Nghiên cứu nhân giống in vitro cây oải hương lavandula angustifolia

1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Nghiên cứu nhân giống in vitro oải hương (Lavandula angustifolia) Sinh viên thực : Lê Thị Huệ Chuyên ngành : Cử nhân Sinh Môi Trường Lớp : 09CSM Người hướng dẫn : Võ Châu Tuấn MỞ ĐẦU , công nghệ sinh học phát triển mạnh mẽ công nghệ ứng dụ mũi họn kỷ 21 Lĩ h ực cơng nghệ sinh học phú hư: ó h sinh vật…tro trở thành ngành hệ nuôi cấy mô, công nghệ enzyme, công nghệ vi th h tự củ ngành công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật em lại nh ng hiệu khoa học kinh tế triển vọng phát triển hội lo i ười, giải nhiều khâu tạo giống trồng, tạo nhiều giống với chất lượng tốt, ă Cây oải hươ (Lavandula angustifolia) có nguồn gốc từ Địa Trung Hải ược iết ế lồi bụi có mùi hươ với màu tím bạc ngàn ị nh ng thế, oải hươ thươ tro suất cao, bệ h… thơm ồng Nh iểm du lịch hấp dẫn cho tất cịn có nhiều công dụ chiế tr h, l m túi thơm ể hươ cũ hươ loài chứa tinh dầ c o ê ý khác hư: sát trùng vết i lồi trùng Hoa oải ười t thườ dù ó ể sản ất tinh dầ thơm…[24, 66] hực tế cho thấ , oải hươ l lồi thảo dược có giá trị cơng nghiệp, mại c o ược sử dụng ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, hóa hiê , iệt mỹ phẩm… ược m tro t m phát triể [49] Tro h ăm ất tiê thụ củ thị trườ ,c oải hươ ẫ chư iề kiệ tự hiê , hạt oải hươ nảy mầm ể phát triể th h c , gâ trở cho iệc h sả ười Không ược dùng làm thuốc an thần chất kháng khuẩn Bên cạ h ó oải xuất ước hoa, chiết thươ cá h ồng oải hươ iố áp ứ o ó, chúng tơi tiến hành thực hiệ khó h cầ ề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro oải hương (Lavandula angustifolia).” nhằm xây dựng quy trình sản xuất giống hoàn chỉnh, cung cấp sở khoa học cho việc sản xuất nhanh ịnh nguồn giống loài Mục tiêu đề tài Xây dự ược quy trình nhân nhanh giống oải hươ angustifolia) kỹ thuật nuôi cấy in vitro (Lavandula 3 Nội dung nghiên cứu Đề tài thực nội d - Khảo sát khả ă s : ảy mầm hạt oải hươ sung chất KTST (BA, KIN, IBA) nồ trê môi trường có b ộ khác h tro iều kiện in vitro - Khảo sát khả ă h nhanh chồi in vitro mơi trường có b sung chất KTST (BA, IBA) nồ - Khảo sát khả ă ộ khác tạo rễ hình thành in vitro hồn chỉnh mơi trường MS ½ MS có b sung IBA Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược họ Hoa môi (Lamiaceae) số loài dùng làm thuốc 1.1.1 Sơ lược họ Hoa môi (Lamiaceae) Họ Hoa môi (Lamiaceae hay Labiatae) cò ược gọi họ Húng, họ Bạc h ,… l họ thực vật có hoa Họ Hoa mơi có từ 233 ến 263 chi khoảng 6900 tới 7173 loài [68] ại iệt m, họ Hoa mơi có khoảng 130 lồi, ều có cỏ thân thảo, hay có tinh dầ l mr ê có mùi thơm ể ă Các lồi thực vật họ c iểm c trưng, nhiề lo i ược trồng ói ch có hươ thơm phần số lo i ược sử dụng rộng rãi ẩm thực, hư húng quế, bạc h , hương thảo, hương bạc hà, ô kinh giới, ách lí hương, oải hươ hươ , tí tơ, h ,… Một số loài bụi hay gỗ, g p dạng dây leo Nhiề lo i ược gieo trồng rộng rãi, khơng ì hươ thơm chúng mà cịn dễ gieo trồng: chúng thuộc loài thực vật dễ nhân giống cành giâm Bên cạnh nh ng loài lấ ể ăn, làm gia vị số lo i ược trồng làm cảnh (húng chanh), số lo i khác ược trồng mục ích lấy hạt làm thực phẩm (như hạt chia) [3, 65] Tên gọi nguyên gốc họ Labiatae, hoa chúng thơng thuờng có cánh hoa hợp thành mơi môi duới hưng phần lớn nhà thực vật học thích sử dụng tên gọi “L mi ce e” nói họ Các chúng mọc chéo ch thập, hĩ sau mọc vng góc với trước, hay mọc vịng Thân chủ yếu có tiết diệ hì h diện trịn Hoa củ , hưng cũ có số lồi có tiết ối xứng hai bên với cánh hoa hợp, ài hợp hường hoa luỡng tính mọc vịng (cụm hoa trơng giố hư vòng hoa hưng thực tế bao gồm hai cụm chụm lại Nhụy hoa to bao gồm hai noãn hợp lại ăm cánh hoa hợp lại thành ố [65] r ho ối xứng hai bên, thuờng hai môi 1.1.2 Một số loài dùng làm thuốc thuộc họ Hoa mơi (Lamiaceae) Các lồi họ Hoa mơi ngồi việc lấy ể ăn, làm thực phẩm, lấy tinh dầ … cò ược sử dụng tro cảm ho, bệnh phụ n , ụ thần, ể ch a bệ h hư: ạc hà nam, hoắc hươ , ki h …[3] Một số ược sử dụ giới, ích mẫ , hươ học ể ch a số bệ h hư hư tí , tí tơ, s m, hú ch h, r mèo, hạ khơ thảo, hồng cầm…[3] Theo Nguyễn Vinh Hiển (2009), có nhiều lồi họ Hoa mơi có tác dụng ch a bệnh Cây kinh giới (Elsholtzia cristata Willd.) làm thuốc ch a cảm cúm, hươ h tí (Ocimum sanctum Lin.) làm thuốc ch a cảm sốt, tía tơ (Perilla ocymoides Lin.) làm thuốc ch a cảm ho…[3] heo Đo hị Nhu (2012), rễ hồn, làm giãn tiể ộng mạch tă s m có tác dụng rối loạn vi tuần tốc ộ vi tuần hoàn Đ s m ược dùng ch a bệ h tim, t m hư phiền nhiệt, tim hồi hộp khó chịu, kinh nguyệt khơ kinh, khớp sư , thầ ki h s ều, bế hược, nhức ầu, ngủ, chấ thươ ,s i khớp Còn dùng ch a vàng da, chảy máu tử cung [7, 8] Một nghiên cứu cho thấy, việc lọc má l tă ười sử dụng kết hợp dịch chiết thận, nh [62] Bên cạ h ó, c thườ thêm h ng stress oxy hóa viêm vi mô bệnh nhân suy s m cải thiệ ược tình trạng râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth) cũ loài ược dùng làm thuốc trị sỏi thận, lợi tiểu [3] Cao chiết methanol râu mèo có tác dụng tốt việc bảo vệ tế bào gan chống lại tác dụ ộc carbon tetrachlorid, sử dụng phòng ngừa bệnh viêm gan cấp tính [2] Ích mẫu (Leonurus sibiricus) thườ ược dùng ch a bệ h hư: ro huyết tử cung, viêm niên mạc con, kinh nguyệt nhiều, huyết áp cao, bệnh tuầ ho ch a phù thủ tim Khô , thiê h ng thế, ích mẫu dùng làm thuốc thơng tiểu, ầu thống Ngồi ra, thân ích mẫ ước rửa ch a số bệ h hư sư i ắp hay sắc ú, chốc ầu, lỡ ngứa Trong hạ khô thảo (Burnella vulgaris) lượng muối kali cao nên có tác dụng hạ huyết áp, tác dụng lợi tiểu Cây cịn có tác dụng ch a bệ h o id hư lở loét, mụn nhọt… Không nh ng thế, hạ khơ thảo cịn có tác dụng ch a mắt, giải trừ nhiệt ộc tử cung âm hộ [7] Hoắc hươ (Pogostemon cablin (Blaco) Benth.) vị thuốc làm mạnh dày, giúp tiêu hóa, dùng nh ụ i trường hợp ă khô o , sôi ụng, o i, hôi miệng dùng làm thuốc ch a cảm mạo, nhức ầu, cảm cúm [7, 68] Ngồi ra, hoắc hươ cị dù ch a số bệnh nhiễm khuẩn coli, tụ cầu, liên cầu khuẩn, trị rối loạn kinh nguyệt, ch a lành vết thươ , l th h phần chế phẩm ch a ho, tiêu chảy, hoa mắt chóng m t [14] Không nh ng thế, kinh giới (Schizonepeta tenuifolia) lồi có chứa khoảng 1,8% tinh dầu thành phần Kinh giới ược dùng ể ch a cảm mạo, sốt, nhức ầu, c họ sư , ô mửa, chảy máu cam, lỵ r má , ă h ết [7] 1.2 Các nghiên cứu nhân giống in vitro dược liệu ăm qua, quy trình nhân giống kỹ thuật ni cấy in vitro Trong nh ược nhiề sở khoa học nghiên cứu hoàn thiệ trê ối tượng khác hư: c rừ ,c liệ … Gầ lươ thực, thực phẩm, c ă ả, hoa, h, c dược , iệc ứng dụng thành tựu công nghệ sinh học nhân giống, tạo dược liệu in vitro loài thuốc ý ược t m ạt số kết * Các nghiên cứu giới ode cs (2003) tiến hành nhân giống loài húng quế (Ocimum basilicum L.), lồi thuộc họ Hoa mơi (Lamiaceae) Lồi có cơng dụng ch a bệ h hư i sá , mồ hôi, ờm, thuốc tố hơi, chất kích thích làm thuốc lợi tiểu Hạt ược khử trùng cồn 70% phút dung dịch h poclorit tro 15 phút, s nảy mầm ược cấ tro ó ược cấ trê mơi trường MS Lá mầm từ hạt mơi trường MS có b sung 0,2 mg/L NAA BAP (0 - mg/L) Sau 45 ngày, chồi phát triển tốt trê môi trường MS b sung 0,2 mg/L NAA mg/L BAP Rễ ược tạo r trê mơi trường ½ MS [45] Pence cs (2009) hiê cứu nhân giống Hedeoma todsenii, lồi thuộc họ Hoa mơi (Lamiaceae) Chồi ược tái si h trê mơi trường MS có b sung 0,1 m /L BAP 0,01m /L AA rê môi trường MS b sung 0,5 mg/L chồi tă trưởng tốt nhất, môi trường MS b sung 0,5 mg/L IBA tốt cho tạo rễ [60] Saha cs (2012) tiến hành nhân giống loài Ocimum gratissimum L (Lamiaceae) Chồi ách ược sử dụ ể cấ trê môi trường MS b sung BA (0,5 - 3,0 mg/L), KIN (0,5 - 3,0 mg/L 2-ip (0,5 - 3,0 mg/L) Khả ă tốt th tạo chồi ược trê môi trường MS b sung mg/L BA với hệ số nhân chồi 5,17 chồi/mẫu rễ th ược tốt trê môi trường ½ MS b sung 1,5 mg/L IBA 2% sucrose Cây in vitro hoàn h ược chuyể r h lưới giá thể ất, cát (1:1), ạt 82,5% [57] tỉ lệ số h Nadha (2006) nghiên h hc ầ i Ấ Độ (Tylophora indica) hiê cứu khả ă thuộc phân họ Thiên lý (Asclepiadaceae) Các tác giả ứng mô sẹo in vitro từ thân, oạn mắt th c ầ cảm ài Ấ Độ trê mơi trường MS có b sung auxin cytokinin, mơ sẹo hình thành từ oạn mắt, thân trê môi trường MS b sung NAA (4x10-6 + KIN (1x10-6) tốt Sự phát c sinh chồi ược nghiên trê môi trường MS + BA (10-6 - 4x10-6 mg/L) MS + BA (10-6 - 4x10-6 mg/L), CW (15%) Kết tốt ạt ược 45 - 50 chồi mơi trường MS có b sung 2x10-6 mg/L BA sau - tuần nuôi cấ Khi tă ộ BA số chồi bị suy giảm S nồ b s IBA thêm ó chồi ược cấ trê môi trường MS IAA ể tạo rễ, kết tốt môi trường MS b sung 4x10-6 mg/L IBA [33] Theo nghiên cứu Peng cs (2007) nhân nhanh bắc bán hạ (Pinellia ternata) c c dược liệu quý Trong nghiên cứu họ ể tái sinh in vitro Mẫu cấ i ,s ó m tro d ược khử trùng với cồn 70% khoảng 30 dịch HgCl 0,1% 10 phút, cấ MS có b sung phytohormone C sử dụng co th o môi trường ược trực tiếp trê môi trường MS b sung 0,5 mg/L BA 0,5 mg/L NAA [51] Khalafalla ff ll (2008) h iống thành công keo (Acacia Senegal (L.) Wild) thuộc họ Trinh n , vỏ t i dù loét Họ sử dụng mắt ể cấ ể trị vết thươ , ết o mơi trường MS có b sung BA ho c KIN (0 – mg/L) có ho c không b sung (NAA 0,5 mg/L) Sau tuần ni cấy mơi trường MS có b sung 1,0 mg/L BA cho tỉ lệ bật chồi cao (5,3 chồi /mẫu) Khảo sát tạo thành rễ trê môi trường MS b sung IBA, IAA ho c NAA (0,5 – 1,5 mg/L) Tỉ lệ rễ ạt 25% mơi trường có 1,0 mg/L IBA [39] ăm 2008, trê tạp chí Cơng nghệ nông nghiệp Ấ Độ ă i “Tái sinh hoa in vitro từ chồi ỉnh Basilicum polystachyon (L.) Moe ch”, l lo i dược thảo Cấy mẫ trê mơi trường MS có b sung BAP (2,22 - 13,32 µM) ho c KIN (2,32 – 13,92 µM) Sau 30 ngày nuôi cấ môi trường MS + 8,88 μM BA cho hệ số nhân nhanh cao (66 chồi/mẫu) Rễ ược nuôi cấy trê môi trường MS b sung IBA (2,46 – 14,76 µM) ho c IAA (2,85 – 17, 13 µM) Kết th ược, tạo rễ tốt trê mơi trường MS + 9,84 µM IBA [16] ăm 2009, Keng cs hiê cứu nhân nhanh Gynura procumbens (Lo r.) Merr ể chiết xuất hoạt chất sinh học C cách i m c h, hư chúng Đ phươ pháp l loại có tác dụ nhiễm trù khô thường nhân giống thể áp ứ ược nhu cầu sử dụng iều trị bệnh tiể ường, cao huyết áp ường tiểu Họ thực tái sinh chồi trê mơi trường MS có b sung 2,0 mg/L BA Kết th ược cho thấ môi trường b sung 0,5 mg/L NAA + 2,0 mg/L BA có 18 chồi con/mẫu chồi phát sinh Tồn chồi tạo rễ sau tuần nuôi cấ trê mơi trường MS khơng có chất iề ho si h trưởng [25] ăm 2010, Keng Chong tiế h h h h h c rá mũi tê (Alocasia longiloba), lồi có tách dụng tiêu viêm, kháng khuẩn Chồi phát sinh tốt trê môi trường MS có b sung 2,0 mg/L BA 0,5 mg/L IBA Rễ phát triể trê môi trường MS b sung 0,5 mg/L IBA [41] Ro ert cs (2012) hiê cứu tái sinh Dipteracanthus prostratus (Poir.) loài thảo dược có giá trị Mắt cấ ược tro mơi trường MS có b sung KIN, BAP NAA (0,2 – 2,5 mg/L) Chồi ược tái sinh tốt môi trường MS + 0,2 mg/L NAA + mg/L KIN Tỉ lệ hình thành chồi phát triển cao trê môi trường MS + mg/L KIN Rễ ược nuôi cấy môi trường M b sung NAA ho c IBA (0,2 – mg/L) Kết tốt trê môi trường MS + 0,5 mg/L IBA [35] * Các nghiên cứu Việt Nam ăm 2008, hư chất iề hò si h trưở hục A h cs ước ầu nghiên cứu ả h hưởng ến phát sinh hình thái mơ hoắc hươ (Pogostemon cablin (Blaco) Benth) Mô hoắc hươ ược cấy môi trường MS b sung NAA, IBA, BAP ho c 2,4-D Tỉ lệ mơ sẹo hình thành tốt trê môi trường MS b sung phối hợp NAA với BAP Chồi cũ hì h th h môi trường sử dụng MS b sung NAA, IBA KIN Nhiều thể chồi hình thành mơi trường b sung 0,5 0,7 mg/L BAP [1] ăm 2007, Q ách iễm Phươ Bùi ă Lệ cô ố cơng trình nghiên cứu nhân giống in vitro bắt ruồi (Drosera burmanni Vahl) Hạt sau khử trùng ược cấ trê mơi trường ½ MS Cây sau nảy mầm ược cắt ốt ni cấy ½ MS lỏng lắc môi trường rắn Kết cho thấy nuôi cấy trê môi trường lỏng, 100% mẫu cấy số , tă trưởng xanh tốt tạo nhiều chồi [10] ăm 2010, rươ c h cs hiên cứu nhân giống in vitro m (Aloe vera L.), lo i dược liệu có giá trị Đỉ h si h trưởng sau ược khử trù ă hị Bích Phượ ược nuôi cấ trê môi trường MS b sung BAP 1,5 mg/L có khả tái si h chồi cao (5,27 chồi/mẫu) Mơi trường cho trình nhân h h l môi trường MS b sung t hợp BAP mg/L NAA 0,5 mg/L Rễ ược cảm ứng tốt trê mơi trường ½ MS b sung 0,5 mg/L NAA ạt 5,07 rễ/chồi [12] Nguyễn Thanh Tùng cs (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro qua lâu (Trichosanthes kirilowii) l lo i dược liệu quý chứa nhiều hợp chất hóa học có giá trị hư triterpe oid, sterol c biệt protein bất hoạt ri osome hư karasurin, trichosanthin (TCS), Trichosanthes anti-HIV protein (TAP 29) có hoạt tính ức chế khối u kháng virus (bao gồm HIV) Hạt ược khử trùng javel tro phút, s ó cấ lê mơi trườ ản MS (Murashige and Skoog, 1962) b sung 1,5 mg/L kinetin Sau tuần nuôi cấy, tỷ lệ hạt khơng nhiễm có nảy mầm ạt 87,9% Đỉ h si h trưởng chồi bên in vitro ược cấ lê môi trường nhân nhanh b sung BAP, KIN, AA ước dừa (CW) riêng rẽ hay kết hợp Kết 10 nhân chồi tốt ạt ược nuôi cấy chồi ê trê môi trường MS b sung 1,0 mg/L BAP 20% ước dừa (19,87 chồi/mẫu) Chồi in vitro tạo rễ trê mơi trường ½ MS khơng b chất ĐHS (5,67 rễ/chồi) Cây in vitro ạt tiêu chuẩ r ất sau tuần nuôi cấ C co ược chuyển ược trồng giá thể ất thịt cát (1:1) cho tỷ lệ sống sót cao ạt 77,5% [11] Nguyễn Thị Út cs (2010) khả ă h hiê cứu ả h hưởng chất ĐHS ến h h chồi in vitro sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) Chồi ỉ h s m c ược nuôi cấ trê môi trường MS b sung BA (1-4 mg/L) Chồi tái sinh tốt môi trường MS b sung mg/L BA Khảo sát khả ă nhân nhanh củ s m c trê môi trường MS b sung BA (0,5-4 mg/L), KIN (0,5-4 mg/L), BA + KIN (0,5-4 mg/L) Kết cho thấ , mơi trường MS có b sung t hợp BA + KIN cho h h h chồi in vitro sâm cau [13] ăm 2011, Nguyễn Trung Thành cs tiến hành nghiên cứu khả ă tạo rễ bất ịnh sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis, Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro Mẫu cấy từ củ sâm Ngọc Li h tươi ược sung mg/L 2,4- trê mơi trường MS có b cho kết hình thành mơ sẹo rễ bất ịnh tốt sau tháng nuôi cấy Mẫu rễ ược chuyể s mơi trường B5 có b sung mg/L IBA cho kết hình thành phát triển rễ bất ị h cũ hư tă si h khối khả quan [5] Đă ọc Phúc cs tiến hành nhân giống sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu), loại dược liệu quý Quả sa nhân chứa tinh dầu, với nhiều hợp chất hóa học giá trị hư: c mphe , ß-pinen, limonen, camphor, borneol, s po i … có tác dụng ức chế hoạt ộng nhiều loại vi khuẩn Ðỉnh sinh trưởng oạn thân mang chồi nách từ thân rễ tự hiê ược khử trùng HgCl 0,1% thời gian từ 5-18 phút Mẫu ược nuôi cấy môi trường MS b sung riêng lẻ chất ĐHS BAP, KIN Sau tuần nuôi cấy, khả tái sinh chồi tốt ạt ược môi trường b sung BAP 1,0 mg/L (1,36 chồi/ ỉnh sinh trưởng; 1,40 chồi/ ỉnh sinh trưởng b ôi; 1,04 chồi/ oạn thân) Ðoạn thân in vitro ược cấy lên môi trường nhân nhanh b sung riêng lẻ hay kết hợp chất ĐHS BAP, KIN NAA Sau 10 tuần nuôi cấy, môi trường b sung BAP 1,5 mg/L kết hợp NAA 0,25 29 vitro thành cơng lồi Lavandula dentata sử dụng kết hợp 2,2µM BAP + 2,5µM IBA [31] 3.3 Khả tạo rễ in vitro Đối với nuôi cấy mô tế o, i thườ ược sử dụng cho việc phân chia, phân hóa tế bào phân hóa rễ IBA NAA hai loại tro i thườ ược sử dụng môi trường tạo rễ [4] Sau tạo cụm chồi in vitro, chồi có chiều cao từ 1,0 - 1,5 cm thu từ thí nghiệm trê ược tách cấ lê mơi trường MS ½ MS có b s khảo sát khả ă IBA ể hì h th h rễ - tạo in vitro hoàn chỉnh Kết th ược ược trình bày bảng 3.4 sau tuần nuôi cấ Bảng 3.4 Ảnh hưởng IBA môi trường khoáng đến khả tạo rễ in vitro oải hương sau tuần ni cấy Mơi trường khống Chất ĐHST (mg/L) Khả tạo rễ IBA Tỷ lệ rễ (%) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) MS 0,0 0,00f 0,00f MS 0,05 0,0 0,00f 0,00f MS 0,10 20,0 1,30c 0,76de MS 0,15 20,6 1,00cd 0,63de MS 0,20 40,3 1,93b 1,10bc ½ MS 10,0 0,40ef 1,33b ½ MS 0,05 50,6 3,06a 2,30a ½ MS 0,10 20,0 1,23c 1,10bc ½ MS 0,15 20,3 0,73de 0,63de Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p