Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng lan huệ (hippeastrum equestre)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thu Thủy NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ (Hippeastrum equestre) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thu Thủy NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ (Hippeastrum equestre) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Trung Thành Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Trung Thành, thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực hoàn thành luận văn Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch, TS Nguyễn Hạnh Hoa toàn thể tập thể cán bộ, nhân viên Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhiệt tình bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện sở vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè, người chia sẻ, động viên, giúp đỡ góp ý cho em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Thu Thủy i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BAP 6-benzylaminopurin CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance) ĐC Đối chứng IBA Indol butyric acid MS Murashige Skoog LSD0,05 Leant Significant Difference P - 0,05 ND Nước dừa α-NAA α-naphthylacetic acid ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 Giới thiệu chung Lan huệ Error! Bookmark not defined 1.1.1 Đặc điểm thực vật học phân bố Lan huệError! Bookmark not defined 1.1.2 Giá trị kinh tế sử dụng Error! Bookmark not defined 1.2 Một số phương pháp nhân giống vô tính Lan huệError! Bookmark not defined 1.2.1 Phương pháp tách củ Error! Bookmark not defined 1.2.2 Phương pháp cắt lát Error! Bookmark not defined 1.2.3 Phương pháp nhân giống in vitro Error! Bookmark not defined 1.3 Quy trình sản xuất nuôi cấy mô Error! Bookmark not defined 1.3.1 Lấy mẫu xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 1.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy Error! Bookmark not defined 1.3.3 Nhân nhanh chồi Error! Bookmark not defined 1.3.4 Tái sinh rễ Error! Bookmark not defined 1.3.5 Chuyển vườn ươm Error! Bookmark not defined 1.4 Tình hình nghiên cứu Lan huệ Error! Bookmark not defined 1.4.1 Tình hình nghiên cứu Lan huệ giớiError! Bookmark not defined 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Lan huệ Việt NamError! Bookmark not defined Chƣơng – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứuError! Bookmark not defined 2.1.1 Đối tượng Error! Bookmark not defined 2.1.2 Vật liệu Error! Bookmark not defined iii 2.1.3 Điều kiện nuôi cấy Error! Bookmark not defined 2.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.2.1 Giai đoạn nuôi cấy khởi động Error! Bookmark not defined 2.2.2 Giai đoạn nhân nhanh Error! Bookmark not defined 2.2.3 Giai đoạn tạo hoàn chỉnh Error! Bookmark not defined 2.2.4 Giai đoạn vườn ươm Error! Bookmark not defined 2.3 Các tiêu theo dõi Error! Bookmark not defined 2.4 Phương pháp tiến hành Error! Bookmark not defined 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Error! Bookmark not defined Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu nuôi cấy cho nhân giống in vitro dòng Lan huệ Error! Bookmark not defined Xác định thời gian khử trùng thích hợp Error! Bookmark not defined 3.2 Ảnh hưởng nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ phối hợp đến phát sinh chồi hệ số nhân từ vảy củ đôi Error! Bookmark not defined 3.2.1 Ảnh hưởng BA tới phát sinh chồi mẫu nuôi cấyError! Bookmark not defined 3.2.2 Ảnh hưởng phối hợp BA Kinetin đến khả phát sinh chồi từ vảy củ đôi Error! Bookmark not defined 3.2.3 Ảnh hưởng phối hợp hai nhóm chất auxin cytokinin đến khả nhân nhanh c 3.3 Nghiên cứu khả phát sinh hình thái nhân nhanh từ đế củError! Bookmark not d 3.3.1 Ảnh hưởng 2,4-D tới khả phát sinh hình thái từ đế củError! Bookmark not def 3.3.2 Ảnh hưởng α-NAA tới phát sinh hình thái từ đế củError! Bookmark not defined 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng BA α-NAA đến khả phát sinh hình thái từ đế củ Error! Bookmark not defined 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro dòng Lan huệ Error! Bookmark not defined 3.4.1 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitroError! Bookmark not d 3.4.2 Ảnh hưởng hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitroError! Bookmark not defi iv 3.5 Nghiên cứu rễ tạo hoàn chỉnh Error! Bookmark not defined 3.5.1 Ảnh hưởng IBA tới khả rễ chất lượng rễError! Bookmark not defined 3.5.2 Ảnh hưởng than hoạt tính tới khả rễ chất lượng rễError! Bookmark not 3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng số loại giá thể đến tỷ lệ sống sinh trưởng phát triển Lan huệ sau in vitro vườn ươmError! Bookmark not KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Error! Bookmark not defined Kết luận Error! Bookmark not defined Đề nghị Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến khả vào mẫu dòng Lan huệ (sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA đến khả phát sinh hình thái vảy củ đôi (sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.3 Ảnh hưởng phối hợp BA Kinetin đến khả phát sinh hình thái vảy củ đôi (Sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Ảnh hưởng BA, Kinetin v{ α-NAA đến khả nh}n nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi (Sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.5 Ảnh hưởng 2,4-D tới khả phát sinh hình thái từ đế củ (sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.6 Ảnh hưởng α-NAA tới khả phát sinh hình thái từ đế củ (sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.7 Ảnh hưởng BA α-NAA đến khả phát sinh hình thái in vitro từ đế củ (Sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 Ảnh hưởng BA, Kinetin đến khả phát sinh ch ồi mô sẹo từ đế củ (Sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro (sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.11 Ảnh hưởng IBA tới khả rễ chất lượng rễ dòng Lan huệ (sau tuầ n) Error! Bookmark not defined Bảng 3.12 Ảnh hưởng than hoạt tính tới khả rễ chất lượng rễ dòng Lan huệ (sau tuần) Error! Bookmark not defined Bảng 3.13 Ảnh hưởng loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng phát triển Lan huệ sau in vitro (Sau tuần)Error! Bookmark not defined vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre) Hình 1.2 Phương pháp cắt lát củ Lan huệ Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Ảnh hưởng BA đến khả phát sinh hình thái vảy củ đôi (Sau tuần) Error! Bookmark not defined Hình 3.3 Ảnh hưởng phối hợp BA, Kinetin α-NAA đến khả nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi (sau tuần)Error! Bookmark not defined Hình 3.4 Ảnh hưởng α-NAA đến khả tạo mô sẹo từ đế củ (sau tuần)Error! Bookm Hình 3.5 Ảnh hưởng BA α-NAA đến khả tạo mô sẹo từ đế củ (sau tuần) Error! Bookmark not defined Hình 3.6 So sánh ảnh hưởng BA α-NAA đến khả tạo mô sẹo từ đế củ (sau tuần ) Error! Bookmark not defined Hình 3.7 Ảnh hưởng BA, Kinetin đến khả phát sinh ch ồi từ mô sẹo dòng Lan huệ H10 H18 (sau tuần) Error! Bookmark not defined Hình 3.8 Ảnh hưởng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau tuần)Error! Bookmark Hình 3.9 Ảnh hưởng IBA tới khả rễ chất lượng rễ dòng Lan huệ nuôi cấy in vitro (sau tuần) Error! Bookmark not defined Hình 3.10 Ảnh hưởng số loại giá thể đến tỷ lệ sống sinh trưởng phát triển Lan huệ sau in vitro vườn ươmError! Bookmark not defined Hình 3.11 Ảnh hưởng số loại giá thể tới số lượng rễ chiều dài rễ in vitro dòng tuần)…………………………………64 vii Lan huệ (sau MỞ ĐẦU Lan huệ (Hippeastrum equestre) l{ lo{i hoa yêu thích v{ có tiềm ph|t triển năm gần đ}y Lan huệ trồng kh| phổ biến để l{m cảnh m{u sắc đa dạng, khả thương mại cao l{ hoa cắt c{nh trồng chậu cảnh hay v{o c|c dịp lễ, tết Bên cạnh đó, đ}y l{ c}y thuốc chữa bệnh theo đông y củ có chứa c|c th{nh phần biệt dược có gi| trị c|c ankaloids [21], c|c lectins có khả chống ung thư, cầm m|u, chữa l{nh vết thương… Lan huệ Việt Nam nghèo n{n m{u sắc (chủ yếu màu đỏ), thời gian hoa chúng lại kh| muộn (khoảng từ tháng đến cuối tháng 5) nên khả ph|t triển lo{i hoa n{y nhiều hạn chế Bằng đường thu thập nguồn gen, lai hữu tính v{ chọn lọc l{m phong phú giống hoa Lan huệ nước ta Năm 2009 – 2010, Nguyễn Hạnh Hoa v{ cộng đ~ chọn tạo h{ng loạt lai có m{u sắc lạ, đẹp, đa dạng, hoa có độ bền l}u v{ có thời gian hoa đ|p ứng thị trường, điển hình l{ c|c dòng H2, H4, H9, H10, H18 Tuy nhiên, c|c dòng Lan huệ n{y lại có nhược điểm l{ sinh sản vô tính (trong điều kiện tự nhiên), đặc biệt l{ c|c dòng Lan huệ H2, H4 v{ H18 Do vậy, c| thể lai có đặc điểm ưu tú chọn lọc cần phải nh}n giống vô tính nhằm trì tính trạng ban đầu Từ nhiều năm nay, để nh}n giống vô tính c}y Lan huệ sử dụng c|c phương ph|p: T|ch chồi củ nhỏ từ cụm c}y mẹ; kỹ thuật cắt l|t (Chipping); nh}n giống hạt; sử dụng phương ph|p nh}n giống in vitro Mặc dù đơn giản hiệu nh}n giống phương ph|p truyền thống không cao thời gian nh}n giống d{i, hệ số nh}n thấp, c}y không đồng không tạo c}y bệnh Phương ph|p nh}n giống in vitro đ~ khắc phục nhược điểm tạo c}y bệnh, thời gian nh}n giống ngắn, hệ số nh}n giống cao, c}y đồng nhất, đ|p ứng nhu cầu số lượng giống có chất lượng cao v{ tính di truyền ổn định Để đ|nh gi| v{ trì nguồn vật liệu việc nghiên cứu nh}n giống vô tính c|c dòng Lan huệ l{ cần thiết Năm 2009 – 2010, số t|c giả nước đ~ bước đầu x|c định kết để x}y dựng quy trình nh}n nhanh in vitro hoa Loa kèn đỏ nhung (H equestre Herb.) v{ c}y Lan huệ mạng (H reticulatum var striatifolium) [10,11] Bên cạnh việc kế thừa số kết cần phải có nghiên cứu nhằm bổ sung v{ ho{n thiện quy trình nh}n giống in vitro c}y hoa Lan huệ để nh}n nhanh nguồn gen ưu tú phục vụ cho công t|c chọn tạo giống Xuất ph|t từ yêu cầu đó, tiến h{nh đề t{i: “Nghiên cứu nhân giống in vitro số dòng Lan huệ (Hippeastrum equestre)”  Mục tiêu nghiên cứu - X|c định c|c giai đoạn quy trình kỹ thuật nh}n giống in vitro số dòng Lan huệ từ c|c nguồn vật liệu nuôi cấy kh|c - Góp phần bổ sung v{ ho{n thiện quy trình nh}n giống in vitro nhằm nh}n nhanh số dòng Lan huệ  Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Cung cấp liệu khoa học nh}n giống vô tính c}y Lan huệ phương ph|p nuôi cấy mô tế b{o, góp phần l{m phong phú sở liệu kỹ thuật nuôi cấy mô c}y hoa - Cung cấp thông tin cần thiết l{m sở cho việc x}y dựng ho{n thiện quy trình nh}n giống Lan huệ thương mại có thương hiệu riêng v{ hiệu kinh tế cao - Đ|p ứng sản xuất c}y giống Lan huệ có hiệu quả, chất lượng tốt, khắc phục hạn chế nh}n giống truyền thống, trì v{ nh}n nhanh kiểu gen chọn lọc - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Thị Phòng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô, NXB Nông nghiệp, H{ Nội Nguyễn Tiến B}n (1997), Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín Việt Nam, NXB Nông nghiệp, H{ Nội Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học v{ Kĩ thuật, H{ Nội Nguyễn Thị Đỏ (2007), Bộ Hoa Loa Kèn – Liliales Perleb, Thực vật chí Việt Nam (Flora of Viet Nam), NXB Khoa học v{ Kĩ thuật, H{ Nội Nguyễn Hạnh Hoa v{ cộng (2009), Thu thập, phân loại, đánh giá nguồn gen hoa cảnh họ Hành (Liliaceae) Bước đầu tạo vật liệu khởi đầu cho chọn nhân giống số loài kĩ thuật nuôi cấy mô gây đột biến, B|o c|o tổng kết đề t{i cấp Bộ m~ số B2008 - 11- 80 Nguyễn Như Khanh (2002), Sinh học phát triển thực vật, NXB Gi|o Dục H{ Nội Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc Gia Th{nh phố Hồ Chí Minh Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2004), Giáo trình công nghệ sinh học Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, H{ Nội Nguyễn Thị Phương Thảo (1998), Nghiên cứu nhân giống in vitro hoa Loa Kèn, Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp H{ Nội 10 Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Hạnh Hoa v{ Ninh Thị Thảo (2010), “Nghiên cứu quy trình nh}n nhanh in vitro c}y Lan huệ mạng”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Tập 8, số 3: 426 – 432, Trường Đại học Nông nghiệp H{ Nội 11 Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Hạnh Hoa v{ Nguyễn Thị Phương Thảo (2009), “Bước đầu nghiên cứu quy trình nh}n nhanh in vitro c}y hoa loa kèn đỏ nhung (Hippeastrum equestre Herb.)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Tập 7, số 4, tr.453- 459, Trường Đại học Nông nghiệp H{ Nội 12 Nguyễn Thị Quỳnh (2005), Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên tăng trưởng số thân gỗ nhiệt đới cận nhiệt đới điều kiện nuôi cấy in vitro, Hội nghị tổng kết NCCB KHTN, tr 42-44 10 13 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh T}m, Ho{ng Minh Tấn (2007), Sinh lý học thực vật, NXB Gi|o dục H{ Nội Tài liệu Tiếng Anh 14 Bapat V.A., Narayanaswamy S (1976), “Growth and Organogenesis in Explanted Tissues of Amaryllis in Culture”, Bulletin of the Torrey Botany Club, 103 (2), pp 53-56 15 Behzad Kaviani, Sara Zakizadeh (2012), “Efect of photoperiod, auxin and cytokinin on the multiplication rate and growth of Amaryllis (Hippeastrum johnsonii) bulbs in vitro”, Propagation of Ornamental Plants, 13(2), pp 78-85 16 Bhojwani S.S., Razdan M.K (1996), Plant tissue culture: Theory and practice, a revised edition Elsevier Science B.V The Netherlands, p.113 17 Chieh Li Huang, Kuo Cheng Chang, Hiroshi Okubo (2005), “In vitro morphogenesis from ovaries of Hippeastrum x Hybridum”, J Fac Agr Kyushu Univ., 50 (1), pp 19 – 25 18 De Bruyn M.M, Ferreira D.I., Slabbert M.M., Pretorius J (1992), “In vitro propagation of Amaryllis belladonna”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 31, pp.179-184 19 Debergh P.C and Zimmerman R.H (1991), “Micropropagation technology and application”, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlnds, pp.1-13 20 Epharath J.E., Ben-Asher., Baruchin F., Alekperov C., Dayan E., Silerbush M (2001), “Various cutting methods for the propagation of Hippeastrum bulbs”, Biotronics, 30, pp 75-83 21 Funganti C (1975), The Amaryllidaceae alkaloids, Academic Press, New York, Vol XV: The Alkaloids, pp 83- 164 22 George E.F (1993), Plan propagation by Tissue Culture: Part 1, The Technology, 2nd Edn Exegetics, Edington, UK., pp 337 – 356 11 23 Hussey G (1975), “Totipotency in tissue explants and callus of some members of the Liliaceae, Iridaceae and Amaryllidaceae”, J Exp Rot, 26, pp 253-262 24 Hussey G (1976), In-vitro Release of Axillary Shoots from Apical Dominance in Monocotyledonous Plants Annals of Botany, 40, pp 1323-1325 25 Mii M., Mori T., Iwase N (1974), “Organ formation from the excised bulb scales of Hippeastrum hybridum in-vitro” J Hortic Sci, 49, pp 241-244 26 Miller C.O (1961), “Kinetin and related compounds in plant growth”, Ann Rev Plant Physiol, 12, p.395 27 Murashige T (1974), “Plant propagation through tissue cultures”, Annu Rev Plant Physiol., Volume 25, pp 135-166 28 Murashige T., Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”, Plant Physiol., 15, pp 473-497 29 Narayanaswamy S (1994), Plant Cell and Tissue Culture, TATA McGraw-Hill Pub., New dehli, India, pp.22-49 30 Nhut D T., Le B V., Fukai S., Tanaka M., Van T T (2001), “Effects of activated charcoal, explant size, explant position and sucrose concentration on plant and shoot regeneration of Lilium longiflorum via young stem culture”, Plant Growth Reg, 33, pp 59-65 31 Nissen, S.J., Sutter, E G (1990), “Stability of IAA and IBA in nutrient medium to several tissue culture procedures”, Horticultural Science, 25, pp 800-802 32 O'Rourke E.N., Fountain W.M., Sharghi S (1991), “Rapid propagation of Hippeastrum bulblets by in vitro culture”, Herbertia, 47(1), pp 54-55 33 Pan M J., Van Staden J (1999), “Effect of activated charcoal, autoclaving and culture media on sucrose hydrolysis”, Plant Growth Regulation, 29, pp 135-141 34 Sara Zakizadeh, Behzad Kaviani, Rasoul Onsinejad (2013), “In vitro rooting of Amaryllis (Hippeastrum johnsonii), a bulbous plant, via NAA and 2-iP”, Annals of Biological Research, (2), pp 69-71 12 35 Seabrook J.E.A., Cumming B.G (1977), “The in-vitro propagation of Amaryllis (Hippeastrum spp hybrids)”, In vitro, Volume 13, No.12 36 Seabrook J.E.A., Cumming B.G., Dionne L.A (1976), “The in-vitro induction of adventitious shoot and root apices on Narcissus (daffodil and narcissus) cultivar tissue”, Can J Bot, 54, pp 814 - 819 37 Siddique M.N.A, Sultana J., Sultana N., Hossain M.M (2007), “Ex vitro Establishment of in vitro Produced Plantlets and Bulblets of Hippeastrum (Hippeastrum hybridum)”, Int J Sustain Crop Prod, 2(3): 22-24 38 Slabbert M.M., De Bruyn M.M., Ferreira D.I., Pretoricus J (1993), “Regeneration of bulblets from twin scales of Crinum macowanii in vitro” Plant cell, Tissue and organ culture, 33 (2), pp 133-141 39 Sultana J., Sultana N., Siddique M N A, Islam A K M A., Hossain M M., T Hossain (2010), “In vitro Bulb production in Hippeastrum (Hipp hybridum)”, Journal of Central European Agriculture, Volume 11, No.4, pp 469-474 40 Tadashi Yanagawa, Takeshi Osaki (1995), “In vitro propagation of bulblets and elimination of Viruses by Bulb-scale Cultures of Hippeastrum hybridum Bulbs”, Plant Tissue Culture Letters, 13(2), pp 147-152 41 Trigiano G.N., Gray D.J (2000), Plant tissue culture concepst and laboatry exercise, CRC Press Florida, America 42 Van Winkle S.C., Pullman G S (2001), “The combined impact of pH and Activated Carbon on the elemental composition of plant tissue culture media”, IPST Technical Paper, Series Number 992 Tài liệu từ internet 43 http://www.caythuocquy.info.vn/old/modules.php?name=News&opcase=detail snews&mid=792&mcid=256&pid=&menuid 44 http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Hippeastrum%20piniceum &list=species 13 14