TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Giới thiệu về cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
Kim ngân, hay còn gọi là Lonicera japonica Thunb, thuộc họ Kim ngân (Caprifoliaceae) và được phát hiện lần đầu ở Châu Á Chi Kim Ngân có hơn 150 loài, phân bố rộng rãi từ Bắc Mỹ, phía Nam Eurasia, Bắc châu Phi, Philippines cho đến Tây Nam Malesia Nhiều loài trong họ Kim Ngân đã được trồng trong điều kiện canh tác, trong đó giống "Halliana" đã được nhân rộng và phát triển ở nhiều khu vực.
Kim ngân, thuộc họ Kim ngân (Caprifoliaceae), là loại dây leo với thân quấn và phân cành nhiều Lá mọc đối, hình trái xoan, kích thước khoảng 3 - 7 x 2 - 3 cm, không lông, mặt trên nhẵn bóng và mặt dưới hơi nhạt màu Hoa mọc thành cụm xim, thường xuất hiện từng đôi từ kẽ lá, tập trung ở đầu cành với cuống lá rất ngắn và lá bắc dạng lá Hoa hình ống màu trắng, sau ngả vàng nhạt, có mùi thơm, dài từ 3 - 4 cm, với đài nhỏ Cánh hoa gồm 5 cánh, trong đó 2 cánh hợp thành 1 môi ngắn hơn nhiều so với ống hoa Hoa có 5 nhị nhỏ, vòi nhụy dài hơn nhị Quả hình trứng, dài khoảng 0,5 - 0,6 mm, chứa 1 hạt nhỏ.
Cây phát triển mạnh mẽ trong mùa xuân hè và vào mùa thu đông chỉ còn lại củ trong đất Thời điểm này là lúc cần thu hoạch củ Sau 3-4 năm trồng và chăm sóc, cây sẽ cho thu hoạch củ (Đỗ Tất Lợi, 2001).
2.1.4 Đặc điểm sinh thái và phân bố
Kim ngân là loài cây ưa ẩm và sáng, thường mọc hoang ở các vùng rừng núi Loài cây này có khả năng thích nghi với nhiều điều kiện khí hậu và đất đai khác nhau, chủ yếu phân bố ở khu vực cao và trung du miền núi Kim ngân phát triển tốt ở độ cao từ 500-2000m so với mực nước biển, với nhiệt độ trung bình khoảng 20-23°C và độ ẩm từ 83-86% Cây thường xuất hiện ở các vị trí chân và sườn đồi, thích hợp với loại đất thịt nhẹ.
Phân bố: Kim ngân mọc hoang hay được trồng nhiều ở các tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lào Cai, Ninh Bình,… (Võ Văn Chi, 1997).
Giá trị của cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
Cây Kim ngân hiện đang bị thu hái và bán cho thương lái với giá trên 30 nghìn đồng/kg tươi, chủ yếu xuất khẩu sang Trung Quốc Sự săn lùng ráo riết để cung cấp cho thị trường Đài Loan và Trung Quốc đã dẫn đến tình trạng cạn kiệt nguồn dược thảo quý này ở nước ta.
Từ lâu con người đã biết đến và sử dụng cây Kim ngân để làm thuốc
Cây Kim ngân được cho là có nhiều tác dụng như thanh nhiệt, giải độc, và chữa trị các vấn đề về da như mụn nhọt, lở ngứa, và dị ứng Người dân thường sử dụng hoa cây Kim ngân, bên cạnh đó, cành và lá cũng được dùng để nấu nước tắm.
Những nghiên cứu về nhân giống Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
2.3.1 Những nghiên cứu về nhân giống Kim ngân (Lonicera japonica
Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về hoạt chất của Kim ngân, nhưng các công trình về nhân giống, bảo tồn và phát triển loài vẫn còn hạn chế Nghiên cứu của Jiang et al (2012) cho thấy việc nhân giống Kim ngân bằng cách sử dụng cành nhánh trong môi trường WPM mang lại kết quả khả quan, với loài Lonicera japonica Thunb đạt tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là 3,4 chồi/đoạn Nồng độ 2.0 mg/l IBA kết hợp với 2.5 mg/l IAA cho tỷ lệ ra rễ tốt nhất lên đến 95% Lin et al (2008) đã so sánh các đặc điểm hình thái của nguồn gen Kim ngân nhằm chọn giống có dược liệu hoa lớn và nặng Guo et al (2007) nghiên cứu ảnh hưởng của ABT1 và NAA đến khả năng ra rễ của hom giâm thân bánh tẻ Kim ngân, cho thấy hom thân ngâm trong ABT1 (150 mg/L) trong 30 phút cho kết quả ra rễ tốt nhất Ngoài ra, nghiên cứu của Lan et al (2006) chỉ ra rằng nồng độ 100 mg/l IBA ngâm trong 30 phút hoặc NAA 75 mg/l trong 40 phút đạt tỷ lệ hom ra rễ cao nhất.
2.3.2 Những nghiên cứu về nhân giống Kim ngân (Lonicera japonica
Kim ngân có thể được nhân giống bằng phương pháp hữu tính hoặc vô tính như gieo hạt, giâm hom và nuôi cấy mô tế bào Tại Việt Nam, loài cây này đã được nghiên cứu và phát triển bảo tồn Một nghiên cứu của Hoàng Thị Thùy Dương (2015) về cây Kim ngân rừng (Lonicera bournei Hemsl ex Forb & Hemsl.) tại khu bảo tồn thiên nhiên Phia Oắc - Phia Đén, tỉnh Cao Bằng đã chỉ ra rằng chất kích thích ra rễ có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình hình thành mô sẹo, với IAA 750 ppm đạt tỷ lệ mô sẹo cao nhất là 91,11% Nồng độ NAA 750 ppm mang lại tỷ lệ hom sống cao nhất, trong khi tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt 46,67% ở công thức IBA 1000 ppm.
Nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống vô tính cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) cho thấy thời điểm giâm cành tối ưu là vào ngày 15 tháng 8 Cành bánh tẻ được giâm trên nền cát có thời gian nảy mầm và ra rễ nhanh chóng, đồng thời đạt tỷ lệ nảy mầm, ra rễ và tỷ lệ sống cao nhất (Trần Danh Việt, 2006) Đề tài này còn hướng tới việc khai thác và phát triển các nguồn gen dược liệu từ Kim ngân hoa.
Nghiên cứu "Huyền sâm" của Viện Y học cổ truyền Quân đội từ năm 2011 đến 2015 đã thiết lập quy trình nhân giống, trồng, chăm sóc, thu hoạch và sơ chế Kim ngân hoa, đồng thời xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sạch theo tiêu chuẩn GACP Kết quả cho thấy, cả mẫu Kim ngân hoa trồng theo GACP và trên thị trường đều có sự hiện diện của acid chlorogenic với hàm lượng trung bình lần lượt là 35,6% và 33,4% Đặc biệt, mẫu trồng theo GACP có hàm lượng acid chlorogenic đạt 2,56%, trong khi mẫu trên thị trường chỉ đạt 2,14% Tuy nhiên, nghiên cứu chưa thực hiện chọn giống và xây dựng vườn giống gốc, dẫn đến nguy cơ mất nguồn gen quý giá.
Nhóm nghiên cứu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia
Hà Nội công bố kết quả đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh cây Kim Ngân
Nghiên cứu về Lonicera japonica Thumb đã thành công trong việc xây dựng quy trình nhân nhanh cây Kim Ngân qua phương pháp tạo mô sẹo in vitro Sử dụng mảnh lá non và đỉnh chồi trong môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng, đề tài đã xác định đỉnh chồi trên môi trường MS với 0,5mg/l BAP là vật liệu tối ưu, đạt tỷ lệ hình thành mô sẹo 92,31% sau bốn tuần, với chiều dài trung bình 1,8cm Các khối mô sẹo sau đó được chuyển sang môi trường MS có 0,5mg/l BAP và tăng sinh nhanh chóng gấp năm lần chỉ sau hai tuần Đặc biệt, chồi được tái sinh tốt nhất trong môi trường MS bổ sung 1mg/l, với 100% khối mô sẹo có khả năng tái sinh từ 14 đến 20 chồi.
Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.4.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nhân giống vô tính là phương pháp nhân giống thông qua các cơ quan dinh dưỡng như thân, lá, vỏ, củ, với các kỹ thuật như giâm cành, chiết cành, mắt ghép và nuôi cấy mô in vitro Trong đó, nuôi cấy mô được xem là phương pháp hiệu quả nhất, cho phép nuôi cấy in vitro các nguyên liệu như đoạn thân, đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mô trong điều kiện vô trùng để tạo ra mô hoặc cây hoàn chỉnh Phương pháp này có ưu điểm là hệ số nhân giống cao, giúp tạo ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn, có thể thực hiện quanh năm mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên, đồng thời tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của cây ban đầu.
2.4.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.4.2.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật
Haberlandt (1902) là người tiên phong trong việc đề xuất nuôi cấy mô tế bào thực vật, dựa trên quan điểm rằng mỗi tế bào của sinh vật đa bào đều có khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Nguyên lý cốt lõi của nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng di truyền, nơi mỗi tế bào chứa đầy đủ thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể Trong điều kiện thích hợp, bất kỳ tế bào nào cũng có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh, thể hiện đặc tính toàn năng di truyền Hiện nay, đã có nhiều thành công trong việc phát triển tế bào hoặc bộ phận của cây thành một cá thể hoàn chỉnh.
2.4.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa
Cơ thể thực vật là một chỉnh thể thống nhất, bao gồm nhiều cơ quan được hình thành từ các loại tế bào khác nhau với chức năng riêng biệt Tất cả các tế bào này đều bắt nguồn từ tế bào hợp tử, và ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia để tạo ra nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng chuyên biệt Sau đó, các tế bào phôi sinh này tiếp tục phân chia và biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô và cơ quan khác nhau (Trịnh Đình Đạt, 2009).
Sự phân hóa tế bào là quá trình chuyển đổi từ các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, mỗi loại đảm nhận những chức năng khác nhau Quá trình này thể hiện sự phát triển và phân chia nhiệm vụ trong cơ thể sống, góp phần vào sự hình thành và duy trì các chức năng sinh lý quan trọng.
Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa
Mặc dù tế bào đã phân hóa thành các tế bào chuyên biệt, chúng vẫn giữ khả năng biến đổi Trong những điều kiện thích hợp, tế bào có thể trở lại trạng thái tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình này được gọi là phản phân hóa tế bào, trái ngược với sự phân hóa tế bào.
Tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa
Phản phân hóa tế bào
Hình 2.2: Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa và ức chế các gen trong sự phát triển của cá thể Trong giai đoạn nhất định, một số gen bị ức chế sẽ được kích hoạt để biểu hiện tính trạng mới, trong khi những gen khác sẽ ngừng hoạt động Quá trình này được mã hóa trong DNA của mỗi tế bào, đảm bảo sự phát triển hài hòa của cơ thể thực vật Thêm vào đó, tế bào trong khối mô thường bị ảnh hưởng bởi các tế bào xung quanh, nhưng khi tách riêng hoặc giảm kích thước khối mô, sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen trong tế bào.
2.4.3 Ý nghĩa, ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 2.4.3.1 Ý nghĩa
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp nhân giống vô tính hiệu quả cho nhiều loài thực vật quý hiếm và có giá trị kinh tế cao, đặc biệt khi gặp khó khăn trong nhân giống hữu tính Dù một số loài có hệ số nhân cao khi nhân giống bằng hạt, việc áp dụng nhân giống vô tính in vitro vẫn cần thiết vì cây con có thể không giống hoàn toàn bố mẹ về hình thái và thành phần hóa học Sự không đồng nhất này gây khó khăn trong sản xuất công nghiệp do chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm Đặc biệt, trong trường hợp cây thuốc, sự không đồng nhất về hàm lượng hoạt chất sinh học có thể dẫn đến nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất.
Phương pháp nhân giống in vitro mang lại nhiều lợi ích vượt trội so với các phương pháp truyền thống Cụ thể, cây con được tạo ra từ nuôi cấy mô không chỉ trẻ hóa và sạch bệnh, mà còn có khả năng sinh trưởng và năng suất cao Phương pháp này giúp tạo ra cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn các tính trạng đã chọn lọc, và tạo dòng thuần cho các cây tạp giao Ngoài ra, nó còn cho phép sản xuất cây với genotip mới, bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen, cũng như khả năng sản xuất quanh năm Đặc biệt, phương pháp này có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong điều kiện sinh thái nhất định và đạt hệ số nhân giống cực kỳ cao, rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất đại trà, đồng thời tạo ra cây sạch bệnh virus.
Phương pháp nuôi cấy in vitro có nhược điểm chính là yêu cầu trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao, vì vậy chỉ hiệu quả với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác Ngoài ra, phương pháp này còn gặp phải một số bất lợi như: cây con thu được thường có kích thước nhỏ và cần chế độ chăm sóc đặc biệt sau giai đoạn ống nghiệm; cây có thể mang những đặc tính không mong muốn; nguy cơ tạo đột biến tăng cao; khả năng tái sinh có thể bị mất do cấy truyền callus hoặc huyền phù tế bào nhiều lần; và cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt.
2.4.4 Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật
Chất auxin tự nhiên chủ yếu trong thực vật là Indol axetic acid (IAA), cùng với các hợp chất như 4-Cloroindol-3-axetic acid (A4-C1-IA) và Indol-3-butyric acid (IBA) IAA tập trung nhiều ở các chồi, lá đang sinh trưởng, tầng phát sinh, hạt lớn và phấn hoa, có tác dụng kích thích sự kéo dài tế bào và hình thành rễ Các dẫn xuất của IAA như Naphthalene axetic acid (NAA) và 2,4-Diclophenoxy acid (2,4 D) cũng rất quan trọng trong sự phân chia mô và hình thành rễ NAA, auxin nhân tạo mạnh hơn IAA, không chỉ tăng hô hấp của tế bào mà còn tăng hoạt tính enzym, ảnh hưởng đến trao đổi chất nitơ và khả năng tiếp nhận đường trong môi trường NAA đóng vai trò thiết yếu trong phân chia tế bào và tạo rễ.
Auxin là hormone thực vật được tổng hợp chủ yếu ở các mô non, đặc biệt là ở lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những khu vực này, auxin được vận chuyển xuống các phần phía dưới của cây, đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và điều chỉnh tăng trưởng của cây.
Cytokinin là một chất điều hòa sinh trưởng quan trọng, có khả năng thúc đẩy sự phân chia tế bào Hai loại cytokinin phổ biến là Kinetin và 6-Benzyl aminopurin (BA) Kinetin được phát hiện ngẫu nhiên bởi Skoog trong chiết xuất acid nucleic và thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine.
BA là hợp chất tổng hợp nhân tạo, có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và hạn chế quá trình lão hóa So với Kinetin, hoạt tính của BA cao hơn Các chất này cũng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất, tổng hợp ADN, tổng hợp protein và tăng cường hoạt tính của một số enzym Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử liên quan đến sự tương tác của cytokinin với nucleoprotein, làm yếu liên kết giữa histone và ADN, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự tổng hợp ADN (Lê Trần Bình, 1997) (Bộ NN&PTNT, 2005).
Nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) chỉ ra rằng sự phát triển của tế bào không chỉ phụ thuộc vào hormone sinh trưởng nội sinh mà còn bị ảnh hưởng bởi các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh Sự phân chia, phân hóa và biệt hóa tế bào được điều khiển bởi sự tương tác giữa các hormone này Auxin và cytokinin phối hợp với nhau đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và hình thái của tế bào và mô Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thúc đẩy sự hình thành rễ, trong khi tỷ lệ thấp hỗ trợ quá trình phát sinh chồi, và tỷ lệ cân bằng thuận lợi cho sự phát triển của mô sẹo Das (1958) và Nitsch (1968) nhấn mạnh rằng sự kết hợp đồng thời của auxin và cytokinin cần thiết để kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN và phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972), auxin kích thích giai đoạn đầu của quá trình phân bào, trong khi giai đoạn tiếp theo yêu cầu sự tác động tổng hợp của cả hai hormone.
Cytokinin, được xác định vào năm 1957, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia tế bào, đặc biệt là trong việc điều khiển chuyển pha trong mô, giúp duy trì quá trình này diễn ra một cách bình thường Hormone này được tổng hợp chủ yếu bởi rễ và các hạt đang phát triển (Lê Trần Bình, 1997; Bộ NN&PTNT, 2005).
2.4.5 Quy trình nhân giống in vitro
Quy trình nhân giống vô tính in vitro thực vật có thể phân chia thành 5 giai đoạn sau (Debergh, 1991):
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) được trồng tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp.
Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, chất khử trùng đến tỷ lệ vô trùng mẫu cấy Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) giai đoạn sau in vitro
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1.Phương pháp khử trùng mẫu tạo vật liệu vô trùng
Phương pháp khử trùng mẫu cấy bắt đầu bằng việc rửa mẫu khởi đầu, lấy từ cây mẹ tại vườn giống gốc, dưới vòi nước chảy để loại bỏ các phần không cần thiết Mẫu sau đó được ngâm trong nước xà phòng loãng trong 5 phút và tiếp tục rửa để loại bỏ chất bẩn và xà phòng Tiếp theo, mẫu được khử trùng trong tủ cấy vô trùng bằng cách rửa với cồn 70% trong 60 giây, sau đó loại bỏ cồn bằng nước cất vô trùng Cuối cùng, mẫu được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 trong các khoảng thời gian khác nhau theo công thức thí nghiệm đã được bố trí.
Thí nghiệm 1 : Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng (0 - 20 phút) bằng dung dịch HgCl 2 với nồng độ 0,1%; 0,2%; 0,5% đến khả năng tạo mẫu vô trùng
Môi trường nuôi cấy là MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung sucrose (20g), agar (6,5g/l), pH= 5,7 - 5,8
Các công thức được sắp xếp ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 10 mẫu Chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu sống không nhiễm Thời gian theo dõi là 2 tuần.
3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân
Sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trường khởi động, những mẫu sống vô trùng sẽ được cấy chuyển sang môi trường kích thích các chồi mới hình thành, là môi trường MS có bổ sung 30g saccarose/ lít, 6g/l agar và chất cytokinin BAP ở các nồng độ khác nhau Các công thức thí nghiệm được bố trí như sau: Thí nghiệm 2 : Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP (0 - 5 mg/l) đến khả năng nhân nhanh chồi của mẫu nuôi cấy
Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường khởi đầu, mẫu sẽ được chuyển sang môi trường MS đặc có bổ sung BAP với các nồng độ 0, 1, 2, 3, 4 và 5 mg/l Nồng độ BAP đạt hệ số nhân cao nhất sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 3.
Chỉ tiêu theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy: Hệ số nhân chồi, chất lượng chồi
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân
Môi trường MS + nồng độ BAP thích hợp trong thí nghiệm 2 bổ sung thêm auxin (NAA) theo dãy nồng độ: 0, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/l
Các thí nghiệm 2,3 được thực hiện theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần nhắc lại, mỗi lần gồm 10 mẫu Chỉ tiêu theo dõi là hệ số nhân chồi, và thời gian theo dõi cho mỗi lần cấy chuyển là 4 tuần.
3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích đến khả năng ra rễ của Kim ngân
Các mẫu chồi đạt tiêu chuẩn về chiều cao và lá sẽ được chuyển sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để phát triển thành cây hoàn chỉnh Môi trường tạo rễ bao gồm các thành phần cơ bản như 30g/l đường, 6g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng như NAA, IBA, IAA với các nồng độ khác nhau Các thí nghiệm về quá trình tạo rễ được thiết kế một cách khoa học để đạt hiệu quả tối ưu.
Thí nghiệm 4 : Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA (0; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 2,5 mg/l) đến khả năng ra rễ của mẫu nuôi cấy
Thí nghiệm 5 : Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 0; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l;
1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 2,5 mg/l) đến khả năng ra rễ của mẫu nuôi cấy
Các thí nghiệm được tiến hành trên môi trường cơ bản với thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên, bao gồm 3 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại có ít nhất 10 mẫu, tổng cộng có hơn 30 mẫu cho mỗi thí nghiệm.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ ra chồi tạo rễ, số lượng rễ/cây và chất lượng rễ sau 2-4 tuần Điều kiện nuôi cấy trong phòng nuôi:
Quá trình nuôi cấy bao gồm các giai đoạn khởi đầu, nhân chồi và tạo cây hoàn chỉnh, tất cả đều diễn ra trong điều kiện nhân tạo Để đảm bảo sự phát triển tối ưu, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm cần được duy trì ở mức phù hợp.
- Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng từ 2000 - 25000 lux, thời gian chiếu sáng 8 - 10h/ngày
- Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì 25 0 C ± 2 0 C
- Độ ẩm thường xuyên duy trì 60 - 70%
3.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) giai đoạn sau in vitro
Trước khi cấy cây con từ bình ra vườn ươm, cần chuyển các bình cây ra ngoài môi trường tự nhiên để cây làm quen với điều kiện bên ngoài, quá trình này gọi là huấn luyện cây Cây nên được đặt ở điều kiện tự nhiên trong khoảng 15 ngày, lưu ý không để ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình Sau thời gian này, cây con sẽ được rửa sạch thạch và cấy vào giá thể phù hợp.
CT2: 80% Đất tầng A : 20% Phân chuồng hoai mục
CT3: 50% Đất tầng A + 50% Phân chuồng hoai mục
Chỉ tiêu theo dõi trong nghiên cứu bao gồm tỷ lệ sống và biến động chiều cao, với thời gian theo dõi là 45 ngày Các thí nghiệm được thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên và có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại bao gồm 15 mẫu.
3.3.5 Phương pháp theo dõi, thu thập và xử lý số liệu
- Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau:
Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = Ʃ mẫu nảy chồi (mẫu) × 100% Ʃ mẫu cấy ban đầu (mẫu)
Tỷ lệ cây sống (%) = Ʃ cấy sống sót (cây) × 100% Ʃ cây ra ngôi (cây)
Hệ số nhân chồi (lần) = Ʃ chồi thu được (chồi) Ʃ chồi cấy ban đầu (chồi)
Chiều cao TB (cm) = Ʃ chiều cao mẫu theo dõi (cm) Ʃ mẫu ban đầu (mẫu)
Sử dụng phần mềm thống kê sinh học để xử lý số liệu.
