Nghiên cứu nhân giống in vitro lan kim tuyến anoectochilus roxburghii wall lindl

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG LÊ THỊ TRINH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL.) LINDL.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng, 2016 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG LÊ THỊ TRINH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL.) LINDL.) Ngành: SƯ PHẠM SINH HỌC Người hướng dẫn: TS Võ Châu Tuấn Đà Nẵng, tháng 05 năm 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Lê Thị Trinh LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Mơi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết th ực hành thí nghiệm ni cấy mô tế bào thực vật Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn ThS Trần Quang Dần, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến nhóm nghiên cứu, ln giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đ ối với gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên thực LÊ THỊ TRINH MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài .2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược lan vai trò lan làm thuốc 1.1.1 Sơ lược lan 1.1.2 Giá trị dược liệu 1.2 Nhân giống in vitro yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 1.2.1 Giới thiệu nhân giống in vitro 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro .7 1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy 1.2.2.2 Điều kiện nuôi cấy 1.2.2.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 1.2.3 Vật liệu nuôi cấy .11 1.3 Các nghiên cứu nhân giống để bảo tồn phát triển loài lan quý kỹ thuật invitro .13 1.3.1 Các nghiên cứu giới 13 1.3.2 Các nghiên cứu nước .14 1.4 Giới thiệu lan Kim Tuyến 16 1.4.1 Đặc điểm lan Kim Tuyến 16 1.4.1.1 Đặc điểm hình thái 16 1.4.1.2 Phân bố 16 1.4.2 Giá trị dược liệu lan Kim Tuyến 17 1.5 Các nghiên cứu lan kim tuyến 17 1.5.1 Các nghiên cứu lan kim tuyến giới .17 1.5.2 Các nghiên cứu lan kim tuyến Việt Nam 18 Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nhân nhanh chồi in vitro 21 2.2.2 Đánh giá khả sinh trưởng chồi invitro 21 2.2.3 Tạo rễ in vitro 22 2.2.4 Huấn luyện đưa đất 22 2.2.5 Bố trí thí nghiệm xử lí số liệu 22 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan kim tuyến 23 3.1.1 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi l an kim tuyến 23 3.1.2 Ảnh hưởng BA + NAA đến khả nhân nhanh chồi lan kim tuyến 24 3.2 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả sinh trưởng chồi in vitro 26 3.2.1 Ảnh hưởng BA đến khả kích thích tăng trưởng chồi 26 3.2.2 Ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả kích thích tăng trưởng chồi 28 3.3 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo rễ in vitro kim tuyến 30 3.4 Huấn luyện đưa trồng vườn ươm 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 Kết luận 35 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Tên bảng Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng BA + NAA đến khả nhân nhanh chồi lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng BA đến khả kích thích tăng trưởng chồi lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả kích thích tăng trưởng chồi lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng môi trường đến khả rễ in vitro lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trư ởng đến khả tạo rễ in vitro kim tuyến sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng giá thể đến khả sống sót lan kim tuyến sau tháng thích nghi ngồi vườn ươm Trang 23 25 27 29 31 32 34 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1 3.1 Tên hình Sơ đồ thí nghiệm Sự nhân lên chồi lan kim tuyến môi trường nuôi cấy khác Trang 21 24 Sự nhân lên chồi lan kim tuyến môi trường nuôi 3.2 cấy khác (A) MS bổ sung 2,0 mg/L BA; (B) 2,0 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA; (C) 2,0 mg/L BA + 1,0 mg/L NAA; (D) 2,0 26 mg/L BA + 1,5 mg/L NAA; (E) 2,0mg/L BA + 2,0 mg/L NAA Chồi lan kim tuyến sinh trưởng môi trường nuôi cấy 3.3 khác Môi trường MS (A); (B) MS bổ sung 0,5 mg/L BA; (C) 1,0 mg/L BA; (D) 1,5 mg/L BA; (E) 2,0 mg/L BA; (F) 28 2,5 mg/L BA; (G) 3,0 mg/L BA Chồi lan kim tuyến sinh trưởng môi trường nuôi cấy khác (A) Bổ sung 2,5 mg/L BA; (B) Bổ sung 2,5 mg/L 3.4 BA + 0,5 mg/L NAA; (C) Bổ sung 2,5 mg/L BA + 1,0 mg/L 30 NAA; (D) Bổ sung 2,5 mg/L BA + 1,5 mg/L NAA; (E) Bổ sung 2,5 mg/L BA + 2,0 mg/L NAA 3.5 Chồi lan kim tuyến hình thành rễ in vitro sau tuần nuôi cấy (A) Môi trường MS; (B) Môi trường ½ MS 31 Lan kim tuyến tạo rễ in vitro môi trường nuôi cấy khác 3.6 (A) ½ MS ; ½ MS bổ sung (B) 0.5 mg/L IBA; (C) 1,0 mg/L IBA; (D) 1,5 mg/L IBA; (E) 2.0 mg/L IBA; (F) 0,5 mg/L NAA; (G) 33 1,0 mg/L NAA; (H) 1,5 mg/L NAA; (I) 2,0 mg/L NAA Cây trồng vườn ươm giá thể (A) Xơ dừa; (B) 3.7 Xơ dừa + đất cát (1:1); (C) Xơ dừa + đất cát (2:1); (D) Đất cát + phân chuồng hoai + xơ dừa (1:1: 1) 34 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyacetic acid AC : Active carbon (than hoạt tính) BA : - benzyl adenine BAP : - benzyl amino purine B5 : Gamborg (1968) CW : Coconut water (nước dừa) IBA : Indole - butyric acid I&Y : Ichihashi & Yamashita KC : Knudson C (1965) KIN : Kinetin ĐHST : Điều hòa sinh trư ởng M : Mitra et al MKC : Modified Knudson ‘C’ MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid PM : Phytamax RE : Robert Ernst (1979) SH : Schenk Hildebrandt (1972) VW : Vacin Went (1949) MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam nước có tài nguyên thuốc ng phú với nhiều thuốc quý như: Sâm ngọc linh ( Panax vietnamensis), thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo), đảng sâm ( Codonopsis pilosula), ba kích (Morinda officinalis How)…thuộc nhiều họ thực vật khác Tuy nhiên nguồn thuốc Việt Nam dần cạn kiệt hoạt động khai thác bừa bãi, công tác bảo tồn yếu kém, khu bảo tồn thiên nhiên rừng quốc gia [7] Họ lan (Orchidaceae) họ thực vật có đa dạng cao chủng loại Đây họ tiếng u thích có hoa đẹp, nhiều màu sắc hình dáng, mà cịn có nhiều loài lan thuộc họ vị thuốc chữa bệnh công hiệu, quý Thanh đạm ( Coelogyne cristata), lan kiếm (Cymbidium), lan kim tuyến (Anoectochilus)…[8] Trong phải kể đến lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.) lồi khơng nhữ ng có đẹp mà cịn loại thảo dược có giá trị kinh tế cao khả chữa trị bệnh ung thư, cao huyết áp, kháng khuẩn, bệnh gan, tim mạch… Lan kim tuyến phân bố rộng Việt Nam dùng làm cảnh chúng bị thu hái đến mức cạn kiệt tự nhiên [15] Bên cạnh đó, tự nhiên lan thường nhân giống chủ yếu hình thức sinh sản vơ tính (nhân chồi) hạt với hệ số nhân k mầm thấp nên số lượng lại [52] Hiện nay, lan Kim Tuyến đuợc cấp báo thuộc nhóm IA Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác mục đích thương mại nhóm thực vật rừng nguy cấp ENA1 a, c, d, sách đỏ Việt Nam (Bộ Khoa học Công nghệ, 2007) [1] Công nghệ nhân giống invitro xem phương pháp hữu hiệu việc nhân nhanh bảo tồn nhiều loài lan quý hệ số nhân giống cao, bệnh đồng mặt di truyền [15, 58] Năm 2010 2012 tác giả Phùng Văn Phê, Phan Ngọc Khoa cộng nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan kim tuyến này, nhiên hiệu nhân chồi chưa cao, quy trình chưa rõ ràng Vì , tiếp tục nghiên cứu để đưa quy trình nhân giống cụ thể, hiệu nhân giống cao 29 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả kích thích tăng trưởng chồi lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy Chất ĐHST Khả sinh trưởng chồi (mg/L) Chiều BA NAA dài chồi (cm) Số Số đốt/ lá/chồi Đặc điểm chồi chồi 2,5 - 5,17c 3,49d 3,67c Chồi xanh đậm, đốt thân dài, phát triển tốt 2,5 0,5 5,30c 4,22c 4,18b Chồi xanh đậm, đốt thân ngắn, phát triển tốt 2,5 1,0 8,56a 5,54a 5,19a Chồi xanh đậm, đốt thân dài, phát triển tốt 2,5 1,5 7,02b 5,09b 4,26b Chồi xanh đậm, đốt thân dài, phát triển tốt 2,5 2,0 5,41a 4,14c 4,20b Chồi xanh đậm, đốt thân dài, phát triển tốt Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p