Xác định chỉ thị dna barcode và nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai ug24 (eucalyptus urophylla x eucalyptus grandis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP -LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP BÙI THỊ HOÀNG YẾN XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ DNA – BARCODE VÀ NHÂN GIỐNG IN VITRO DÒNG BẠCH ĐÀN LAI UG24 (EUCALYPTUS UROPHYLLA x EUCALYPTUS GRANDIS) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS BÙI THỊ MAI HƯƠNG Hà Nội, 2021 Hà Nội, 2021 i i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Nếu nội dung nghiên cứu trùng lặp với công trình nghiên cứu cơng bố, tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm tuân thủ kết luận đánh giá luận văn hội đồng khoa học Hà nội, ngày 28 tháng năm 2021 Người cam đoan Bùi Thị Hồng Yến ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp trang bị kiến thức cho suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Thị Mai Hương TS Nguyễn Thị Hồng Gấm PGS.TS Hà Văn Huân - Trường Đại học Lâm nghiệp, tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình làm luận văn Thạc sĩ Ngồi ra, Tơi xin chân thành cảm ơn trợ giúp vật liệu, hóa chất học thuật từ Đề tài NAFOSTED mã số 106.06-2019.27 TS Lê Thọ Sơn, Viện CNSH Lâm nghiệp, Trường ĐH Lâm nghiệp làm Chủ nhiệm Tôi xin cảm ơn cán Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2021 Học viên Bùi Thị Hoàng Yến iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung bạch đàn lai ug24 1.1.1 Đặc điểm dòng bạch đàn bố mẹ dòng UG24 1.1.2 Giới thiệu bạch đàn lai UG24 1.2 Tổng quan adn mã vạch 1.2.1 Giới thiệu ADN mã vạch (DNA barcode) 1.2.2 Một số locus sử dụng làm thị mã vạch ADN thực vật 1.2.3 Những nghiên cứu ứng dụng ADN mã vạch giám định loài 10 1.2.4.Tổng quan phương pháp xử lí liệu nghiên cứu ADN mã vạch giám định loài 12 1.3 Tổng quan nuôi cấy mô - tế bào in vitro 12 1.3.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro 12 1.3.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 1.3.3 Các giai đoạn quy trình nhân giống in vitro 14 1.3.4 Thành tựu nuôi mô Bạch Đàn 16 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU 20 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 20 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 20 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 20 iv 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.2.1 Xác định số trình tự ADN mã vạch cho dịng bạch đàn lai UG24 20 2.2.2 Nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai UG24 20 2.3 Địa điểm, điều kiện nghiên cứu 20 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu nhân giống 21 2.3.2 Điều kiện bố trí thí nghiệm nhân giống 21 2.4 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 2.4.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.4.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 22 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch 23 2.5.2 Phương pháp nghiên cứu nhân giống in vitro dòng Bạch đàn lai UG24 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis) 25 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết xác định số đoạn adn mã vạch 31 3.1.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ Bạch đàn lai 31 3.1.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 31 3.1.3 Phân tích kết 32 3.2 Kết nghiên cứu nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai ug24 47 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng công thức khử trùng đến khả tạo mẫu tái sinh bạch đàn lai UG24 47 3.2.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi bạch đàn lai UG24 50 3.2.2 Kết nghiên cứu rễ tạo hoàn chỉnh bạch đàn lai UG24 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC v BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT Giải nghĩa TT Chữ viết tắt ADN Acid Deoxyribonucleic AC Than hoạt tính BAP - benzynlaminopurin bp CTAB Hexadecyl trimethyl ammonium bromide CTTN Cơng thức thí nghiệm ddNTP Dideoxy nucleo triphotphate ĐHST Điều hòa sinh trưởng 10 EBA Đệm tách A 11 EBB Đệm tách B 12 EDTA 13 GA3 Gibberellic acid 14 IAA Indol- acetic acid 15 IBA Indol butyric acid 16 ITS Vùng ADN nằm gen 17 Knops 18 MS Murashige &Skoog, 1962 19 NAA α- Naphthalen acetic acid 20 NCBI Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học Hoa Kỳ 21 PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN) 22 TAE Tris-Acetate-EAIA 25 UV Tia cực tím 26 WPM Base pair (cặp bazơ nitơ) Ethylene diamine tetraacetic axit Knops Medium Woody plant medium (môi trường thân gỗ) vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Vị trí phân loại Eucalyptus urophylla Eucalyptus grandis Bảng 2.1: Trình tự thơng tin cặp mồi sử dụng 22 Bảng 2.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi dòng bạch đàn lai UG24 26 Bảng 2.3: Ảnh hưởng IBA đến khả rễ bạch đàn lai UG24 28 Bảng 2.4 Hưởng IBA đến khả rễ bạch đàn lai UG24 29 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự đoạn rbcL tương đồng với số giống Bạch đàn lai NCBI 33 Bảng 3.3 Một số lồi có trình tự đoạn matK tương đồng với giống Bạch đàn lai NCBI 36 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn matK 37 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự đoạn trnH-psbA 38 Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn trnH-psbA 40 Bảng 3.7 Một số lồi có trình tự đoạn ITS tương đồng với giống Bạch đàn lai NCBI 41 Bảng 3.8 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn ITS 43 Bảng 3.9 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn ITS2 44 Bảng 3.10 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn ITS2 45 Bảng 3.11 So sánh khả phân biệt đoạn matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 UG24 E.urophylla 46 vii Bảng 3.13 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi bạch đàn lai UG24 (sau tuần nuôi cấy) 51 Bảng 3.14 Ảnh hưởng loại ánh sáng đèn đến khả nhân nhanh chồi 53 Bảng 3.15 Kết ảnh hưởng IBA đến khả rễ bạch đàn lai UG24 54 Bảng 3.16 Kết ảnh hưởng IBA đến khả rễ bạch đàn lai UG24 55 Bảng 3.17 Ảnh hưởng ánh sáng đến khả rễ in vitro 56 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái bạch đàn Eucalyptus urophylla (S.T.Blake, 1977) Hình 1.2 Cây bạch đàn Eucalyptus grandis (tại rừng bang Kerewong, Úc) Hình 3.1 Ảnh điện di ADN tổng số mẫu Bạch đàn lai UG24 31 Hình 3.2 Kết PCR đoạn gen trnH-psbA, matK, rbcL, ITS2, ITS Bạch đàn lai UG24 32 Hình 3.3 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo ML 34 Hình 3.4 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo ML 36 Hình 3.5 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo ML 39 Hình 3.6 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS tạo ML 42 Hình 3.7 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS2 tạo ML 44 Hình 3.8 Bình vào mẫu mẫu bạch đàn lai UG24 nảy mầm 49 Hình 3.9 Cụm chồi dịng UG24 tái sinh từ mẫu công thức 50 khử trùng M4 50 Hình 3.10 Bình chồi UG24 cơng thức CT12 thu sau ni cấy tuần 52 Hình 3.11 Bình chồi Bạch đàn UG24 nuôi cấy AS2 53 Hình 3.12 Chồi bạch đàn lai UG24 cấy môi trường R4 (A) rễ môi trường khác (B) 56 Hình 3.13 Bạch đàn lai UG24 rễ AS3 57 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, không Việt Nam mà giới, công bảo vệ rừng sản xuất sản phẩm thân thiện với môi trường xu Một lồi góp phần quan trọng việc phát triển kinh tế rừng phải kể đến lồi bạch đàn Bạch đàn nói chung hay cịn gọi khuynh diệp (bạc hà), chi thực vật có hoa Eucalyptus trong họ Sim (Myrtaceae) Hiện giới có 700 lồi bạch đàn, hầu hết có địa Australia Ngoài ra, số loài tìm thấy New Guinea, Indonesia lồi vùng viễn bắc Philippines Đài Loan Các loài bạch đàn trồng vùng nhiệt đới cận nhiệt đới gồm châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán đảo Ấn Độ Việt Nam Bạch đàn lồi gỗ có giá trị kinh tế cao làm gỗ xây dựng, làm nguyên liệu chế biến bột giấy ván ép công nghiệp, tinh dầu bạch đàn điều trị đau đầu, nhức xương y học… Gần số giống bạch đàn lai có suất cao chọn gây trồng thành công số nước Brazil, Congo, Trung Quốc, Ấn Độ, Philippin, Indonesia, Zambia… Tại đây, lập địa tốt áp dụng kỹ thuật trồng thâm canh đạt suất 40 - 80m3/ha/năm Tính đến năm 1995, Việt Nam có khoảng 144.417 rừng bạch đàn loại- chiếm 35% diện tích rừng trồng nước Bạch đàn chiếm vị trí quan trọng cấu trồng rừng, có mặt 6/9 vùng sinh thái nước Tuy nhiên suất chất lượng rừng bạch đàn nước ta tương đối thấp Bạch đàn lai UG24 tạo từ hai loài Bạch đàn E.urophylla E.grandis giống Bạch đàn lai UG24 (E.urophylla x E.grandis) công nhận giống quốc gia (3893/QĐ/BNN-TCLN, ngày 20 tháng 09 năm 2016) với mã số BĐL.TVT.16.03, giống có giá trị kinh tế cao trồng rừng sản xuất Do đó, việc nghiên cứu xác định đoạn mã vạch 54 3.2.2 Kết nghiên cứu rễ tạo hoàn chỉnh bạch đàn lai UG24 3.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả rễ in vitro dòng bạch đàn lai UG24 a Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả rễ in vitro dịng bạch đàn lai UG24 Thí nghiệm tiến hành cấy chuyển chồi bạch đàn đủ tiêu chuẩn thí nghiệm nhân nhanh chồi vào mơi trường kích thích rễ có sử dụng IBA với nồng độ khác Sau tuần nuôi cấy kết thu bảng 3.15 đây: Bảng 3.15 Kết ảnh hưởng IBA đến khả rễ bạch đàn lai UG24 Số chồi Số Tỷ lệ IBA cấy ban chồi CTTN chồi (mg/l) đầu/lần rễ rễ (%) x3 Chiều Số rễ Đặc điểm dài rễ TB/rễ TB/chồi (cm) ĐC 90 6,67 1,53 1,17 + R1 0,5 90 21 23,3 1,85 1,42 + R2 0,1 90 63 70,0 1,95 3,5 + R3 0,75 90 51 56,7 1,7 3,92 + R4 1,0 90 24 26,7 1,8 4,25 + R5 1,2 90 33 36,7 1,9 4,5 ++ R6 1,5 90 57 63,3 2,05 5,25 ++ R7 2,0 90 51 56,7 1,7 4,67 + R8 2,25 90 42 Ghi chú: (+): 46,67 1,68 3,25 + Rễ xấu, mảnh (++): Rễ trung bình, mập Kết bảng 3.15 cho thấy, không bổ sung IBA kết cho tỉ lệ chồi rễ thấp (6,67%) Ở công thức R6 cho tỉ lệ chồi rễ cao 63,3%, chiều dài rễ đạt trung bình 2,05cm, số rễ trung bình/ chồi cao 5,25 rễ/chồi, đồng thời rễ mập, khoẻ, thu đạt tiêu chuẩn 55 Từ ta kết luận lượng IBA tốt cho môi trường rễ bạch đàn lai UG24 1,5mg/l b Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ in vitro dòng bạch đàn lai UG24 Thí nghiệm tiến hành cấy chuyển chồi bạch đàn đủ tiêu chuẩn thí nghiệm nhân nhanh chồi vào mơi trường kích thích rễ có sử dụng IBA với nồng độ 1,5mg/l bổ sung thêm NAA với nồng độ khác Sau tuần nuôi cấy kết thu bảng 3.16 đây: Bảng 3.16 Kết ảnh hưởng IBA đến khả rễ bạch đàn lai UG24 Số chồi Chiều Tỷ lệ Số rễ Đặc điểm cấy ban Số chồi dài chồi đầu/lần x rễ TB/rễ TB/chồi rễ rễ (%) (cm) CTTN NAA (mg/l) ĐC 90 10 11,11 2,1 3,8 + R1 0,2 90 43 47,78 2,3 4,67 + R2 0,5 90 57 63,33 2,36 5,46 + R3 0,75 90 71 78,89 2,52 8,25 ++ R4 1,0 90 78 86,67 2,5 8,92 ++ R5 1,2 90 62 68,89 2,25 7,81 + R6 1,5 90 49 54,44 2,27 5,29 + R7 1,75 90 Ghi chú: (+): 37 41,11 2,17 4,51 + Rễ xấu, mảnh (++): Rễ trung bình, mập Kết bảng 3.16 cho thấy, không bổ sung NAA kết cho tỉ lệ chồi rễ thấp (11,11%) Ở công thức R4 cho tỉ lệ chồi rễ cao 88,67%, chiều dài rễ đạt trung bình 2,5cm, số rễ trung bình/ chồi cao 8,92 rễ/chồi, đồng thời rễ mập, khoẻ, thu đạt tiêu chuẩn Từ ta kết luận lượng NAA tốt cho môi trường rễ bạch đàn lai UG24 1,0mg/l 56 Hình 3.12 Chồi bạch đàn lai UG24 cấy môi trường R4 (A) rễ mơi trường khác (B) Từ hai thí nghiệm ta thấy mơi trường thích hợp tìm để rễ tạo hoàn chỉnh bạch đàn lai UG24 : ½ MS bổ sung 20g/L sucrose + 4,5g/L agar + g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l IBA + 1,0 g/l NAA 3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng đến khả rễ in vitro dòng bạch đàn lai UG24 Khi chọn mơi trường rễ hợp lí cơng thức rễ thí nghiệm Sẽ tiến hành thực nghiệm ảnh hưởng điều kiện ánh sáng đến khả rễ in vitro bạch đàn lai UG24 với điều kiện ánh sáng đèn khác Kết theo dõi sau tuần nuôi cấy với tiêu theo bảng sau: Bảng 3.17 Ảnh hưởng ánh sáng đến khả rễ in vitro Loại Số chồi Tổng Số Tỷ lệ ánh cấy ban số rễ Số rễ chồi chồi sáng đầu/lần x thu TB/cây rễ rễ (%) đèn Chất lượng rễ (AS1) 90 77 85,56 692 8,99 Rễ mảnh, ngắn (AS2) 90 80 88,89 753 9,41 Rễ mập, đồng đều, khoẻ có màu trắng ngà 9,23 Rễ tương đối mập, đồng đều, khoẻ có màu trắng ngà (AS3) 90 79 87,78 729 57 Kết bảng 3.17 cho thấy nuôi cấy môi trường AS2 tỷ lệ chồi rễ 88,89%, đạt trung bình 9,41 rễ/chồi, rễ mập khoẻ Đảm bảo chất lượng để đưa môi trường huấn luyện Hình 3.13 Bạch đàn lai UG24 rễ AS3 Vậy ánh sáng thích hợp tìm để bạch đàn lai UG24 rễ tốt tiến hành nuôi cấy điều kiện ánh sáng Đèn led tổ hợp ánh sáng (3 sáng xanh : sáng đỏ) 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận (1) Đã tách chiết mẫu ADN tổng số Bạch đàn lai UG24 (E.urophylla x E.grandis), nhân gen thành công đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 kỹ thuật PCR xác định trình tự nucleotide đoạn mã vạch matK có kích thước 449bp, rbcL 687bp, trnH-psbA 336bp đoạn ITS 564bp, đoạn ITS2 178bp So sánh trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN (matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2) bạch đàn lai UG24 với trình tự nucleotide đoạn mã vạch tương ứng số dòng bạch đàn NCBI Kết luận sử dụng thị trnH-psbA, ITS ITS2 tốt làm mã vạch ADN để giám định giống bạch đàn lai UG24 Việt Nam Mặc dù vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 để xác định xác loài cần định danh (2) Đã xây dựng thành cơng quy trình nhân giống in vitro dịng Bạch đàn lai UG24 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis) với thông số sau: - Công thức khử trùng mẫu: dung dịch HgCl2 0,1% khử trùng phút, cho tỷ lệ mẫu 96,67% tỷ lệ mẫu tái sinh 58,62%, chất lượng chồi tái ính tốt (chồi mập, xanh đậm, dày) - Môi trường nhân nhanh chồi là: ½ MS + 20g/L sucrose + 4,5g/L agar + 0,1 mg/l NAA + 0,4 mg/l BAP + 0,3 mg/l Ki điều kiện ánh sáng AS2 Đèn led tổ hợp ánh sáng (3 sáng xanh: sáng đỏ) cho hệ số nhân chồi đạt 4,27 lần; chồi xanh đậm, mập, dày - Môi trường rễ tạo hồn chỉnh: ½ MS bổ sung 20g/L sucrose + g/L agar + 1,0 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l IBA + 1,0 g/l NAA điều kiện ánh sáng AS3 Đèn led tổ hợp ánh sáng (1 sáng xanh: sáng đỏ: sáng trắng) 59 cho tỷ lệ chồi rễ đạt 88,74%, 9,35 rễ/cây, chất lượng rễ tốt (rễ khỏe, đồng đều, mập có màu trắng ngà) Kiến nghị - Sử dụng đoạn đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 vào việc giám định dòng Bạch đàn lai UG24 (E.urophylla x E.grandis) Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể - Đưa trình tự đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 lên ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau - Tiếp tục hoàn thiện nội dung quy trình nhân giống in vitro dịng Bạch đàn lai UG24 (E.urophylla x E.grandis) 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Việt Cường, 2006 Báo cáo tổng kết đề tài “ Nghiên cứu lai giống cho số lồi bạch đàn, keo, tràm thơng” Bộ Nông nghiệp & PTNT Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Quỳnh Nga, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Thị Thu, Ninh Thị Phíp, Đoàn Thị Thanh Nhàn, Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Nhật Linh (2018), “Đặc điểm hình thái mã vạch DNA loài Bảy hoa Paris vietnamensis (Takht.) H.Li” Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2018, 16(4):282-289 Triệu Thị Thu Hà, Cấn Thị Lan (2015) Nghiên cứu nhân giống bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Tạp chí Nơng nghiệp PTNT Số 6/2015 : 124-130) Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015) Xác định mã vach cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis) Tạp chí Nơng Nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123 -124 Lê Văn Hồng ( 2007 ), Cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB KHoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đặng Ngọc Hùng Lê Đình Khả (2009): Nhân giống dịng bạch đàn lai UE35 UE56 phương pháp nuôi cấy mô tế bào, Tạp chí khoa học cơng nghệ 108(08): 47-5547 Phạm Đức Huy (2019) “Nghiên cứu nhân giống dòng bạch đàn PNCT3 PNCTIV phương pháp nuôi cấy mô” Đề tài khoa học - Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy (Mã số 15827/2019 - Cục Thông tin Khoa học công nghệ Quốc gia) Lê Thanh Hương, Nguyễn Nhật Linh, Bùi Mạnh Minh, Hà Hồng Hạnh, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nông Văn Hải, Hà Văn Huân, Lê Thị Thu Hiền (2017), Ứng dụng mã vạch DNA hỗ trợ định danh loại loài số mẫu sâm thuộc chi nhân Sâm Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, số 15 61 Lê Đình Khả, 2001 Báo cáo tổng kết đề tài “Bước đầu nghiên cứu lai giống cho số loài bạch đàn” 10 Lê Cơng Mạnh (2019 Khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu xác định ADN mã vạch cho loài lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata ” 11 Bộ Nông Nghiệp & PTNT (2016) Quyết định số 3893/ QĐ-BNN-TCLN ngày 20/9/2016 việc công nhận giống 12 Phan Quyền (2017) Phương pháp nuôi cấy mơ cho hai dịng bạch đàn lai UP54 UP99: giống lai giũa bạch đàn Uro (Eucalyptus urophyla) bạch đàn PELLITA (Eucalyptus pellita)” Luận văn thạc sỹ - Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật 13 Hoàng Minh Trang, Hà Văn Huân, Phạm Thành Trang, Dương Thị Hoa, Vũ Thị Bích Thuận (2016) Xác định đoạn mã vạch DNA (DNA Barcode) cho loài Hải đường vàng (Camellia tienii Ninh): phục vụ giám định lồi Tạp chí Nơng Nghiệp PTNT, số 7/2016, trang 240 -246 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Anders R, (2012) ADN barcoding as a tool for the identifcation of unknown plant material: A case study on medicinal roots traded in the medina of Marrakech M.SC thesis, Uppsala University CBOL ABS Brochure 15 Alvarez I.W.J.F (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenic inference Molecular phylogentics and Evolution 29: 417-434 16 Aron J.F, Kevin S.B, Prasad R.K, et al (2008) Multiple multilocus ADN barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well PLoS ONE 3(7): e2802 17 Blake, ST (1977): Four new species of Eucalyptus Austrobaileya 1–9 JSTOR 41738601 - Archives Journal, New York 18 Chase M.W, et al (2005) Land plants and ADN barcodes: Short-term and long-term goals Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360:1889-1895 62 19 Chaw Sein; Ralph Mitlöhner (2011) "Eucalyptus urophylla ST Blake Ecosystem and silviculture in Vietnam" International Forest Research Center 20 Chen S.Y.H, Han J, Liu C, Song J, et al (2010) Validation of the ITS2 region as a novel ADN barcodes for identifying medicinal plant species Plos one 5: e8613 21 DJ Boland , MIH Brooker , GM Chippendale , N Hall , BPM Hyland , RD Johnston , DA Kleinig , MW McDonald , JD Turner Forest Trees of Australia Nhà xuất Csiro , thg 12, 2006 - 768 trang 22 Ford C.S, Ayres K.L, Toomey N et al (2009) Selection of candidate coding ADN barcoding regions for use on ADN plants Botanical Journal of the Linnean Society 159 (1): 1-11 23 Hebert P.D, Ratnasingham S and De Waard J.R (2003).Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species Proceedings of the Royal Society of London B Biological Sciences, 270 (1): 96-99 24 Hebert, P.D., Cywinska A., and Ball S.L (2003) Biological identifications through DNA barcodes Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (1512): 313-321 25 Hill, Ken (1991) "New South Wales Flora Online: Eucalyptus grandis " Royal Botanic Gardens & Domain Trust, Sydney, Australia 26 Hollingsworth, P.M (2011) Refining the DNA barcode for DNA plants Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49):19451-19452 27 Jaakola L.S.M, Haggman H (2010) Novel approaches based on DNA barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species Food chemistry 123: 494-500 28 Ken Fern (2014)."Eucalyptus urophylla STBlake Myrtaceae" Useful tropical plant database 63 29 Kress J.W, Wurdack K.J, Zimmer E.A, Weigt L.A, Janzen D.H (2005) Use of ADN barcodes to identify flowering plants Proc Natl Acad Sci U.S.A 102 (23): 8369 - 74 30 Mark Y Stoeckle, Catherine C Gamble, Rohan Kirpekar, Grace Young, Selena Ahmed & Damon P Little (2011) Commercial Teas Highlight Plant DNA Barcode Identification Successes and Obstacles Sci Rep 1, 42; DOI:10.1038/srep00042 31 Nerea Larranaga José L Hormaza 2015, “DNA barcoding of perennial fruit tree species of agronomic interest in the genus Annona (Annonaceae)”, Frontiers in Plant Science 32 Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improvedin vitro plant regeneration DNA micropropagation of Rehmannia glutinosa L Journal of Medicial Plants Research, 3(1): 031-034 33 Scharaschklin T., Doyle J.A.( 2005) Phylogeny and historical biogeography of Anaxagorea (Annonaceae) using morphology and noncoding chloroplast sequence data Syst Bot 30: 712–735 34 Shih-Chieh lee, Chia-Hsiang Wang, Cheng-En Yen, Chieh Chang (2016) DNA barcode and identification of the varieties and provenances of Taiwan’s domestic and imported made teas using ribosomal internal transcribed spacer sequences Journal of food and drug analysis 25.pp260-274 35 Singh, D & Ahuja, P S (2006) 5S rDNA gene diversity in tea (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) and its use for variety identification Genome 49, 91–96 36 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14 64 37 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091 38 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective” Current science, 99: 1530 – 1540 39 Von Crautlein M.K.H, et al (2011) ADN barcoding: a tool for improved taxon identification and detection of species diversity Biodiversity and conservation 20: 373-389 40 W.Hill (1862), Indigenous wood samples in Queensland Queensland Natural and Industrial Products Directory : page 25 41 Wrigley, John; Fagg, Murray (2010) Eucalypts: A Celebration Allen & Unwin trang 84, 157, 217 42 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade” Genetics, 174: 1407-1420 PHỤ LỤC Phụ lục Hóa chất tách ADN tổng số Bảng P1 Thành phần đệm tách A (100ml) STT Thành phần TT 2%(w/v) CTAB (hexadecyl trimethyl ammonium Số lượng 2,0 g bromide) 100mM Tris (pH 8,0) (use 1M stock) 10 ml 20mM EDTA (use 0,5M stock) ml 1,4M NaCl 4%(w/v) PVP (polyvinyl pyrrolidone) 8,2 g 4,0 g 0,1%(w/v) ascobic acid 0,1 g 10mM β-mereaptoethanol (BME)* (use 14,3M stock) 70 µl H2O (dẫn nước tới 100ml) Tổng thể tích 100ml - Đệm tách B (EBB- Extraction Buffer B): pha 100ml Bảng P.2: Thành phần đệm tách B (100ml) TT Thành phần Số lượng 100mM Tris HCl (pH 8,0) (use 1M stock) 10 ml 50mM EDTA (use 0,5M stock) 2,5 ml 100mM NaCl 0,6 g 10mM β-mereaptoethanol (BME)* (use 14,3M 70 µl stock) H2O (dẫn nước tới 100ml) Tổng thể tích - Đệm TE (TE Buffer) 100ml Bảng P.3: Thành phần đệm TE (100ml) TT Số lượng Thành phần 10mM Tris (pH 8,0) (use 1M stock) 1,0 ml 1mM EDTA (use 0,5M stock) 50 ml H2O (dẫn nước tới 100ml) Tổng thể tích 100ml  Các hóa chất khác:  20% SDS (sodium doecyl sulphate)  5M CH3COOK (bảo quản -20OC)  3M CH3COONa (pH 5,2)  70% ethanol  100% isopropanol Phụ lục Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu  Một số dụng cụ sử dụng nghiên cứu:  Pipet 0,5-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl  Đầu tipe (10µl, 200µl, 1000µl)  Ống eppendorf 1,5ml, 20010µl  Một số thiết bị sử dụng nghiên cứu gồm :  Bể ổn nhiệt  Cân kỹ thuật điện tử  Máy ly tâm lạnh  Máy voltex  Lị vi sóng  Thiết bị chạy điện di  Máy nhân gen PCR (9700; 9800 Fast PCR)  Máy soi gel Phụ lục Thành phần môi trường MS sử dụng nghiên cứu Ký hiệu môi trường Thành phần Khối lượng (mg/l) Đa lượng NH4NO3 MS I MgSO4.7H2O KNO3 KH2PO4 MS II 1650 370 1900 170 CaCl2.2H2O 332,2 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 MnSO4.7H2O 16,9 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 Vi lượng MS III MS IV KI 0,83 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 Na2MoO4.2H2O 0,25 Myo- inositol 100 Vitamin Glycine MS V Nicotinic acid 0,5 Pyridoxxin HCl 0,5 Thiamin HCl 0,1