bình, Bùi Bảo Hồn, Nguyễn Thúy Hịa (2003), Giáo trình cơng nghệ sinh học Nxb Nông nghiệp Hà Nội [3] Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống cấy trồng, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội [4] Phạm Hồng Hộ (1999), Quyển II, Cây cỏ Viêt Nam, Nxb Trẻ, Trang 516518 [5] Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Cơng nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội [6] Ngô Ứng Long (1985), “So sánh tác dụng tăng lực sinh thích nghi Đinh lăng Polycias frusticosa L Harms, Chân chim Eleuterococ”, Tạp trí Dược liệu, Tập 2, (Số 1), Trang 24-27 [7] Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vi ̣thuốc Viêt Nam, Nxb Y học Trang 828-830 [8] Trần Công Luận (1996), “Phân lập xác đinh cấu trúc hợp chất polyacetylen Đinh lăng (Polyscias Fruticosa (L.) Harms Araliaceae)” [9] Jean W H., Yong., Liya G., Yan F N., Swee N T - The Chemical Composition and Biological Properties of Coconut (Cocos nucifera L.) Water, Molecules 14 (2009) 5144- 5164 [10] George E F., Hall M A., and De Klerk G J - Plant Propagation by Tissue Culture Springer, Dordrecht, The Netherlands (2008) 501 [11] Yong J W H., Ge L., Ng Y F., Tan S N - The chemical composition abd biology properties of coconut (Cocos mucifera L.) water, Molecules 14 (2009) 51445164 [12] Shantz E M., Steward F C - Coconut milk factor: The growth promoting substance in coconut milk, J Amer Chem Soc 74 (1952) 6133-6135 28 ... chất hữu đến khả nhân nhanh chồi Đinh lăng Nghiên cứu ảnh hưởng số loại Auxin đến khả hình thành rễ đinh lăng ni cấy in vitro, nhàm hồn thiện quy trình nhân nhanh Đinh lăng Nghiên cứu ảnh hưởng... xytokinin loại sau phổ biến nhất: Kinetin (6 - furfuryl - aminopurin), - benzin - aminopurin Hiện người ta phát nhiều loại xytokinin phận sinh trưởng Nhiều nghiên cứu khẳng định xytokinin hình... khả nhân nhanh chồi Đinh lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến sinh trưởng phát triển Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro