nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng lan huệ lai (hippeastrum equestre

3.2.2 Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp hai nhóm chất auxin/cytokinin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro từ vảy 3.3 N

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG

LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG

LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Nguyễn Trung Thành

Hà Nội – Năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Trung Thành, thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch, TS Nguyễn Hạnh Hoa và toàn thể tập thể cán

bộ, nhân viên trong Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện về cơ sở vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài này.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ

và góp ý cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Thu Thủy

LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P - 0,5

(Leant Significant Difference)

αNAANAA αNAA-naphthylacetic acid

MỤC LỤC

Trang Lời cảm ơn

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

2.1.1 Đối tượng 27

3.1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu và xác định vật liệu vào

mẫu thích hợp cho nhân giống in vitro các dòng Lan huệ lai 39

3.1.2 Xác định vật liệu vào mẫu thích hợp để tăng hệ số nhân chồi in

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng

riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

3.2.1 Ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy

42

3.2.2 Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp hai nhóm chất

auxin/cytokinin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro từ vảy

3.3 Nghiên cứu khả năng phát sinh hình thái và nhân nhanh từ đế củ

48 3.3.1 Ảnh hưởng của 2,4 D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ

48 3.3.2 Ảnh hưởng của αNAA-NAA tới sự phát sinh hình thái từ đế củ 49 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và αNAA-NAA đến khả năng phát

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất

3.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in

3.4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro

59

3.5.1 Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ 60 3.5.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ

63 3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống

và sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ lai sau in vitro

PHỤ LỤC 73

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng vào mẫu

của các dòng Lan huệ lai 40 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của vật liệu vào mẫu thích hợp tới khả năng phát

sinh chồi của các dòng Lan huệ lai 41 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của

vảy củ đôi 5 dòng Lan huệ lai 43 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng

phát sinh hình thái của vảy củ đôi (Sau 4 tuần) 46

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA, kinetin và α-NAANAA đến khả

năng nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi

(Sau 4 tuần) 46 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của 2,4 D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế

củ (sau 4 tuần nuôi cấy) 50 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của αNAA-NAA tới sự phát sinh hình thái từ đế củ 50

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của BA và α-NAANAA đến khả năng phát sinh hình

thái in vitro từ đế củ 54

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi

của mô sẹo từ đế củ của 5 dòng Lan huệ lai 54

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in

vitro của 5 dòng Lan huệ lai 58

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in

vitro của 5 dòng Lan huệ lai 58

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ của

5 dòng Lan huệ lai (sau 4 tuần) 62 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất

lượng rễ của 5 dòng Lan huệ lai (sau 4 tuần) 62 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng

và phát triển của cây Lan huệ lai sau in vitro 65

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.2 Phương pháp cắt lát củ cây Lan huệ 8

Hình 3.1 Các loại vật liệu nuôi cấy in vitro sau 2 tuần vào mẫu 42

Hình 3.2 Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của vảy

củ đôi (Sau 4 tuần) 44

Hình 3.3 Ảnh hưởng của BA, kinetin và α-NAANAA đến hệ số nhân chồi in

vitro từ vảy củ đôi (Sau 4 tuần) 47

Hình 3.4 Ảnh hưởng của sự phối hợp BA, kinetin và αNAA-NAA đến khả

năng nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi (sau 4 tuần) 48 Hình 3.5 Ảnh hưởng của α-NAANAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ (sau

4 tuần) 51

Hình 3.6 Ảnh hưởng của BA và α-NAANAA đến khả năng tạo mô sẹo

và tạo chồi từ đế củ (sau 4 tuần) 53

Hình 3.7 So sánh ảnh hưởng của BA và α-NAANAA đến khả năng

tạo mô sẹo từ đế củ của các dòng lai sau 4 tuần nuôi cấy 53

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nước dừa tới chất lượng chồi in vitro 57

Hình 3.10 Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ của

5 dòng Lan huệ lai nuôi cấy in vitro (sau 4 tuần) 61

Hình 3.11 Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh

trưởng và phát triển của cây Lan huệ lai sau in vitro ngoài

vườn ươm 65

MỞ ĐẦU

Lan huệ (Hippeastrum equestre) là một trong những loài hoa

được yêu thích và rất có tiềm năng phát triển trong những năm gần đây Lan huệ được trồng khá phổ biến để làm cảnh do màu sắc đa dạng, khả năng thương mại cao khi là hoa cắt cành hoặc được trồng trong chậu cảnh hay vào các dịp lễ, tết Bên cạnh đó, đây còn là cây thuốc chữa bệnh vì theo đông y trong củ của nó có chứa các thành phần biệt dược có giá trị như các ankaloids (Funganti, 1975), các lectins có khả năng chống ung thư, cầm máu, chữa lành vết thương…

Lan huệ ở Việt Nam hiện nay còn nghèo nàn về màu sắc (chủ

yếu là màu đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại khá muộn (khoảng

từ giữa tháng 3 đến cuối tháng 5) nên khả năng phát triển loài hoa

này còn rất nhiều hạn chế Bằng con đường thu thập nguồn gen,

lai hữu tính và chọn lọc có thể làm phong phú bộ giống hoa Lan Huệ ở nước ta Năm 2009 – 2010, Nguyễn Hạnh Hoa và cs đã chọn tạo ra hàng loạt con lai có màu sắc lạ, đẹp, đa dạng, hoa có độ bền lâu và có thời gian ra hoa đáp ứng đúng thị trường Điển hình

là các dòng H2, H4, H9, H10, H18 Tuy nhiên các dòng lai này lại

có nhược điểm là sinh sản vô tính kém (trong điều kiện tự nhiên), đặc biệt là các dòng lai H2, H4 và H18 Do vậy, những cá thể lai có đặc điểm ưu tú được chọn lọc cần phải nhân giống vô tính nhằm duy trì được tính trạng ban đầu.Từ nhiều năm nay, để nhân giống

vô tính cây Lan huệ có thể sử dụng các phương pháp: Tách chồi hoặc củ nhỏ từ cụm cây mẹ (Siddique và cs., 2007); kỹ thuật cắt lát (Chipping); nhân giống bằng hạt hoặc sử dụng phương pháp

nhân giống in vitro (Husey, 1975; Seabrook và cs., 1976; De

Buruyn, 1992; Chieh Li Huang và cs., 2005) Mặc dù đơn giản

nhưng hiệu quả khi nhân giống bằng phương pháp truyền thống không cao do thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp, cây không đồng nhất cũng như không tạo được cây sạch bệnh Phương

pháp nhân giống in vitro đã khắc phục được những nhược điểm đó

tạo được cây con sạch bệnh, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất, do vậy đáp ứng được nhu cầu về

số lượng giống có chất lượng cao và tính di truyền ổn định Để đánh giá và duy trì nguồn vật liệu thì việc nghiên cứu nhân giống

vô tính các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết Ở nước ta, Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2009,2010) đã bước đầu xác định được

một số kết quả nhất định để xây dựng quy trình nhân nhanh in

vitro hoa Loa kèn đỏ nhung (H equestre Herb.) và cây Lan huệ

mạng (H reticulatum var striatifolium) Bên cạnh việc kế thừa một

số kết quả trên cần phải có những nghiên cứu tiếp theo nhằm bổ

sung và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây hoa Lan huệ

để nhân nhanh nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống Xuất phát từ những yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành đề

tài:“Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng Lan huệ lai

(Hippeastrum equestre)”.

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây Lan huệ

1.1.1 Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Lan huệ

Lan huệ có tên khoa học: Hippeastrum esquetre Herb, thuộc họ

Liliaceae, bộ Hành ( Liliales), phân lớp Hành ( Liliidae), lớp thực vật một lá mầm (Liliopsida) [3],[4]

Tên của loài hoa này có rất nhiều cách để Việt hóa như: Loa kèn đỏ nhung, Lan huệ, Huệ đất, Lan tứ diện, Tứ diện, Tứ diện xích lan, Huệ loa kèn, Mạc chu lan Người châu Âu gọi là Valentine Flower bởi vì Lan huệ nở hoa trong khoảng đầu năm vào dịp lễ hội tình yêu (14/2).

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật học của cây Lan huệ ở Việt Nam:

Lan huệ có dạng thân hành, hình cầu, có áo mỏng bao ở ngoài [5].

a Lá cây

Lá tập trung ở gốc gần như thành 2 dãy, phiến lá hình dải, màu xanh đậm, kích thước (30)45-50(60) x 2-4(5)cm, hình kiếm hoặc hình dải mác, hơi khum thành hình máng, dai, cứng, có nhiều gân sọc song song và gân phụ ngang song song, mép hơi cong xuống, chóp tù Gốc lá dạng bẹ ôm lấy nhau Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, gồm 2 cái, mỏng, kích thước 6-7 x 3-4 cm, màu trắng xanh, mỏng,

2 chiếc, tồn tại.

b Hoa

Cụm hoa tán, 2- 4 hoa, trên một cuống hoa chung có hình trụ, dài 30-50 cm, đường kính 1,5-2 cm ,thẳng đứng và rỗng, mặt ngoài phủ phấn trắng Hoa to khi nở đường kính tới 15 cm, đều, lưỡng tính,màu sắc sặc sỡ, màu đỏ hoặc đỏ cam, có cuống dài 4-5

cm, gốc màu xanh hoặc xanh vàng hoặc vàng trắng.

Bao hoa hình phễu, dài 9-12 cm, nằm ngang hoặc rủ xuống, 6 mảnh, dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, dài 2-3,5

cm, họng có 1 vòng vảy ngắn hoặc 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, hình trứng xếp 2 vòng, các thùy bằng nhau hoặc các thùy vòng trong hẹp hơn Nhị 6; chỉ nhị rời nhau, hình trụ dài 6-7 cm, đầu hơi cong đính ở họng ống bao hoa, nghiêng về một phía; bao phấn hình trụ, dài 2-2,5 cm, màu trắng ngà,2 ô, đính lưng , hướng trong, mở bằng khe dọc.

Bầu hoa, dài 1,2-1,5 cm 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhụy dài tới 10 cm, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hoặc 3 thùy, màu trắng.

Hình 1.1: Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre)

c Củ và rễ

Củ con: Lan huệ có các củ con (thân hành con) sinh ra từ củ

mẹ, chu vi của củ con từ 3-6 cm, số lượng củ con trung bình từ 1-3 củ/cây.

Rễ:cây thuộc bộ Lilliales nên có hệ rễ chùm gồm nhiều rễ phụ

tương đối đồng đều về kích thước.

d Quả

Quả nang, hình cầu hoặc hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh Hạt nhiều, dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ.

1.1.1.2 Yêu cầu ngoại cảnh

Cây Lan huệ mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, được nhập vào Việt Nam, trồng trong vườn hoa, trong chậu Cây ra hoa vào mùa xuân- hè, do đó để hoa nở vào đúng dịp Tết thì các yếu

tố ngoại cảnh là điều kiện vô cùng quan trọng mà chúng ta cần chú ý đối với việc sinh trưởng phát triển của cây [2].

a Nhiệt độ

Lan huệ có khả năng chịu nóng, ưa khí hậu lạnh và ẩm Nhiệt

độ thích hợp ban ngày từ 20-28oC, ban đêm 13-17oC, dưới 5oC và trên 30oC cây sinh trưởng kém, hoa dễ bị mù Giai đoạn đầu nhiệt

độ thấp có lợi cho sinh trưởng của rễ và sự phân hoá hoa.

b Ánh sáng

Lan huệ là cây ưa cường độ ánh sáng trung bình, cường độ ánh sáng thích hợp từ 12.000-15.000lux nhất là thời kỳ cây cao 20- 30cm Người trồng Lan huệ luôn biết muốn điều khiển độ dài của

lá và chiều cao của vòi hoa, chỉ cần điều tiết ánh sáng Cây nhiều ánh sáng có vòi hoa và lá ngắn, cây mọc trong bóng râm thường cao và lá dài.

c Nước

Thời kỳ đầu cây rất cần nước, khi ra hoa giảm bớt nước Nhiều nước dễ làm cho củ bị thối, rụng nụ Độ ẩm đất thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của cây (thường từ 70-85%).

d Đất

Đất tơi xốp, không chứa mầm bệnh và thoát nước tốt Lan huệ rất mẫn cảm với muối, nồng độ muối trong đất cao, cây không hút được nước ảnh hưởng tới sinh trưởng, ra hoa Nói chung, hàm lượng

muối trong đất không được cao quá 1,5mg/cm2, lượng hợp chất Clo không được vượt quá 1,5mmol/lít, pH = 6,5-7,0.

1.1.1.3 Phân bố

Cây Lan huệ có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được trồng khắp Châu

Mỹ nhiệt đới, từ Mêhico và phía Nam Tây Ấn đến Brazil và Chile

[4],[5] Chi Hippeastrum hiện có 70- 76 loài Ở Việt Nam, chi Hippeastrum có 2

loài, 1 thứ thường được trồng làm cảnh

1.1.2 Giá trị kinh tế và sử dụng

Trên thế giới, nhiều loài thuộc chi Hippeastrum được trồng

làm cảnh bởi chúng có ưu điểm là hoa to, đẹp, khá đa dạng về màu sắc, có thể sử dụng dưới dạng hoa cắt cành, trồng chậu hoặc trồng thảm Hoa được sử dụng trong ngày lễ, ngày tết, được trang trí trong nội thất, hoặc làm quà tặng rất trang trọng Hoa mang hương thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, làm tăng vẻ đẹp, tăng sức sống cho mọi người [6].

Ở Việt Nam, hoa được sử dụng trong những ngày lễ, ngày tết, được trang trí trong hội trường, công viên, làm quà tặng rất trang trọng, trong gia đình hoa mang hương thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, làm tăng vẻ đẹp, tăng sức sống cho mọi người.

Trong Đông dược, Lan huệ là một vị thuốc quan trọng vì củ

có vị ngọt cay, tính ấm có độc, có tác động tán ứ, tiêu thũng Thân hành của cây được dùng giã nát đắp cầm máu và trị tổn thương khi té ngã.

Bên cạnh đó, Lan huệ (Hippeastrum equestre) là một trong những loài hoa có tiềm năng phát triển của chi Hippeastrum do củ

của nó có chứa các biệt dược giá trị như các loại alkaloids (Funganti, 1975), các lectins có hoạt tính chống siêu vi trùng, chống sưng viêm, chống ung thư, chữa bệnh Alzheimer, cầm máu

và chữa vết thương Các alkaloids trong Lan huệ đang được nghiên

cứu về một số tác động dược học Trong số các alkaloids, lycorine

(tên cũ Narcissine) là chất được chú ý nhất Narcissine được cô lập

vào 1578, là một alkaloid rất bền Đến 1920, narcissine được chứng minh là có cùng cấu trúc với lycorine, trích từ Lycoris radiata, và từ đó tên Narcissine bị bỏ Lycorine là một alkaloid loại isoquinolone (chuyển hóa từ phena thridine), có phân tử lượng 287.32, có các hoạt tính sinh học loại cholino mimetic; ức chế hoạt tính sinh học của men acetylcholinesterase Các hoạt tính của Lycorine có tác dụng chống siêu vi trùng, có tác dụng chống sưng- viêm do ức chế sự sản xuất TNF-alpha (tumor necrosis factor) nơi các đại thực bào của chuột thử nghiệm; ức chế tiến trình sinh tổng hợp proteins Vì TNF-alpha là một chất cytokine căn bản điều hòa tiến trình sưng viêm nên lycorine có triển vọng được dùng làm thuốc chống sưng, trị thấp khớp

Ở Việt Nam hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre) hầu như chỉ có màu đỏ,

hoa nở trong 1 thời gian ngắn còn quanh năm nó chỉ có màu lá xanh biếc Hoa Lan

huệ chỉ trổ bông mỗi năm một lần, có khi đôi lần nhưng không nhiều cây được như thế [6].

1.2 Một số phương pháp nhân giống vô tính cây Lan huệ

1.2.1 Phương pháp tách củ con

Trong quá trình sinh trưởng phát triển, một củ Lan huệ có thể

đẻ ra nhiều củ con ở xung quanh Có thể tách những củ con đem trồng Củ con sau khi tách có khả năng sống rất cao và sớm cho hoa, thông thường sau 18-24 tháng cây sẽ cho hoa.

Khi đường kính củ con được 2-3 cm thì tách khỏi cây mẹ, có thể trồng trong chậu đất hoặc chậu nhựa, nếu trồng trong chậu đất thì cần phải tưới nước thường xuyên hơn là trong chậu nhựa Nhúng phần đế của củ cùng với bộ rễ trong nước ấm, điều này có tác dụng làm mềm rễ và thuận lợi cho bộ rễ lan ra khắp chậu Khoét một hố trên bề mặt đất rộng hơn đường kính củ, đặt củ vào

hố sao cho 1/3 củ nổi trên mặt đất [17].

1.2.2 Phương pháp cắt lát

Kỹ thuật cắt lát (chipping) được sử dụng khá phổ biến nhất là đối với những cây họ Hành có củ (là những lớp vảy xếp khít nhau

xung quanh đỉnh sinh trưởng trung tâm) như chi Hippeastrum,

Narcissus (hoa thủy tiên), Galanthus Các bước tiến hành [17]:

1 Chọn những củ Lan huệ bố mẹ khoẻ mạnh không bị nấm bệnh, nhổ củ khi củ còn ở trạng thái ngủ nghỉ.

2 Dùng dao sắc nhọn sao cho khi cắt lát cắt phẳng, mịn không làm dập nát củ Khử trùng bề mặt củ và dao cắt.

3 Cắt bớt phần rễ và phần trên của củ, dùng dao cắt dọc chia đôi củ từ đỉnh củ xuống phần đế củ, tiếp tục chia nhỏ các nửa hành sao cho mỗi lát đều mang một phần đế củ Một củ có thể chia thành 8-16 lát.

4 Các lát được ngâm trong dung dịch thuốc diệt nấm khoảng 10-15 phút lắc đều, sau đó được vớt ra để ráo nước.

5 Cho mỗi lát vào trong 1 túi nilon có chứa đá trân châu có thêm chất khoáng, cho nhiều khí vào túi và buộc kín túi Đưa vào nơi mát và tối với nhiệt độ thích hợp 20-21oC, thường xuyên kiểm tra dấu hiệu thối hỏng.

6 Sau khoảng 12 tuần các hành con sẽ xuất hiện ở gốc của lát cắt Tách các cây con trồng vào giá thể tơi xốp và thoát nước Cây con rất bé và yếu ớt nên cần đặt dưới ánh sáng tán xạ một thời gian trước khi đưa ra ngoài ánh sáng trực tiếp

Phải mất khoảng 2-4 năm cây mới sinh trưởng phát triển thành thục và cho hoa Ở Việt Nam, mùa đông không có tuyết và sương giá nên cây sẽ lớn nhanh hơn và cho hoa sớm hơn so các nước ở xứ lạnh.

Nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát củ đã được rất nhiều

nhóm tác giả nghiên cứu cả trong điều kiện in vivo và in vitro.

Epharath và cs (2001) đã sử dụng 7 phương pháp cắt củ [17], chia

củ mẹ thành 2, 4, 8, 12, 16, 32 và 48 lát cắt, mỗi lát cắt đều mang

1 phần đế củ và giâm vào túi nilon có chứa chất khoáng bón cho cây Các túi này được đặt trong điều kiện nhiệt độ 230C trong 4 tháng Kết quả cho thấy, khi cắt củ thành 48 phần thì sô lượng chồi thu được là cao nhất, 34 chồi/mẫu Năm 1991, O’Rourke và cs., cắt

củ nhỏ in vitro tạo ra từ vảy củ đôi trên môi trường tạo củ của loài

Hippeastrum hybridum "Apple Blossom” thành 2 hoặc 4 phần và

tiếp tục nuôi cấy trong 10 - 12 tuần Sau 26 - 28 tuần nuôi cấy, hệ

sô nhân thu được đã tăng lên 100 chồi/mẫu ban đầu [22] Bằng phương pháp cắt củ này, Slabbert và cs (1993) cũng đã thu được

700 - 1000 cây từ 1 củ ban đầu sau 12 tháng, cây con thu được khỏe, có sức sống cao [25].

Hình 1.2 Phương pháp cắt lát củ cây Lan huệ

1.2.3 Phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp này có ưu điểm là tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên cây có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao Đồng thời, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất do vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định, có thể cung ứng cho sản xuất trên quy mô rộng.

Đã có một số nghiên cứu bước đầu về nhân in vitro cây Lan

huệ, các tác giả cho biết: Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo

chồi ở cây Lan huệ (Loa kèn đỏ nhung Hippeastrum equestre

Herb.) là môi trường MS có bổ sung 5 mg/l BA (Nguyễn Hạnh Hoa

và cs, 2009) và cây Lan huệ mạng là môi trường MS có bổ sung 3 mg/l BA, 100% mẫu tái sinh tạo chồi và củ nhỏ Chồi và củ nhỏ tạo

ra được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh Đa số các chồi đều ra

rễ Các cây con in vitro hoàn chỉnh được đưa ra thích nghi với điều

kiện giá thể cát và trấu hun theo tỷ lệ 1:1 [10, 11].

1.2.3.1 Cơ sở khoa học [12]

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ

thể hoàn chỉnh Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu.

Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó –

tế bào phôi Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974).

Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới

có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con người.

1.2.3.2 Ý nghĩa của phương pháp nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân

giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng

hữu ích Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu

tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống

vô tính in vitro là do:

Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho

hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một

số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964) Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây

có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)… [1],[12].

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và

ý nghĩa sinh học lớn Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng

ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian

nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống

vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 - 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém.

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống

vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương

pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi

trội như:

- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào

- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với

độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế.

- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng

và chất lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952) Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử

lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh Bằng cách

này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956- 1958; Wang and Huang, 1975).

- Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt

hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định Như ở cây cọ dầu, phải mất 10-15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo

và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn Nhưng bằng

phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được

500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky, 1970)

- Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm.

- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội.

- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen.

Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không

tránh khỏi một số nhược điểm như:

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới

lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật.

- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang

thiết bị hiện đại và lao động có tay nghề.

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân

là do biến dị soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy từ callus).

Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là tái sinh cây

hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật.

1.2.3.3 Các phương thức nhân giống in vitro

Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô

tính, theo Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính Trong

nhân giống in vitro, cây con có thể được tái sinh từ các điểm sinh

trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc

từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau:

- Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách.

- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.

Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng

có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983) Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên.

Với đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus) Trong môi trường nuôi cấy thích hợp, thường là với auxin, mẫu nuôi cấy có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo Sự tăng sinh này có thể được

duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền.

Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh Nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo, thường xuất hiện những

tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể không giống với tế bào ban đầu hoặc chứa những đột biến gen do hiện tượng nội nguyên nhân (endomitosits hay endoreduplication) Nội nguyên nhân là hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào trong thực tế và là một hiện tượng tự nhiên trong cơ thể thực vật, nhưng tăng lên dưới ảnh hưởng của cá thành phần của môi trường dinh dưỡng và điều kiện cũng như phương pháp nuôi cấy, nhất là khi cấy chuyển nhiều lần Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng những đặc tính di truyền (trueness – to – type) trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo Có thể thấy ngay là hệ số nhân của con đường này vô cùng lớn Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo Ngoài việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lý tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen [1],[12].

Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá

thể đã chọn lọc người tư thường tái sinh cây theo đường hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ra nhiều biến dị

để phục vụ cho việc chọn lọc và cải tạo giống cây trồng.

1.2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến môi trường nuôi cấy

a Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu.

Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy.

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu

dễ bị nhiễm.

Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi

cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu Thành phần của

môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy.

b Ảnh hưởng của các thành phần hóa học

Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý

của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ Môi

trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai

lá mầm và cây một lá mầm Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:

- Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau Mangan, iốt, Cu, coban, Bo, Mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần

của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục…

Chất hữu cơ bổ sung

- Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006) Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy.

- Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết.

Nguồn cacbon

Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon Saccharose thường được

sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được

sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccarose.

Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000) Thông thường đường saccarose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này

có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến

12 % (gây cảm ứng stress nước).

Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn Ví

dụ: theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt

khi bổ sung 60 g/l saccarose trong môi trường.

Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy

các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường

và vitamin, độ thoáng khí cao Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể Cây

có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều

giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm Tỷ lệ sống 95-100

% sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).

Chất điều tiết sinh trưởng

Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.

- Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong

phân tử Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của

mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích

các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi… (Bhojwani and Razdan, 1983).

Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA NAA.

Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002) Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994) Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine) Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.

Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007).

Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao.

Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinin

sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo

Than hoạt tính

Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy

mô thực vật Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S.C Van Winkle et al, 1995) Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm … (Nissen & Sutter, 1990).

Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccarose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).

Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô

in vitro như kích thích tạo củ của hoa Lili (Nhut et al, 2001), tác

dụng hình thành rễ ở Pawlownia (Lê Thị Kim Đào, 2001)…

Các chất hữu cơ bổ sung

Ngoài các thành phần dinh dưỡng bắt buộc kể trên trong môi

trường nuôi cấy mô tế bà thực vật in vitro, người ta còn bổ sung

thêm một số thành phần hỗn hợp tự nhiên khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, nước ép cà chua, khoai tây, chuối… Các thành phần này thường chứa nguồn dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng đa dạng như amino acid, đường, vitamin, nucleic acid, auxin, cytokinin.

Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy Tất cả phân tích thành phần của nước dừa từ non tới già của Tulecke et al.,(1961) cho thấy trong nước dừa có: amino acid, acid hữu cơ, đường, RNA, DNA, Inositol, auxin, cytokinin,… Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10-20 %

Tác nhân làm đặc môi trường

Tùy thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được

sử dụng ở dạng lỏng hoặc đặc, nhiều loại môi trường nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phải sinh trưởng trên bề mặt, agar là tác nhân làm đặc môi trường được sử dụng phổ biến nhất Agar được sản xuất từ tảo biển, loại tinh khiết hay agarose có thể cũng được sử dụng, nhưng có thể khác nhau về độ đặc.

a Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi trường…

Ánh sáng

Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để điều hòa một số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây Tùy từng loại nuôi cấy, yêu cầu cường độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo, thường không cần ánh sáng Ánh sáng còn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôi cấy thông qua tác động nên trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng cũng như

dinh dưỡng khoáng Thông thường trong phòng nuôi cấy người ta

sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14-15 giờ/ ngày với cường độ 2000 lux.

Nhiệt độ

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 220C đến 250C Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA3,

…

pH môi trường

pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất… pH được điều chỉnh ở mức 5,5 - 5,8.

Trạng thái môi trường

Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh hóa, các

mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây.

c Ảnh hưởng của điều kiện ra cây

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây

giống in vitro Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in

vitro trong phòng nuôi ra ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi

với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng.

Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển…

Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở.

Vì vậy, khi chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương Cần cung cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây.

Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của

cây nuôi cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất

ding dưỡng từ giá thể Để tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới cho cây.

1.3 Quy trình sản xuất cây nuôi cấy mô [12]

Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm

5 giai đoạn:

1.3.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu

Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý

vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…

Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu,

xử lý mẫu và điều kiện khử trùng Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ

và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ ẩm 75 % là điều kiện

giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and Zimmerman, 1991).

1.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính.

1.3.3 Nhân nhanh chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là

1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 - 300C.

Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng 1-2 tháng tùy từng loại cây Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 – 8 lần/ 1 lần cấy chuyển Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây sau 7 - 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu.

1.3.4 Tái sinh rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ

tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển

sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ Môi trường tái sinh

rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn

ở môi trường không có chất sinh trưởng.

1.3.5 Chuyển cây ra vườn ươm

Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ

được chuyển ra ngoài vườn ươm Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường.

1.4 Tình hình nghiên cứu về cây Lan huệ

1.4.1 Tình hình nghiên cứu cây Lan huệ trên thế giới

Seabrook và cs, 1976 đã phát hiện một kỹ thuật mới cho việc

phát triển các dòng lai (Hippeasrum sp.) bằng nuôi cấy mô Từ các

bộ phận của cây như lá, bên trong các vảy củ và buồng trứng có thể được nuôi cấy thành công trong ống nghiệm và cây con dễ dàng phát sinh ở các nồng độ chất điều tiết sinh trưởng khác nhau Thậm chí một số cây con cũng phát sinh trong trường hợp không

có chất điều tiết sinh trưởng Cây con cũng cảm ứng phát sinh rễ ngay vào trong môi trường tổng quát mà không cần tới chất đặc biệt nào được yêu cầu [13].

Hussey G., 1975 cũng đã nghiên cứu nhân giống in vitro trên một số giống cây trong đó có Hippeastrum, ông chỉ ra rằng có thể nhân in vitro trên quy mô củ và thân cây đối với những cây thuộc

chi này [18].

Theo Traub (1934), Bell (1973), Carge (1978), Shields (1979), những giống lai chủ yếu được tạo ra từ một vài loài hoa lan Huệ

như H vittatum Herbert, H leopoldii Dombrain, H.pardium

(Hook.f) Lemaire, H.reginae Herbert, H.puniceum (Larmark) Voss

và H.aulium Herbert John D.Fellers (1998) cho biết loài H.papilio

dùng để lai giống rất lý tưởng vì có đặc điểm là lớn rất nhanh.

Ngày nay một số giống được bán trên thị trường là được lai từ H.

Papilio

Khi lai các giống cây thuộc chi Hippeastrum có thể có được

cây con ra hoa sau 2-3 năm, hoặc lâu hơn là từ 4-7 năm Những nghiên cứu cơ bản đã được tiến hành giúp xác định được NST đơn

bội của các loài trong chi Hippeastrum là n=11 Hầu hết các loài

đều có bộ NST lưỡng bội 2n=22, tuy nhiên người ta cũng bắt gặp một số loài có bộ NST tam bội, tứ bội, thậm chí là ngũ bội [6].

Đối với các cây thuộc họ Liliaceae, khi sử dụng phương pháp nhân giông in-NAAvitro thì yếu tô ảnh hưỏng quyết định đến hiệu quả

nhân giông là loại vật liệu sử dụng ban đầu Rất nhiều loại vật liệu

đã được sử dụng trong các nghiên cứu như vảy củ không dính đế

củ (Mii và cs., 1974; Seabrook và Cumming, 1977), phần đế củ mang một vảy củ và phần đế củ mang 2 vảy củ (De Bruyn và cs., 1990; De Bruyn và cs., 1992), phần đế củ không mang vảy củ (Bapat và Narayanaswamy, 1976), các bộ phận của hoa như cuông hoa (Janet và cs., 1977; Seabrook và Cumming, 1976; De Bruyn và

cs., 1992), chồi in-NAAvivo hoặc củ in-NAAvitro nhỏ (Hussey, 1975; De

Bruyn và cs., 1992)

Các nghiên cứu đã chỉ ra có sự khác biệt rõ rệt trong kết quả nuôi cấy khi sử dụng các loại vật liệu nuôi cấy khác nhau M.H De Bruyn và cs (1992) sử dụng phần đế củ có kích thước 4 mm mang

2 vảy củ kích thước dài x rộng là 25 mm x 10 mm để nuôi cấy cho

tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 80% cao hơn rất nhiều so với mẫu cấy đế củ không mang vảy củ, gần như không có mẫu tái sinh [16] M.M Slabbert và cs (1993) nuôi cấy phần đế củ mang 2 vảy củ (twin

scales) cây Crinum macowanii (thuộc họ Liliaceae) trên môi trường

MS có bổ sung 0,1 mg/l a- NAA và 0,1 mg/l Kinetin đã thu được 700

- 1000 chồi từ 1 mẫu cấy ban đầu sau 12 tháng nuôi cấy, trong khi nếu sử dụng các bộ phận của hoa thì thu đươc chỉ là 100 chồi [25] Rất nhiều các nghiên cứu khác cũng đã khẳng định phần đế củ mang 2 vảy củ cho kết quả nhân tốt nhất [20], [21].

Các nghiên cứu cho thấy hệ sô nhân từ chồi in-NAAvitro của cây

loa kèn đỏ nhung chưa cao Thực tế đây cũng là khó khăn mà rất nhiều nghiên cứu nhân giông trên đôi tượng này đã gặp phải.

O’Rourke E.N và cs (1979) tiến hành nhân nhanh cây Hipeastrum

hybridum “Apple Blossom” và hệ sô nhân cao nhất thu được chỉ là

3,5 chồi/chồi ban đầu Để cải thiện hệ số nhân, một số tác giả khác

đã nghiên cứu sử dụng các nguồn vật liệu nhân nhanh khác Janet

và cs., (1977) đã sử dụng callus làm vật liệu nhân nhanh cây

Hippeastrum spp và đã thu được hệ số nhân 10 chồi/mẫu cấy sau

8 tuần nuôi cấy [20] O’Rourke E.N và cs., (1991) sử dụng củ nhỏ

in-NAAvitro làm vật liệu nhân nhanh cây Hippeastrum hybridum "Apple

Blossom” và hệ số nhân thu được đã tăng lên 100 chồi/củ ban đầu sau 26 - 28 tuần nuôi cấy [22] Do vậy cần phải sử dụng các nguồn vật liệu nhân khác nhau, đồng thời cải thiện môi trường nhân thích hợp để nâng cao hệ sô nhân nhanh cây loa kèn đỏ nhung.

Tadashi Yanagawa and Takeshi Osaki năm 1995 đã tiến hành nhân giống in vitro củ và củ sạch bệnh bằng nuôi cấy vảy củ

Hippeastrum hybridum Trên môi trường White’s (1943) agar có bổ

sung 0.01 mg/l NAA và 5 mg/l BA thích ứng tối ưu cho vảy củ nuôi cấy được cắt với kích thước 2mm Sự hình thành củ in vitro tối ưu

từ vật liệu nuôi cấy là vảy củ trên môi trường White lỏng lắc Hầu hết các củ thu được đều sạch virus CMV, 33% sạch virus HiMV Tất

cả các củ mới thu được từ củ nuôi cấy đều sạch cả 2 loại virus [26].

Nghiên cứu thiết lập hệ thống vườn ươm tạo cây hoàn chỉnh

từ cây và củ Hippeastrum trong phòng thí nghiệm được Siddique

M.N.A., Sultana, J., Sultana, N and Hossain, M.M tiến hành năm

2007 Cây ra rễ phát triển tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l NAA Cây và củ có sức sống tốt nhất, có số lá nhiều nhất, đạt chiều cao cây tốt nhất khi trồng trên giá thể đất, cát và phân (1:1:1) [24].

Năm 2010, J Sultana, N Sultana, M N A Siddique, A K M.

A Islam, M M Hossain and T Hossain Nghiên cứu tạo củ in vitro

của Hippeastrum Nghiên cứu trên môi trường MS có bổ sung BAP

và CCC và nồng độ đường khác nhau Ở 90 g/l đường đạt khối lượng củ nặng nhất cũng như tỷ lệ tái sinh cao nhất Tăng tỷ lệ CCC làm tăng số lượng và khối lượng củ Sự hình thành củ đạt tối

đa trên môi trường bổ sung 6 mg/l BAP và 500 mg/l CCC với 90g/l đường [19].

Behzad Kaviani and Sara Zakizadeh (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu sáng (16/8, 14/10, và 12/12 h ánh sáng / tối), nồng độ khác nhau của NAA (0, 1, 2, và 4 mg/ l) và 2iP (0, 14, 16,

và 18 mg/l) trong nhân giống Hippeastrum johnsonii sử dụng củ

nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản Môi trường MS có bổ sung 16 mg/l 2iP + 4 mg/l NAA, thời gian chiếu sáng 16/8 h (chiếu sang/ tối) được xác định là hiệu quả nhất [14].

Năm 2013, Nghiên cứu của Sara Zakizadeh, Behzad Kaviani and Rasoul Onsinejad chỉ ra rằng sự hình thành rễ in vitro của

Hippeastrum johnsonii dưới ảnh hưởng của 2-iP và NAA Trên môi

trường MS + 16 mg/l 2-iP + 4 mg/l NAA là tối ưu cho sự hình thành

rễ của củ Chiều dài cao nhất của rễ đạt 2.71 cm, rễ dài nhất đạt 3.53 cm và số rễ đạt 2.77 cm trên môi trường bổ sung 4 mg/l NAA Cây ra rễ sống sót 90% trên giá thể chứa xơ dừa, phân và cát [23].