Nghiên cứu nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai cu98 (eucalyptus camaldulensis x eucalyptus urophylla)

LỜI CẢM ƠN Để củng cố cho lý thuyết nuôi cấy mô tế bào thực vật - ứng dụng Công nghệ sinh học vào thực tế đƣợc học, tiến hành thực nghiên cứu chuyên đề: “Nghiên cứu nhân giống in vitro dòng Bạch đàn lai CU98 (Eucalyptuscamaldulensis x Eucalyptus urophylla)” để làm đề tài khóa luận Trong q trình thực đề tài, để đạt đƣợc kết tốt, cố gắng khơng ngừng thân cịn có bảo, giúp đỡ tận tình thầy cơ, bạn bè góp phần giúp tơi vƣợt qua khó khăn nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hồng Gấm- Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trƣờng Đại học Lâm nghiệp tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành đề tài nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trƣờng Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Và cuối cùng, vô cám ơn anh chị cán bạn sinh viên Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2018 Sinh viên thực Đỗ Thị Thùy Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan bạch đàn 1.2 Giới thiệu bạch đàn CU98 1.3 Các cơng trình có liên quan đến vấn đề nghiên cứu 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Ở Việt Nam PHẦN MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Mục tiêu 10 2.2 Nội dung nghiên cứu 10 2.3 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 10 2.4 Địa điểm điều kiện bố trí thí nghiệm 10 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 11 2.5.1 Phƣơng pháp luận 11 2.5.2 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm cụ thể 11 2.5.3 Phƣơng pháp thu thập xử lí số liệu 14 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 16 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng loại nồng độ hóa chất đến khả tạo mẫu dòng bạch đàn CU98 16 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến khả nhân nhanh chồi in vitro 20 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả rễ in vitro dòng bạch đàn CU98 26 PHẦN KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ 30 4.1 Kết luận 30 4.2 Tồn 30 4.3 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu dòng bạch đàn CU98 12 Bảng 2.2 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi dòng bạch đàn CU98 12 Bảng 2.3 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả rễ dòng bạch đàn CU98 13 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi bạch đàn CU98 21 Bảng 3.3: Kết ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả rễ bạch đàn CU98 27 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 : Rừng trồng bạch đàn Hình 1.2 Cây bạch đàn CU98 Hình 3.1(A, B): Bình mẫu bạch đàn CU98 khử trùng với cơng thức M2 18 Hình 3.2 bình mẫu bạch đàn CU98 với cơng thức khử trùng M1(A) M3(B) 18 Hình 3.3: Cụm chồi CU98 sau lần cấy chuyển 19 Hình 3.4: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến hệ số nhân chồi bạch đàn CU98 22 Hình 3.5 Bình chồi CU98 với cơng thức CT13 23 Hình 3.6 Cụm chồi CU98 cấy môi trƣờng CT13 sau lần (A) lần (B) cấy chuyển 23 Hình 3.7 Chồi CU98 ứng với mơi trƣờng ni cấy tƣơng ứng 25 Hình 3.8 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến số rễ TB/chồi bạch đàn CU98 28 Hình 3.9 Chồi bạch đàn CU98 cấy mơi trƣờng R4 sau 10 ngày(A), 15 ngày(B) 28 ngày (C) 29 Hình 3.10 Chồi bạch đàn CU98 cấy môi trƣờng tƣơng ứng 29 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ BAP Benzylamino purine-6 IBA Indole-3- butyric acid Kinetin (Ki) Furfuryamino purine-6 GA3 Giberelin NAA Naphthylacetic acid ĐHST Điều hòa sinh trƣởng MS Murashige&Skoog, 1962 CTTN Cơng thức thí nghiệm CTNC Công thức nghiên cứu HSNC Hệ số nhân chồi ĐẶT VẤN ĐỀ Chọn lọc trội kết hợp với lai giống sử dụng giống lai đƣợc nhiều nhà chọn giống quan tâm Những nghiên cứu lai giống sử dụng giống bạch đàn lai số nƣớc nhƣ Brazil, Congo, Trung Quốc, Ấn Độ, Philippin, Indonesia, Zambia…cho thấy lai giống tạo đƣợc giống có suất cao nhiều so với giống bố mẹ Trong bật giống bạch đàn lai E grandis x E tereticornis, E torelliana x E pellita, E torelliana x E urophylla Philippin, E tereticornis x E grandis loạt tổ hợp lai loài E urophylla x E grandis (Bạch đàn cự vĩ);E urophylla x E tereticornis (Bạch đàn vĩ hệ) Viện nghiên cứu khoa học Khâm Châu Trung Quốc chọn tạo[16] Bạch đàn đƣợc dẫn giống vào Việt Nam từ năm 1945 Do có đặc tính ƣu việt nhƣ: sinh trƣởng nhanh, biên độ sinh thái rộng, dễ trồng, sâu bệnh, gỗ có giá trị kinh tế nhiều công dụng nhƣ: gỗ xây dựng, gỗ xẻ, bột giấy, xuất khẩu, làm củi, lấy tinh dầu, ni ong mật, làm cảnh Vì từ năm 60, trồng bạch đàn phát triển mạnh, đƣợc nhân rộng rãi Tính đến năm 1995, Việt Nam có khoảng 144.417 rừng bạch đàn loại, chiếm 35% diện tích rừng trồng nƣớc, giữ vị trí hàng đầu rừng trồng chủ yếu [5] Ở nƣớc ta, năm 1996-2000, đề tài “Bƣớc đầu nghiên cứu lai giống cho số lồi bạch đàn” GS.TS Lê Đình Khả làm chủ nhiệm đề tài chọn lọc đƣợc 31 trội thuộc tổ hợp lai Đến năm 2001-2010 đề tài “Nghiên cứu lai giống số loài bạch đàn, tràm, keo, thông” TS Nguyễn Việt Cƣờng làm chủ nhiệm đề tài tiếp tục lai tạo thực khảo nghiệm vùng sinh thái khác nƣớc Trong thời gian qua nƣớc ta, việc phát triển trồng loài nhập nội sinh trƣởng nhanh nhƣ bạch đàn, keo nhằm cung cấp nguyên liệu giấy sợi đƣợc nhiều địa phƣơng thực Với điều kiện nay, đất trồng bạch đàn thƣờng thuộc loại nghèo kiệt việc phát triển thâm canh rừng chất lƣợng cao, bền vững đòi hỏi phải tập trung nghiên cứu tổng hợp nhiều biện pháp nhƣ: nâng cao đƣợc nuôi dƣỡng vƣờn ƣơm, làm đất trồng bón phân cho rừng trồng, giảm mật độ trồng, chọn cải thiện giống CU98 tên dòng bạch đàn đƣợc công nhận giống quốc gia qua kiểm định Với số đặc tính có phần ƣu việt nhƣ: chất lƣợng gỗ tốt, sinh trƣởng nhanh khả trồng đƣợc nhiều loại đất góp phần tăng mật độ rừng trồng cải thiện rõ rệt chất lƣợng rừng trồng Với lí trên, với việc áp dụng ƣu công nghệ sinh học, đặc biệt bề dày nuôi cấy in vitro lâm nghiệp trƣờng ta mà tơi chọn CU98 làm dịng bạch đàn để tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro dòng Bạch đàn lai CU98 (Eucalyptuscamaldulensis x Eucalyptus urophylla)” nhằm hồn thiện quy trình nhân giống dịng cung cấp giống cho thị trƣờng PHẦN TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan bạch đàn Bạch đàn nói chung hay cịn gọi Khuynh diệp (bạc hà), chi thực vật có hoa Eucalyptus họ Đào kim nƣơng (Myrtaceae) Hình 1.1 : Rừng trồng bạch đàn Giới (regnum) Plantae (không phân hạng) Angiospermae (không phân hạng) Eudicots (không phân hạng) Rosids Bộ (ordo) Myrtales Họ (familia) Myrtaceae Phân họ (subfamilia) Myrtoideae Tông (tribus) Eucalypteae Chi (genus) Eucalyptus (L'HÉR., 1789) Các thành viên chi có xuất xứ từ Úc Có 700 lồi bạch đàn, hầu hết có địa Australia, số nhỏ đƣợc tìm thấy New Guinea, Indonesia vùng viễn bắc Philippines Đài Loan Các loài bạch đàn đƣợc trồng vùng nhiệt đới cận nhiệt đới gồm châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán đảo Ấn Độ Việt Nam [6] Tại nƣớc ta, từ 40 năm trở lại đây, di thực số trồng rải rác nhiều nơi nhƣ loại bạch đàn trắng vùng Đò Cầm (Nghệ An), vài nơi khác nữa, đƣợc phổ biến rộng rãi [5] Từ năm 1956 trở lại với phong trào trồng gây rừng, làm xanh đồi trọc, bạch đàn đƣợc trồng nhiều để phủ xanh đồi trọc tỉnh trung du nhƣ Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Tính đến nay, bạch đàn phân bố rộng khắp nƣớc ta, đặc biệt tỉnh Nghệ An, Quảng Ninh, Phú Thọ tỉnh Nam Bộ 1.2 Giới thiệu bạch đàn CU98 CU98 dòng bạch đàn lai Eucalyptus camaldulensis Eucalyptus urophylla C kí hiệu camaldulensis, U kí hiệu urophylla Con số 98 biểu thị cho đầu dòng đƣợc sử dụng để làm giống lai Sau cho lai hai dòng bạch đàn Eucalyptus camaldulensis Eucalyptus urophylla, hàng trăm hàng nghìn tổ hợp lai có tổ hợp lai số 98 cho kết tốt việc sinh trƣởng nhanh, sâu bệnh, cứng cáp Bằng cách dẫn giống ngƣời ta thu đƣợc dòng bạch đàn lai CU98 CU98 đƣợc công nhận giống trồng Lâm nghiệp theo Quyết định công nhận giống số 3893/QĐ-BNN-TCLN ngày 20/9/2016 Từ Bộ Nơng Nghiệp Phát triển nông thôn định công nhận giống bạch đàn lai CU98 giống bạch đàn Vậy nói, tính đến thời điểm này, CU98 dòng bạch đàn lai đƣợc cơng nhận giống quốc gia Dịng bạch đàn lai CU98 đƣợc sở khoa học công nghệ Bắc Giang thành lập hội đồng xây dựng mơ hình trồng thử nghiệm vào 12/08/2016 A B Hình 3.1(A, B): Bình mẫu bạch đàn CU98 khử trùng với cơng thức M2 A B Hình 3.2 bình mẫu bạch đàn CU98 với công thức khử trùng M1(A) M3(B) Sau khoảng tuần nuôi cấy môi trƣờng MS + 20 g/l đƣờng + 4,5 g/l agar thu đƣợc mẫu Các mẫu có chồi nách tái sinh Khi tiến hành khử trùng mẫu với công thức khác nhau, nhận thấy công thức khử trùng dành cho dòng bạch đàn lai CU98 hiệu với kết thu đƣợc nhƣ: tỉ lệ mẫu cao hay khả tái sinh chồi vô hiệu 18 quả, cơng thức khử trùng với: Cồn 70%trong 60 giây + HgCl2 0,1% phút + Cefotaxim nồng độ 1000 (mg/l) 10 phút Khi tiến hành thí ngiệm, tơi thử cơng thức khử trùng khác nhận rằng, việc khử trùng cồn 70% quan trọng, nên để 60 giây thay để thấp Tiếp đó, HgCl2 0,1% thích hợp phút Chúng thử tăng hay giảm số thời gian khử trùng này, nhƣng thích hợp số phút Nếu để thời gian thấp ảnh hƣởng tới khả khử trùng lúc mẫu cịn nhiều nấm vi khuẩn, ta thu đƣợc tỉ lệ mẫu không cao Tuy nhiên để thời gian khử trùng mẫu lâu, ngâm lâu HgCl20,1% làm mẫu bị nhiễm độc, ảnh hƣởng tới khả tái sinh chồi Các chồi chết không tái sinh đƣợc Cuối cùng, khử trùng HgCl20,1% đảm bảo sạch, tức mẫu sử dụng để cấy vào mơi trƣờng ta làm bƣớc cuối Đó sử dụng cefotaxim với nồng độ cao 1000mg/l 10 phút Với việc khử trùng nhƣ vậy, số mẫu thu đƣợc tƣơng đối cao đạt từ 90% trở lên Cefotaxim loại kháng sinh, mục đích việc sử dụng bƣớc cuối để đảm bảo loại đƣợc hiệu vi khuẩn cịn sót lại nhằm thu đƣợc lƣợng mẫu cao Từ chồi nách cắt cấy chuyển nhiều lần để thu đƣợc cụm chồi nhƣ hình 3.1.3 dƣới đây: Hình 3.3: Cụm chồi CU98 sau lần cấy chuyển 19 Quá trình khử trùng tạo mẫu tái sinh chồi diễn thời gian ngắn khoảng tuần Nhƣng từ chồi để tạo đƣợc cụm chồi phục vụ nhân nhanh phải thực cấy chuyển nhiều lần với thời gian lên tới 5-6 tháng 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến khả nhân nhanh chồi in vitro Sau tiến hành vào mẫu thu đƣợc bình chồi sạch, tơi tiếp tục thiết lập môi trƣờng để nhân nhanh chồi Trong nuôi cấy in vitro chất điều hịa sinh trƣởng đóng vai trò quan trọng việc thúc đẩy sinh trƣởng phát triển mẫu mô nuôi cấy Nhƣng tùy thuộc vào mục đích ni cấy mà hàm lƣợng loại chất điều hòa sinh trƣởng khác Cytokinin đƣợc biết đến nhóm chất điều hịa sinh trƣởng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, hình thành sinh trƣởng chồi in vitro Tùy đặc điểm lồi mà ngƣời ta sử dụng Auxin Cytokinin với hàm lƣợng thích hợp vào mục đích ni cấy Cho nên, việc tìm hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng phù hợp cho mục đích ni cấy định đến thành cơng q trình ni cấy Sau thời gian theo dõi - tuần cho công thức, kết đƣợc tổng hợp bảng 3.2 20 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi bạch đàn CU98 Chất ĐHST (mg/l) CTTN CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 CT11 CT12 CT13 CT14 CT15 CT16 CT17 NAA IBA 0,1 0,2 0,1 BAP 0,3 - 0,1 0,5 - 0,1 0,1 - 0,2 - 0,3 0,2 0,2 - 0,3 GA3 0,4 - 0,4 0,1 0,1 Ki 0,3 0,1 0,1 0,3 0,4 0,5 0,2 0,3 0,2 0,2 0,3 0,4 0,2 0,5 0,4 0,3 0,2 0,2 0,1 0,2 Tổng số chồi cấy Tổng số chồi thu đƣợc HSNC 30 30 30 30 62 93 80 77 2,07 3,10 2,67 2,57 30 76 2,53 30 30 30 30 30 30 30 69 52 72 82 85 89 91 2,30 1,73 2,40 2,73 2,83 2,97 3,03 30 101 3,37 30 30 30 30 89 86 96 94 2,97 2,87 3,20 3,13 21 Đặc điểm chồi Chồi ít, mập, mọc thấp Chồi nhiều, xanh nhạt Chồi tƣơng đối mập, xanh đậm Chồi yếu, mọc vống cao Chồi xanh nhạt, phát triển chậm Chồi ít, xanh nhạt, mọc vống Chồi ít, lùn Chồi trung bình, chậm lớn Chồi khỏe, xanh đậm Chồi nhiều, xanh đậm Chồi nhiều nhƣng lên chậm Chồi nhiều, xanh đậm Chồi nhiều, xanh mập, khỏe Chồi nhiều, xanh nhạt, mọc cao Chồi xanh, mập Chồi nhiều, xanh, mập Chồi nhiều, xanh đậm 3.37 3.5 3.2 3.1 HỆ SỐ NHÂN CHỒI 2.67 2.73 2.57 2.53 2.5 2.83 2.97 3.03 2.97 3.13 2.87 2.4 2.3 2.07 1.73 1.5 0.5 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT11 CT12 CT13 CT14 CT15 CT16 CT17 CƠNG THỨC THÍCT10 NGHIỆM Hình 3.4: Ảnh hƣởng chất điều hịa sinh trƣởng đến hệ số nhân chồi bạch đàn CU98 Có thể thấy rõ, mơi trƣờng có chƣa chất điều hòa sinh trƣởng với nồng độ khác cho hệ số nhân chồi khác nhau, hình thái đặc điểm chồi không giống Đối với công thức CT13, chồi thu đƣợc mập xanh, to tròn Các chồi nhân lên với hệ số cao đạt 3,37 (101/30 chồi) Số chồi thu đƣợc cụm 11 – 13 chồi cấy chuyển cụm chồi chứa – chồi 22 Hình 3.5 Bình chồi CU98 với cơng thức CT13 A B Hình 3.6 Cụm chồi CU98 cấy môi trƣờng CT13 sau lần (A) lần (B) cấy chuyển Khi sử dụng môi trƣờng nuôi cấy MS + 20 g/l đƣờng + 4,0 g/l agar + 0,1 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP + 0,4 mg/l Ki+ 0.2 mg/l GA3thì CU98 nhân lên nhanh Các chồi thu đƣợc có màu xanh đậm đầy sức sống, hệ số nhân lên cao nhất, dày, to Chồi mọc với chiều cao vừa phải, cứng cáp, khoảng 1,5 - cm, có nhiều chồi nách Các chồi sử dụng rễ với điều kiện độ lớn lá, kích thƣớc chồi đạt tiêu chuẩn cho rễ Đối với công thức khác nhƣ CT1, CT6, CT7 chồi thu đƣợc có hệ số nhân khơng cao, chồi cịn mảnh, xanh nhạt mỏng, nhỏ Các chồi sức sống 23 Các cơng thức nhƣ CT4 CT14 hệ số nhân chồi cao, khoảng lần Tuy nhiên chồi mảnh mọc vống Quan sát ta thấy chồi vƣơn thân lên cao mà lại khơng phát triển, chí chồi nách mọc nhiều mà mảnh khơng có Chồi xanh non yếu Các chồi đem cấy chuyển phải 2-3 lần phát triển tốt, chí cịn khơng tái sinh chồi, to xanh úa mọc phía Với công thức thay đổi chế độ chiếu sáng khác Tuy nhiên chồi thu đƣợc mảnh mọc vống Cịn với cơng thức CT5, CT8 hay CT11 nhận thấy hệ số chồi thu đƣợc tƣơng đối cao khoảng lần, chồi đặc biệt xanh mập, chồi nách nhiều Tuy nhiên chồi không phát triển chiều cao mà mọc tụ lại cụm, kích thƣớc ngắn đạt 1cm thấp Bình thƣờng khoảng - tuần ( trung bình khoảng 20 ngày) tiến hành cấy chuyển, nhƣng bình chồi mọc thấp lại phải thời gian dài để mọc cao cấy chuyển đƣợc, có lên tới 6-8 tuần CT1 CT2 24 CT7 CT8 CT10 CT12 Hình 3.7 Chồi CU98 ứng với mơi trƣờng ni cấy tƣơng ứng Kết phân tích phƣơng sai hàm Anova thu đƣợc: Ftính = 50,84 > F0,05 = 2,18 Nghĩa môi trƣờng dinh dƣỡng có chứa chất điều hịa sinh trƣởng khác có ảnh hƣởng khác tới khả nhân nhanh chồi dòng bạch đàn CU98 Các đặc điểm hình thái nhận thấy q trình ni cấy dòng CU98 là: - Lá: tròn đều, già mọc phía dƣới gốc dài hơn, màu xanh đậm, dày - Cách mọc lá: mọc từ thân lên - Thân: CU98 cho thân mập thẳng, khỏe khoắn, thân khơng giịn cấy chuyển khó bị gãy chồi non 25 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả rễ in vitro dịng bạch đàn CU98 Tạo hồn chỉnh đƣợc coi công đoạn cuối vi nhân giống phịng thí nghiệm Giai đoạn đảm bảo chồi rễ đồng đạt tỷ lệ sống cao đem trồng (chồi để tạo rễ phải đảm bảo yêu cầu có: 2-3 đốt thân, 3-4 lá, cao - 4cm cấy vào mơi trƣờng kích thích rễ có bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng thuộc nhóm Auxin với nồng độ khác nhau) Vai trị chất điều hịa sinh trƣởng mang tính chất định Auxin Auxin nhóm chất có tác dụng lên tầng phát sinh mẫu nuôi cấy đặc biệt giai đoạn có tác dụng hình thành rễ Sau cấy chuyển nhiều lần thu đƣợc chồi có đủ tiêu chuẩn nhƣ sau: - chồi cao từ 1,5-2 cm - số lá: 4-6 lá, to xịe - thân chồi mập, khơng nhiễm khuẩn nấm Lúc tiến hành cấy chuyển chồi sang mơi trƣờng để kích chồi rễ Chỉ cấy chồi đủ tiêu chuẩn không cấy cụm chồi cho rễ cho khả rễ Nếu cụm chồi phải tách riêng chồi đủ tiêu chuẩn cấy cho rễ, chồi cịn lại tiếp tục cấy vào mơi trƣờng nhân nhanh Với cách bố trí cơng thức mơi trƣờng rễ trình bày trên, tơi tiến hành cấy chuyển cho rễ với dòng bạch đàn CU98 thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.3 26 Bảng 3.3: Kết ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả rễ bạch đàn CU98 Chất điều Số chồi Tỷ lệ hòa sinh CTTN trƣởng cấy Số chồi Số rễ Đặc điểm TB/chồi rễ chồi ban rễ rễ (%) ( mg/l) đầu IBA NAA ĐC 0 30 16,67 2,03 + R1 1,0 30 10 33,33 3,55 + R2 1,0 30 11 36,67 3,46 ++ R3 1,2 1,0 30 21 70,00 4,62 ++ R4 1,5 1,0 30 30 100,00 5,11 ++ Ghi chú: (+): Rễ xấu, mảnh (++): Rễ trung bình, mập Kết phân tích phƣơng sai nhân tố tỷ lệ chồi rễ cho thấy: Ftính(=9.52) > F0,05(= 2.87), chứng tỏ có khác biệt tỷ lệ chồi rễ cơng thức thí nghiệm Qua bảng 3.3 kết phân tích phƣơng sai nhân tố số rễ TB/chồi, ta thu đƣợc Ftính(= 39.12) > F0,05(= 2.87), nghĩa hàm lƣợng chất điều hịa sinh trƣởng khác có ảnh hƣởng rõ rệt tới số rễ TB/chồi 27 Hình 3.8 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến số rễ TB/chồi bạch đàn CU98 5.11 4.62 3.55 3.46 R1 R2 2.03 ĐC R3 R4 Ở mơi trƣờng R4, chồi bạch đàn có số rễ TB/chồi cao 5,11 Đồng thời bƣớc đầu đánh giá chất lƣợng rễ tốt Rễ mập nhanh, màu trắng tƣơng đối đồng Các rễ sau 10 - 15 ngày có kích thƣớc từ 0,5 – cm Chồi cứng cáp xịe to Với cơng thức R4 dịng bạch đàn lai CU98 cho kết rễ cao thời gian tƣơng đối ngắn Việc bổ sung than hoạt tính vào mơi trƣờng rễ cần thiết vì: - than hoạt tính tạo mơi trƣờng tối, mơ đất - Cải thiện tăng trƣởng tế bào - hấp phụ chất ức chế sinh trƣởng, giảm trình oxi hóa phenol, thay đổi pH trung bình đến mức tối ƣu 28 A B C Hình 3.9 Chồi bạch đàn CU98 cấy môi trƣờng R4 sau 10 ngày(A), 15 ngày(B) 28 ngày (C) R2 R3 Hình 3.10 Chồi bạch đàn CU98 cấy môi trƣờng tƣơng ứng 29 PHẦN KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Dựa vào kết thu đƣợc từ thí nghiệm tơi có kết luận nhƣ sau: Cơng thức khử trùng thích hợp để tạo mẫu có khả tái sinh dòng bạch đàn CU98 : Cồn 70% 60 giây + HgCl2 0,1% phút + Cefotaxim Nồng độ 1000 (mg/l) 10 phút Cơng thức mơi trƣờng thích hợp để nhân nhanh chồi là: MS+ 20 g/l đƣờng + 4,0 g/l agar + 0,1 mg/l NAA+ 0,3 mg/l BAP+ 0,4 mg/l Ki+ 0,2 mg/l GA3+ mg/l axit folic + mg/l B2 Công thức môi trƣờng tối ƣu để rễ bạch đàn : ½ MS + 20 g/l đƣờng + 4,5 g/l agar + 0,5 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l IBA + 1,0 mg/l NAA 4.2 Tồn Do thời gian nghiên cứu hạn chế nên chƣa nghiên cứu đƣợc giai đoạn cuối huấn luyện vƣờn ƣơm 4.3 Kiến nghị Có thêm thời gian điều kiện để tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình ni cấy in vitro dòng bạch đàn CU98: - Huấn luyện chăm sóc giai đoạn vƣờn ƣơm 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Nguyễn Thị Lý Anh (2/1990), Đề tài: “Nhân giống trồng in vitro”, Khoa CNSH -ĐH Nông Nghiệp I - Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nhà xuất Hà Nội Nguyễn Việt Cƣờng, 2006 Báo cáo tổng kết đề tài “ Nghiên cứu lai giống cho số loài bạch đàn, keo, tràm thơng” Lê Văn Hồng ( 2007 ), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB KHoa học Kỹ thuật, Hà Nội Dƣơng Mộng Hùng, Lê Đình Khả (2003), Giáo Trình rừng, Nhà xuất nơng nghiệp Lê Đình Khả, 2001 Báo cáo tổng kết đề tài “Bƣớc đầu nghiên cứu lai giống cho số loài bạch đàn” Nguyễn Hoàng Lộc ( 2011), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Đại học Huế, Huế Nguyễn Ngọc Lung (1995), “Nghiên cứu áp dụng sở khoa học, giải pháp kinh tế - kỹ thuật để quy hoạch thiết kế lƣu vực phòng hộ, xây dựng rừng phịng hộ nguồn nƣớc, rừng chống gió bão ven biển” Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (Tập 2), Nhà xuất Giáo Dục Tài liệu Tiếng Anh 10 Evidence-Based Complementary and Alternative MedicineVolume 2014 (2014), Article ID 204840, 13 pages 11 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2676878/ 12 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4131460/ 13 Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol (08), pp 174-178, August, 2016 14 Khan IA Issues related to botanicals Life Sci 2006;78:2033-2038 31 15 William, E R and Matheson, A C., (1994) Experimental Design and Analysis for Use in Tree Improvement CSIRO, Melbourne and ACIAR, Canberra 16 Xun-Lan Lei and George C.Y Chiou, Am J Chin Med 14, 145 (1986) 32