Nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan thạch hộc tía dendrobium officinale kimura et migo

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG  ĐỖ THỊ YẾN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN THẠCH HỘC TÍA (DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng – Năm 2016 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG  ĐỖ THỊ YẾN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN THẠCH HỘC TÍA (DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO) Ngành: Sƣ phạm Sinh học Ngƣời hƣớng dẫn: TS Võ Châu Tuấn Đà Nẵng – Năm 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Đỗ Thị Yến LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, em học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến thầy giáo TS Võ Châu Tuấn – người trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em suốt thời gian thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến nhóm nghiên cứu, ln giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm thời gian em thực khóa luận Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ em vật chất lẫn tinh thần để em đạt kết tốt Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên thực Đỗ Thị Yến \MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết cua đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc loài lan dùng làm thuốc 1.1.1 Sơ loài lan dùng làm thuốc .3 1.1.2 Giá trị sử dụng 1.1.3 Tác động làm suy giảm trữ lượng loài lan dùng làm thuốc 1.2 Nhân giống in vitro yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống in vitro lan 1.2.1 Nhân giống in vitro 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro phong lan 1.3 Các nghiên cứu in vitro để bảo tồn phát triển nguồn gen lan dùng làm thuốc 11 1.3.1 Các nghiên cứu giới 11 1.3.2 Các nghiên cứu Việt Nam 14 1.4 Giới thiệu lan Thạch hộc tía .16 1.4.1 Đặc điểm hình thái 16 1.4.2 Phân bố 17 1.4.3 Hoạt chất sinh học 17 1.4.4 Giá trị sử dụng 17 1.4.5 Một số nghiên cứu liên quan 18 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .22 2.2.1 Nhân nhanh protocorm 22 2.2.2 Nhân nhanh chồi in vitro 22 2.2.3 Sinh trưởng chồi in vitro 22 2.2.4 Tạo rễ - hình thành in vitro hồn chỉnh 23 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Ảnh hưởng chất ĐHST nước dừa đến khả nhân nhanh protocorm 24 3.2 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi in vitro từ protocorm .26 3.3 Ảnh hƣởng KIN đến khả sinh trƣởng chồi in vitro 28 3.4 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ in vitro 29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .32 Kết luận 32 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyacetic acid AC : Active carbon (than hoạt tính) BA : 6-benzyl adenine BAP : - benzyl amino purine B5 : Gamborg (1968) CW : Coconut water (nước dừa) Cs : Cộng THT : Than hoạt tính IBA : Indole 3-butyric acid I&Y : Ichihashi & Yamashita KC : Knudson C (1965) KIN : Kinetin KTST : Điều hòa sinh trưởng M : Mitra et al MKC : Modified Knudson „C‟ MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid PLB : Protocorm-like bodíe PM : Phytamax RE : Robert Ernst (1979) SH : Schenk Hildebrandt (1972) VW : Vacin Went (1949) DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 Tên bảng Ảnh hưởng chất ĐHST nước dừa đến khả nhân nhanh protocorm sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng BA, NAA đến khả nhân chồi in vitro lan sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng chất KIN đến khả sinh trưởng chồi in vitro sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro sau tuần nuôi cấy Trang 24 26 28 30 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1 2.2 Tên hình (a): Cây lan Thạch hộc tía ngồi tự nhiên (b): Protocorm hình thành từ hạt Sơ đồ mơ tả bước thí nghiệm Trang 21 22 Nhân nhanh protocorm lan Thạch hộc tía sau tuần ni cấy; (a): 3.1 Protocorm hình thành mơi trường MS + 2,0 mg/L BA + 0,5 mg/L IBA ; (b): Protocorm hình thành mơi trường MS + 2,0 25 mg/L BA + 0,5 mg/L IBA + 10% CW Nhân chồi in vitro lan Thạch hộc tía sau tuần nuôi cấy; (a): Chồi 3.2 phát sinh môi trường MS + 10% CW + 2,0 mg/L BA + 0,3 mg/L NAA; (b): Chồi phát sinh môi trường MS + 10% CW 27 + 2,0 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA Sinh trường chồi in vitro lan Thạch hộc tía sau tuần ni cấy; (a): 3.3 Chồi phát triển môi trường MS + 10% CW + 1,5 mg/L KIN; (b): Chồi phát triển môi trường MS + 10% CW + 2,0 mg/L 29 KIN Tạo rễ phát triển lan Thạch hộc tía in vitro sau tuần nuôi cấy; 3.4.1 (a), (b): Rễ phát sinh môi trường 1/2 MS + 10% CW + 1,0 mg/L 31 NAA Ảnh hưởng NAA đến khả hình thành rễ lan Thạch hộc tía: (a): Rễ phát sinh mơi trường 1/2 MS + 10% CW + 0,1 mg/L NAA(b): Rễ phát sinh môi t rường 1/2 MS + 10% CW + 0,3 3.4.2 mg/L NAA; (c): Rễ phát sinh môi trường 1/2 MS + 10% CW + 0,5 mg/L NAA; (d): Rễ phát sinh môi trường 1/2 MS + 10% CW + 0,7 mg/L NAA; (e): Rễ phát sinh môi trường 1/2 MS + 10% CW + 1,0 mg/L NAA 31 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Từ xa xưa, ông cha ta biết sử dụng nguồn dược liệu tự nhiên để chế biến tạo nhiều loại thuốc chữa trị bệnh cho người Bên cạnh phương thức dùng thuốc theo cách cổ truyền sắc thuốc, thuốc cao, thuốc ngâm rượu, thuốc bột, thuốc chườm – bó xoa bóp… từ nhiều năm nay, người ta cịn chế tạo hàng trăm loại thuốc đại, có hiệu lực chữa bệnh cao mà nguồn gốc hợp chất tự nhiên chiết xuất từ cỏ (Amon, 1982) [21] Lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo.) có tự nhiên với nhiều giá trị dược học chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng thể, làm dãn mạch máu kháng đông máu, sử dụng rộng rãi lâm sàng, làm thuốc đặc biệt chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp (Kowitdamrong, 2013; Chu, 2014) [35, 53, 62] Do thu hái kéo dài khai thác gỗ mức người môi trường sống chúng, Thạch hộc tía dần cạn kiệt trở thành loài thực vật quý Trung Quốc (Li cs, 2008; Hou cs, 2012) [28] Năm 2004, Thạch hộc tía đưa vào sách đỏ giới (IUCN) cấp độ nguy cấp (Critically Endangered) (IUCN, 2015) Chính vậy, việc nghiên cứu tạo nguồn giống lan Thạch hộc tía cần thiết nhằm đáp ứng nhu cầu cho y học làm giảm áp lực khai thác loài tự nhiên Tuy nhiên, việc nhân giống lan Thạch hộc tía từ hạt tách chồi lại khơng mang lại hiệu cao hạt lan khó nảy mầm điều kiện tự nhiên, sinh trưởng chậm; nhân giống từ tách chồi có hệ số nhân thấp Theo Lê Văn Hoàng (2008), phương pháp ni cấy mơ phương pháp nhân giống lan cho hệ số nhân cao, số lượng giống lớn giá thành hợp lý [4] Với công nghệ nhân giống in vitro hệ số nhân giống từ trái lan số lớn, từ vài ngàn đến triệu [8] Xuất phát từ sở trên, chọn đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo.)” 27 tăng dần Hệ số nhân chồi tăng từ 4,15 - 14,85 chồi/ protocorm, chiều cao chồi tăng từ 0,26 - 0,71 cm, số trung bình đạt từ 2,65 - 3,68 lá/ chồi Điều giải thích cytokinin có chức kích thích phát triển chồi bên, auxin có vai trị pha kéo dài tế bào [56], phối hợp auxin cytokinin tỉ lệ phù hợp có tác dụng kích thích thành lập mô khác (mô sẹo, rễ, chồi) Đặc biệt, môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L BA + 0,3 mg/L NAA, hệ số nhân chồi đạt tối đa 14,85 chồi/ protocorm, chiều cao chồi lớn 0,71 cm số trung bình 3,68 lá/chồi Trong nghiên cứu Ahmad cs (2014), tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro Orchis catasetum, cho thấy môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA 0,5 mg/L NAA tốt cho nhân chồi loài lan [24] Nghiên cứu Mahbubur Rahman cs loài lan Oncidium taka cho thấy môi trường bổ sung BA NAA cho tỉ lệ nhân chồi chiều cao chồi hẳn môi trường sử dụng riêng lẻ BA, đặc biệt môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L BA + 1,0 mg/ L NAA [54] Điều cho thấy, loài lan khác có mơi trường nồng độ riêng để cảm ứng tạo chồi Trong nghiên cứu chúng tơi, lan Thạch hộc tía môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L BA 0,3 mg/L NAA tốt để tạo chồi Trước nghiên cứu loài lan Dendrobium wangliangii, Zhao (2013) thu giá trị tương tự với kết chúng tơi [38] a b Hình 3.2 Nhân chồi in vitro lan Thạch hộc tía sau tuần nuôi cấy; (a): Chồi phát sinh môi trường MS + 10% CW + mg/L BA + 0,3 mg/L NAA; (b): Chồi phát sinh môi trường MS + 10% CW + mg/L BA + 0,5 mg/L NAA 28 3.3 Ảnh hƣởng KIN đến khả sinh trƣởng chồi in vitro Lan loài có tốc độ phát triển chậm in vitro cần phải bổ sung chất ĐHST với nồng độ thích hợp để rút ngắn q trình sinh trưởng Trong thí nghiệm này, chất ĐHST bổ sung môi trường nuôi cấy Kết ảnh hưởng KIN lên kéo dài chồi sau tuần nuôi cấy thu bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng KIN đến khả kéo dài chồi lan Thạch hộc tía sau tuần nuôi cấy Nồng độ KIN (mg/L) - Khả kéo dài chồi Chiều cao chồi Số lá/ chồi 2,69fe 4,44d 0,5 2,98dc 4,83cb 1,0 3,17cb 4,91b 1,5 3,63a 5,93a 2,0 3,32b 5,10b 2,5 2,84dc 4,62dc 3,0 2,60f 3,63e Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p