Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng lan huệ (hippeastrum equestre) 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thu Thủy NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ (Hippeastrum equestre) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thu Thủy NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ (Hippeastrum equestre) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Trung Thành Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Trung Thành, thầy ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực hoàn thành luận văn Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch, TS Nguyễn Hạnh Hoa toàn thể tập thể cán bộ, nhân viên Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhiệt tình bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện sở vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè, người ln chia sẻ, động viên, giúp đỡ góp ý cho em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Thu Thủy i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BAP 6-benzylaminopurin CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance) ĐC Đối chứng IBA Indol butyric acid MS Murashige Skoog LSD0,05 Leant Significant Difference P - 0,05 ND Nước dừa α-NAA α-naphthylacetic acid ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung Lan huệ 1.1.1 Đặc điểm thực vật học phân bố Lan huệ 1.1.2 Giá trị kinh tế sử dụng 1.2 Một số phương pháp nhân giống vơ tính Lan huệ 1.2.1 Phương pháp tách củ 1.2.2 Phương pháp cắt lát 1.2.3 Phương pháp nhân giống in vitro 1.3 Quy trình sản xuất ni cấy mơ 20 1.3.1 Lấy mẫu xử lý mẫu 20 1.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 21 1.3.3 Nhân nhanh chồi 21 1.3.4 Tái sinh rễ 21 1.3.5 Chuyển vườn ươm 22 1.4 Tình hình nghiên cứu Lan huệ 22 1.4.1 Tình hình nghiên cứu Lan huệ giới 22 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Lan huệ Việt Nam 24 Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tượng 26 2.1.2 Vật liệu 27 iii 2.1.3 Điều kiện nuôi cấy 28 2.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 28 2.2.1 Giai đoạn nuôi cấy khởi động 29 2.2.2 Giai đoạn nhân nhanh 29 2.2.3 Giai đoạn tạo hoàn chỉnh 32 2.2.4 Giai đoạn vườn ươm 33 2.3 Các tiêu theo dõi 33 2.4 Phương pháp tiến hành 34 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 37 Chương - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu nuôi cấy cho nhân giống in vitro dòng Lan huệ 38 Xác định thời gian khử trùng thích hợp 38 3.2 Ảnh hưởng nhóm chất điều hịa sinh trưởng riêng rẽ phối hợp đến phát sinh chồi hệ số nhân từ vảy củ đôi 39 3.2.1 Ảnh hưởng BA tới phát sinh chồi mẫu nuôi cấy 40 3.2.2 Ảnh hưởng phối hợp BA Kinetin đến khả phát sinh chồi từ vảy củ đôi 41 3.2.3 Ảnh hưởng phối hợp hai nhóm chất auxin cytokinin đến khả nhân nhanh ch 3.3 Nghiên cứu khả phát sinh hình thái nhân nhanh từ đế củ .45 3.3.1 Ảnh hưởng 2,4-D tới khả phát sinh hình thái từ đế củ 45 3.3.2 Ảnh hưởng α-NAA tới phát sinh hình thái từ đế củ 46 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng BA α-NAA đến khả phát sinh hình thái từ đế củ 50 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro dòng Lan huệ 54 3.4.1 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro .54 3.4.2 Ảnh hưởng hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro 57 iv 3.5 Nghiên cứu rễ tạo hoàn chỉnh 57 3.5.1 Ảnh hưởng IBA tới khả rễ chất lượng rễ 58 3.5.2 Ảnh hưởng than hoạt tính tới khả rễ chất lượng rễ 61 3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng số loại giá thể đến tỷ lệ sống sinh trưởng phát triển Lan huệ sau in vitro vườn ươm 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66 Kết luận 66 Đề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến khả vào mẫu dòng Lan huệ (sau tuần) 39 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA đến khả phát sinh hình thái vảy củ đơi (sau tuần) 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng phối hợp BA Kinetin đến khả phát sinh hình thái vảy củ đơi (Sau tuần) 44 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BA, Kinetin α-NAA đến khả nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi (Sau tuần) 44 Bảng 3.5 Ảnh hưởng 2,4-D tới khả phát sinh hình thái từ đế củ (sau tuần) 48 Bảng 3.6 Ảnh hưởng α-NAA tới khả phát sinh hình thái từ đế củ (sau tuần) 48 Bảng 3.7 Ảnh hưởng BA α-NAA đến khả phát sinh hình thái in vitro từ đế củ (Sau tuần) 52 Bảng 3.8 Ảnh hưởng BA, Kinetin đến khả phát sinh chồi mô sẹo từ đế củ (Sau tuần) 52 Bảng 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau tuần) 56 Bảng 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro (sau tuần) 56 Bảng 3.11 Ảnh hưởng IBA tới khả rễ chất lượng rễ dòng Lan huệ (sau tuần) 60 Bảng 3.12 Ảnh hưởng than hoạt tính tới khả rễ chất lượng rễ dòng Lan huệ (sau tuần) 60 Bảng 3.13 Ảnh hưởng loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng phát triển Lan huệ sau in vitro(Sau4 tuần) 63 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre) Hình 1.2 Phương pháp cắt lát củ Lan huệ Hình 3.1 Ảnh hưởng BA đến khả phát sinh hình thái vảy củ đôi (Sau tuần) 41 Hình 3.3 Ảnh hưởng phối hợp BA, Kinetin α-NAA đến khả nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi (sau tuần) 45 Hình 3.4 Ảnh hưởng α-NAA đến khả tạo mô sẹo từ đế củ (sau tuần) 49 Hình 3.5 Ảnh hưởng BA α-NAA đến khả tạo mô sẹo từ đế củ (sau tuần) 51 Hình 3.6 So sánh ảnh hưởng BA α-NAA đến khả tạo mô sẹo từ đế củ (sau tuần ) 51 Hình 3.7 Ảnh hưởng BA, Kinetin đến khả phát sinh chồi từ mơ sẹo dịng Lan huệ H10 H18 (sau tuần) 54 Hình 3.8 Ảnh hưởng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau tuần) 55 Hình 3.9 Ảnh hưởng IBA tới khả rễvà chất lượng rễ dịng Lan huệ ni cấy in vitro (sau tuần) 59 Hình 3.10 Ảnh hưởng số loại giá thể đến tỷ lệ sống sinh trưởng phát triển Lan huệ sau in vitro vườn ươm 63 Hình 3.11 Ảnh hưởng số loại giá thểtới số lượng rễ chiều dài rễ in vitro dòng Lan huệ (sau tuần)…………………………………64 vii MỞ ĐẦU Lan huệ (Hippeastrum equestre)là lồi hoa u thích có tiềm phát triển năm gần Lan huệ trồng phổ biến để làm cảnh màu sắc đa dạng, khả thương mại cao hoa cắt cành trồng chậu cảnh hay vào dịp lễ, tết Bên cạnh đó, cịn thuốc chữa bệnh theo đơng y củ có chứa thành phần biệt dược có giá trị ankaloids [21], lectins có khả chống ung thư, cầm máu, chữa lành vết thương… Lan huệ Việt Nam nghèo nàn màu sắc (chủ yếu màu đỏ), thời gian hoa chúng lại muộn (khoảng từ tháng đến cuối tháng 5)nên khả phát triển lồi hoa cịn nhiều hạn chế.Bằng đường thu thập nguồn gen, lai hữu tính chọn lọc làm phong phú giống hoa Lan huệ nước ta Năm 2009 – 2010, Nguyễn Hạnh Hoa cộng chọn tạo hàng loạt lai có màu sắc lạ, đẹp, đa dạng, hoa có độ bền lâu có thời gian hoa đáp ứng thị trường, điển hình dịng H2, H4, H9, H10, H18 Tuy nhiên, dịng Lan huệ lại có nhược điểm sinh sản vơ tính (trong điều kiện tự nhiên), đặc biệt dòng Lan huệ H2, H4 H18 Do vậy, cá thể lai có đặc điểm ưu tú chọn lọc cần phải nhân giống vơ tính nhằm trì tính trạng ban đầu.Từ nhiều năm nay, để nhân giống vơ tính Lan huệ sử dụng phương pháp: Tách chồi củ nhỏ từ cụm mẹ; kỹ thuật cắt lát (Chipping); nhân giống hạt; sử dụng phương pháp nhân giống in vitro Mặc dù đơn giản hiệu nhân giống phương pháp truyền thống không cao thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp, không đồng không tạo bệnh Phương pháp nhân giống in vitro khắc phục nhược điểm tạo bệnh, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, đồng nhất, đáp ứng nhu cầu số lượng giống có chất lượng cao tính di truyền ổn định Để đánh giá trì nguồn vật liệu việc nghiên cứu nhân giống vơ tính dịng Lan huệ cần thiết Năm 2009 – CT$ ND0 ND20 ND40 ND60 ND80 SE(N= 5%LSD ND0 ND20 ND40 ND60 ND80 SE(N= 5%LSD ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - Ảnh hưởng hàm lượng đường tới chiều cao chồiin vitro(sau tuần) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V003H2 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V004H4 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V005H9 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL - * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V006H10 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V007H18 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) - TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FOR EFFECT CT$ MEANS Sac0 Sac20 Sac40 Sac60 Sac80 SE(N= 5%LSD Sac0 Sac20 Sac40 Sac60 Sac80 SE(N= 5%LSD - F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE FILE B3-11 Ảnh hưởng IBA tới số rễ/mẫu dịng Lan huệ ni cấy in vitro BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V003H2 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V004H4 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V005H9 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V006H10 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V007H18 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) - TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FOR EFFECT CT$ MEANS FILE B3-12-1 CT$ IBA0 IBA0,5 IBA1 IBA1,5 IBA2 SE(N= 5%LSD IBA0 IBA0,5 IBA1 IBA1,5 IBA2 SE(N= 5%LSD ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - Ảnh hưởng than hoạt tính tới số rễ/mẫu(sau tuần) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V003H2 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V004H4 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V005H9 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL - * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V006H10 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V007H18 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B3-13-1 5/12/14 15:57 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT$ - CT$ C0 C0,25 C0,5 C0,75 C1 SE(N= 3) 5%LSD 10DF CT$ C0 C0,25 C0,5 C0,75 C1 SE(N= 5%LSD ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 3) 10DF Ảnh hưởng loại giá thể đến số rễ Lan huệ sau in vitro (Sau tuần theo dõi) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V003H2 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V004H4 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V005H9 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V006H10 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V007H18 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FOR EFFECT CT$ MEANS FILE B3-14 CT$ C0 C0,25 C0,5 SE(N= 5%LSD C0 C0,25 C0,5 SE(N= 5%LSD - F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE BALANCED ANOVA ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V004H4 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V005H9 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V006H10 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE VARIATE V007H18 LN SOURCE OF VARIATION ============================================================================= CT$ * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FOR EFFECT CT$ MEANS C0 C0,25 C0,5 SE(N= 5%LSD CT$ C0 C0,25 C0,5 SE(N= 5%LSD ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - FILE B3-14-1 ... nhân giống in vitro hoa Lan huệ để nhân nhanh nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống Xuất phát từ yêu cầu đó, chúng tơi tiến hành đề tài:? ?Nghiên cứu nhân giống in vitro số dòng Lan. .. NHIÊN - Nguyễn Thị Thu Thủy NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ (Hippeastrum equestre) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420 114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI... rễ dòng Lan huệ nuôi cấy in vitro (sau tuần) 59 Hình 3.10 Ảnh hưởng số loại giá thể đến tỷ lệ sống sinh trưởng phát triển Lan huệ sau in vitro vườn ươm 63 Hình 3.11 Ảnh hưởng số