Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng lan huệ lai (hispeastrum equestre)

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đề xuất quy trình nhân giống một số dòng Lan huệ lai bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, đáp ứng sản xuất giống c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn khoa học này là trung thực, chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào khác

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học này đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Phạm Đức Trọng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo TS.Nguyễn Hạnh Hoa

- Bộ môn Thực vật - Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã hướng dẫn tận tình, chỉ bảo cặn kẽ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, cũng như trong suốt quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy giáo, Cô giáo cùng toàn thể các cán bộ nhân viên trong Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã quan tâm giúp đỡ tôi và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi thực hiện Luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn tốt nghiệp này

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Phạm Đức Trọng

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH viii

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây Lan huệ 4

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại cây Lan huệ 4

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của Lan huệ tại Việt Nam 4

2.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của cây Lan huệ 6

2.1.4 Kỹ thuật trồng và chăm sóc 7

2.1.5 Giá trị kinh tế và sử dụng của cây Lan huệ 7

2.2 Tình hình sản xuất Lan huệ trong nước 9

2.3 Một số phương pháp nhân giống vô tính hoa Lan huệ 10

2.3.1 Phương pháp tách củ con 10

2.3.2 Phương pháp cắt lát (Chipping) 10

2.3.3 Nhân nhanh In vitro 12

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 13

2.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở trong nước và trên thế giới 14

2.4.1 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở Việt Nam 14

2.4.2 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ trên thế giới 17

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Đối tượng, vật liệu, điều kiện, địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng 18

3.1.2 Vật liệu 19

3.1.3 Điều kiện nuôi cấy 20

3.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

3.2 Nội dung nghiên cứu 20

3.2.1 Giai đoạn nuôi cấy khởi động: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin: BA, Kinetin đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy 20

3.2.2 Giai đoạn nhân nhanh 21

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro 23

3.2.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 24

3.2.5 Giai đoạn vườm ươm 25

3.2.6 Các chỉ tiêu theo dõi 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 27

3.3.2 Phương pháp tiến hành 28

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 29

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

4.1 Giai đoạn nuôi cấy khởi động 30

4.2 Giai đoạn nhân nhanh 34

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến khả năng phát sinh chồi từ vảy củ đôi 34

4.2.2 Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất cytokinin và auxin đến hệ số nhân nhanh chồi từ chồi in vitro 38

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro 43

4.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 47

4.5 Giai đoạn vườm ươm 53

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

5.1 Kết luận 62

5.2 Đề nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 67

IBA : Indol butyric acid

MS : Murashige and Skoog, 1962

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của

mẫu 30 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng

phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy (Sau 4 tuần) 33 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA, kinetin và IBA đến khả năng tái sinh

chồi in vitro từ vảy củ đôi 36 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của BA, kinetin và α-NAA đến khả năng tái sinh

chồi in vitro từ vảy củ đôi 36 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của BA, kinetin và α-NAA đến khả năng phát

sinh chồi từ chồi in vitro 40

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của BA, kinetin và IBA đến khả năng phát sinh

chồi từ chồi in vitro 40 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in

vitro sau 4 tuần nuôi cấy 44

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in

vitro sau 4 tuần nuôi cấy 44

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ các dòng Lan

huệ lai in vitro 49

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ các dòng

Lan huệ lai in vitro 49

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng

và phát triển của cây Lan huệ lai sau in vitro 55

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của một số loại phân bón qua lá tới sự sinh

trưởng ở vườm ươm của cây Lan huệ lai sau in vitro 59

DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH

Trang

Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ tạo rễ mới của cây

Lan huệ lai sau in vitro 56

Hình 4.1 Ảnh hưởng của BA tới hệ số nhân chồi của sáu dòng lai hoa

Lan huệ (Sau 4 tuần) 32 Hình 4.2 Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa Auxin (α-NAA) và

cytokinin đến khả năng nhân nhanh chồi từ vảy củ đôi hoa Lan huệ lai (sau 4 tuần nuôi cấy) 38

Hình 4.3 Kết quả nhân nhanh tối ưu từ chồi in vitro của 6 dòng lai

Hoa Lan huệ (sau 4 tuần nuôi cấy) 42 Hình 4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa và hàm lượng đường

tới chất lượng củ in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 46

Hình 4.5 Ảnh hưởng α-NAA của đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ

của sáu dòng lai hoa Lan huệ (Sau 4 tuần) 52 Hình 4.6 Ảnh hưởng của một số loại giá thể tới khả năng hình thành

rễ cây con in vitro sau 4 tuần 57

Hình 4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể tới cây Lan

huệ lai ngoài vườn ươm 57 Hình 4.8 Ảnh hưởng của một số loại phân bón lá khác nhau tới các

dòng lai hoa Lan huệ ngoài vườn ươm 60

Lan huệ ((Hippeastrum equestre (Aiton) Herb.)), tên tiếng Anh là

Valentine flower Nếu như ở các nước Châu Âu, loài hoa này đã được sử dụng phổ biến làm quà tặng nhân dịp “Valentine” với nhiều giống hoa có màu

sắc đa dạng thì ở Việt Nam, Lan huệ còn rất nghèo nàn về màu sắc (chủ yếu

là màu đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại muộn hơn (khoảng từ giữa tháng 3 đến cuối tháng 5) lệch với thời gian lễ “Valentine” Như vậy để phát triển Lan huệ ở Việt Nam cần tiến hành nghiên cứu: Tăng độ đa dạng về màu sắc hoa

và chọn tạo giống có thời gian ra hoa phù hợp với dịp có nhu cầu tiêu thụ của thị trường

Để nhân giống vô tính cây Lan huệ có thể sử dụng các phương pháp: Tách củ nhỏ từ cụm cây mẹ (Siddique và cs., 2007); kỹ thuật cắt lát ((Epharath J.E., Ben-Asher., Baruchin F., Alekperov C., Dayan E &

Silerbush M (2001) hoặc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro (Husey,

1975; Seabrook và cs., 1976; De Buruyn, 1992; Chieh Li Huang và cs., 2005)

So với phương pháp nhân giống in vitro thì các phuơng pháp nhân giống khác

tuy đơn giản nhưng ít hiệu quả do thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp

Trong khi đó, phương pháp nhân giống in vitro có rất nhiều ưu điểm như tạo

được cây con sạch bệnh, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây

đồng nhất, đáp ứng được nhu cầu cả về số lượng và chất lượng giống Bên

cạnh đó, nhân giống in vitro các dòng Lan huệ lai còn phục vụ cho các công

tác nghiên cứu chọn tạo giống mới bằng kỹ thuật gây đột biến, chuyển gen Năm 2010, Nguyễn Thị Phương Thảo và cs đã bước đầu xây dựng quy trình nhân nhanh hai dòng hoa Lan huệ mạng và Loa kèn đỏ nhung

Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu chọn tạo giống hoa Lan huệ Tác giả

Nguyễn Hạnh Hoa và cs (2009, 2010) đã chọn tạo ra hàng loạt con lai có màu

sắc đa dạng, phong phú, đẹp mắt, độ bền hoa cao và có thời gian ra hoa đúng vào dịp valentine Điển hình là các dòng H1, H3, H5, H12, H37, H85 Các dòng lai trên có nhiều ưu điểm như có màu sắc hoa đẹp và khác biệt so với bố

mẹ, hoa có độ bền lâu Tuy nhiên có nhược điểm là sinh sản vô tính kém (trong điều kiện tự nhiên), đặc biệt là các dòng lai H1, H85 và H37 Để đánh giá và duy trì nguồn vật liệu quý trên thì việc nghiên cứu nhân nhanh vô tính các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết

Xuất phát từ những lý do nêu ở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng Lan huệ lai (Hippeastrum equestre)”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Xác định được các giai đoạn cơ bản trong quy trình kỹ thuật nhân giống

in vitro của một số dòng lai hoa Lan huệ

Góp phần bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân in vitro nhằm nhân nhanh một số dòng Lan huệ lai (Hippeastrum equestre)

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định môi trường thích hợp trong việc khởi động mẫu cho sự phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy

- Xác định môi trường nhân nhanh thích hợp để làm tăng hệ số nhân chồi

- Xác định môi trường ra rễ phù hợp để tạo cây hoàn chỉnh

- Xác định một số yếu tố kỹ thuật cần thiết chăm sóc cây sau in vitro

ngoài vườn ươm: (Tiêu chuẩn cây phù hợp; giá thể thích hợp; loại phân bón qua lá phù hợp)

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp những dữ liệu khoa học mới

về nhân giống vô tính cây Lan huệ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thông tin cần thiết làm cơ

sở cho việc xây dựng hoàn thiện quy trình nhân giống Lan huệ sản xuất hàng hóa có thương hiệu riêng và hiệu quả kinh tế cao

- Các kết quả nghiên cứu của đề tài có thể sử dụng để giảng dạy và nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào cây hoa

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đề xuất quy trình nhân giống một số dòng Lan huệ lai bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, đáp ứng sản xuất giống có hiệu quả, chất lượng tốt, khắc phục được những hạn chế của nhân giống truyền thống, duy trì và nhân nhanh kiểu gen được chọn lọc

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây Lan huệ

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại cây Lan huệ

Theo Dương Đức Tiến, Võ Văn Chi (1978), Nguyễn Tiến Bân (1997),

Trong hệ thống phân loại thực vật, Lan huệ có tệ khoa học là Hispeastrum

esquetre Herb, thuộc họ Liliaceae, Hành ( Liliales), phân lớp Hành ( Liliidae), lớp thực vật một lá mầm (Liliopsida) [3],[4]

Có rất nhiều cách để Việt hóa tên loài hoa này, như: Loa kèn, Lan huệ, Huệ đất, Lan tứ diện, Tứ diện, Tứ hướng, Tứ diện xích lan, Huệ loa kèn, Mạc chu lan,… tùy theo vùng miền, tùy theo sở thích mỗi người

Ở châu Âu, người ta gọi là hoa Tình yêu, tiếng Anh là Valentine Flower bởi vì Lan huệ nở hoa trong khoảng đầu năm, vào dịp lễ hội tình yêu (14/2) theo phong tục của nhiều nước châu Âu Do có nhiều loại hoa, mỗi loại

có màu sắc đẹp riêng nên được các bạn trẻ ưa thích và tặng nhau, cái tên hoa tình yêu ra đời từ đó

Theo Võ Văn Chi, 2004 và Nguyễn Thị Đỏ, 2007 Cây Lan huệ có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được trồng khắp Châu Mỹ nhiệt đới, từ Mêhico và phía Nam Tây Ấn đến Brazil và Chile [4]

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của Lan huệ tại Việt Nam

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Theo Nguyễn Thị Đỏ, 2007 [6]; Lan huệ có dạng thân hành, hình cầu, có

áo mỏng bao ở ngoài

2.1.2.2 Lá cây

Lá tập trung ở gốc gần như thành 2 dãy, phiến lá hình dải, màu xanh đậm, kích thước (30)45-50(60) x 2-4(5)cm, hình kiếm hoặc hình dải mác, hơi khum

thành hình máng, dai, cứng, có nhiều gân sọc song song và gân phụ ngang song song, mép hơi cong xuống, chóp tù Gốc lá dạng bẹ ôm lấy nhau

Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, gồm 2 cái, mỏng, kích thước 6-7 x 3-4 cm, màu trắng xanh, mỏng, 2 chiếc, tồn tại

2.1.2.3 Hoa

Cụm hoa tán, 2- 4 hoa, trên một cuống hoa chung có hình trụ, dài 30-50

cm, đường kính 1,5-2 cm ,thẳng đứng và rỗng, mặt ngoài phủ phấn trắng Hoa to khi nở đường kính tới 15 cm, đều, lưỡng tính,màu sắc sặc sỡ, màu đỏ hoặc đỏ cam, có cuống dài 4-5 cm, gốc màu xanh hoặc xanh vàng hoặc vàng trắng

Bao hoa hình phễu, dài 9-12 cm, nằm ngang hoặc rủ xuống, 6 mảnh, dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, dài 2-3,5 cm, họng có 1 vòng vảy ngắn hoặc 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, hình trứng xếp 2 vòng, các thùy bằng nhau hoặc các thùy vòng trong hẹp hơn Nhị 6; chỉ nhị rời nhau, hình trụ dài 6-7 cm, đầu hơi cong đính ở họng ống bao hoa, nghiêng về một phía; bao phấn hình trụ, dài 2-2,5 cm, màu trắng ngà,2 ô, đính lưng , hướng trong, mở bằng khe dọc

Bầu ha, dài 1,2-1,5 cm 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhụy dài tới 10 cm, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hoặc 3 thùy, màu trắng

2.1.2.4 Củ và rễ

Củ con: Lan huệ có các củ con (thân hành con) sinh ra từ củ mẹ, chu vi

của củ con từ 3-6 cm, số lượng củ con trung bình từ 1-3 củ/cây

Rễ:cây thuộc bộ Lilliales nên có hệ rễ chùm gồm nhiều rễ phụ tương đối

đồng đều về kích thước

2.1.2.5 Quả

Quả nang, hình cầu hoặc hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh Hạt nhiều, dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ

Ở nước ta, cây Lan huệ thường ra hoa vào mùa xuân- hè, thường được trồng làm cảnh, hoa rất đẹp

2.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của cây Lan huệ

Cây mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, được nhập vào Việt Nam, trồng trong vườn hoa, trong chậu Cây ra hoa vào mùa xuân- hè Tuy nhiên

có rất nhiều nghệ nhân trồng hoa quan tâm tới thời điểm nở hoa vào đúng dịp Tết Nguyên Đán Chính vì thế, các yếu tố ngoại cảnh là những điều kiện vô cùng quan trọng mà chúng ta cần chú ý đối với việc sinh trưởng phát triển của cây [2]

2.1.3.1 Nhiệt độ

Lan huệ có khả năng chịu nóng, ưa khí hậu lạnh và ẩm Nhiệt độ thích hợp ban ngày từ 20-28oC, ban đêm 13-17oC, dưới 5oC và trên 30oC cây sinh trưởng kém, hoa dễ bị mù Giai đoạn đầu nhiệt độ thấp có lợi cho sinh trưởng của rễ và sự phân hoá hoa

2.1.3.2 Ánh sáng

Lan huệ là cây ưa cường độ ánh sáng trung bình, cường độ ánh sáng thích hợp từ 12.000-15.000lux nhất là thời kỳ cây cao 20-30cm Người trồng Lan huệ luôn biết muốn điều khiển độ dài của lá và chiều cao của vòi hoa, chỉ cần điều tiết ánh sáng Cây nhiều ánh sáng có vòi hoa và lá ngắn, cây mọc trong bóng râm thường cao và lá dài

2.1.3.3 Nước

Thời kỳ đầu cây rất cần nước, khi ra hoa giảm bớt nước Nhiều nước dễ làm cho củ bị thối, rụng nụ Độ ẩm đất thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của cây (thường từ 70-85%)

2.1.3.4 Đất

Đất tơi xốp, không chứa mầm bệnh và thoát nước tốt Lan huệ rất mẫn cảm với muối, nồng độ muối trong đất cao, cây không hút được nước ảnh

hưởng tới sinh trưởng, ra hoa Nói chung, hàm lượng muối trong đất không được cao quá 1,5mg/cm2, lượng hợp chất Clo không được vượt quá 1,5mmol/lít, pH = 6,5-7,0

2.1.4 Kỹ thuật trồng và chăm sóc

Hispeastrum equestre có khả năng duy trì bộ lá xanh quanh năm nên vẫn

giữ được màu xanh trong suốt mùa đông Vào những tháng có nhiệt độ xuống thấp, cây vẫn có thể được trồng ngoài trời nhưng nên phủ rơm rạ hoặc lá khô quanh gốc để hạn chế tác hại

Nhiều giống thuộc chi Hispeastrum có khả năng sinh trưởng phát triển tốt

hơn khi được trồng trong điều kiện che bóng nhẹ Vì vậy, có thể trồng cây dưới tán cây lớn hoặc đưa chậu trồng cây vào ban công, hiên nhà, cây vẫn phát triển tốt

Ở nước ta, cây ra hoa vào mùa xuân - hè, vào khoảng tháng 3 cho đến hết tháng 5, nở tập trung nhất vào cuối tháng 3 đầu tháng 4, thường được trồng làm cảnh, hoa rất đẹp

Trồng củ huệ đúng bài bản nhất là chỉ chôn 2/3 củ xuống đất Chất trồng phù hợp với Lan huệ trồng chậu là loại không có đất (soilless) vì tự thân

củ Lan huệ đã tích trữ được khá nhiều nước trong các bẹ lá của cây nên nếu chất trồng không thoát nước tốt sẽ dễ gây tổn hại đến củ Lan huệ Kinh nghiệm cho thấy rằng nếu chất trồng thông thoáng, Lan huệ sẽ ra rất nhiều rễ

và lá và đến khi cây trổ bông thường cho nhiều vòi hoa cùng lúc [2]

2.1.5 Giá trị kinh tế và sử dụng của cây Lan huệ

Trên thế giới, nhiều loài thuộc chi Hispeastrum được trồng làm cảnh

bởi chúng có ưu điểm là hoa to, đẹp, khá đa dạng về màu sắc, có thể sử dụng dưới dạng hoa cắt cành, trồng chậu hoặc trồng thảm Hoa được sử dụng trong ngày lễ, ngày tết, được trang trí trong nội thất, hoặc làm quà tặng rất trang trọng Hoa mang hương thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, làm tăng vẻ đẹp, tăng sức sống cho mọi người [7]

Ở Việt Nam, chi Hippeastrum có 2 loài, 1 thứ, trong đó một loài được

trồng làm cảnh Hoa được sử dụng trong những ngày lễ, ngày tết, được trang trí trong hội trường, công viên, làm quà tặng rất trang trọng, trong gia đình hoa mang hương thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, làm tăng vẻ đẹp, tăng sức sống cho mọi người

Bên cạnh đó, Lan huệ (Hippeastrum equestre) là một trong những loài hoa có tiềm năng phát triển của chi Hippeastrum không chỉ do màu sắc đa

dạng, hấp dẫn mà còn do bởi trong củ của nó có chứa các biệt dược giá trị như các loại alkaloids (Funganti, 1975), các lectins có hoạt tính chống siêu vi trùng, chống sưng viêm, chống ung thư, chữa bệnh Alzheimer, cầm máu và chữa vết thương Các alkaloids trong Lan huệ đang được nghiên cứu về một

số tác động dược học Trong số các alkaloids, lycorine (tên cũ Narcissine) là chất được chú ý nhất Narcissine được cô lập vào 1578, là một alkaloid rất bền Đến 1920, narcissine được chứng minh là có cùng cấu trúc với lycorine, trích từ Lycoris radiata, và từ đó tên narcissine bị bỏ Lycorine là một alkaloid loại isoquinolone (chuyển hóa từ phena thridine), có phân tử lượng 287.32, có các hoạt tính sinh học loại cholino mimetic; ức chế hoạt tính sinh học của men acetylcholinesterase Các hoạt tính của Lycorine có tác dụng chống siêu

vi trùng : Lycorine có hoạt tính ức chế hoạt động tái lập của siêu vi trùng HIV-1, khi thử trên dòng tế bào MT4.(Planta Medica Số 70-2004) Lycorine

ức chế sự phát triển của siêu vi trùng coronavirus gây bệnh SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) ở liều EC50 (Effective Concentration) = 15.7 +/- 1.2 nM và đang được nghiên cứu thêm để làm thuốc trị SARS (Antiviral Research Số 67-2005) Ngoài ra, Lycorine có tác dụng chống sưng-viêm do

ức chế sự sản xuất TNF-alpha (tumor necrosis factor) nơi các đại thực bào của chuột thử nghiệm; ức chế tiến trình sinh tổng hợp proteins Vì TNF-alpha là một chất cytokine căn bản điều hòa tiến trình sưng viêm nên lycorine có triển vọng được dùng làm thuốc chống sưng, trị thấp khớp

Trong Đông dược, Lan huệ là một vị thuốc quan trọng vì củ có vị ngọt cay, tính ấm có độc, có tác động tán ứ, tiêu thũng Thân hành của cây được dùng giã nát đắp cầm máu và trị tổn thương khi té ngã

Ngoài ra, việc phục vụ nhu cầu giải trí thưởng thức, hoa Lan huệ còn mang lại lợi ích kinh tế khá cao Hiện nay, trên thị trường các loài hoa Lan huệ mới được bán với giá khá cao từ 5.000 – 20.000đ/cành Thu nhập từ 150 – 200 triệu đồng/ha/năm

2.2 Tình hình sản xuất Lan huệ trong nước

Trước giờ ở Việt Nam hoa Lan huệ (Hippeastrum) chỉ có một màu đỏ

là nhiều nhưng không mấy người chú ý bởi vì quanh năm suốt tháng nó chỉ có độc một màu lá xanh biếc Hoa Lan huệ chỉ trổ bông mỗi năm một lần, có khi đôi lần nhưng không nhiều cây được như thế [7]

Người Việt Nam ta thường để Lan huệ tự sinh tự dưỡng ở bờ rào góc vườn, không trân trọng và quan tâm cho lắm Do Lan huệ là loại cây dễ sống, phát triển mạnh và cũng đẻ cây con rất nhiều, mỗi năm từ một củ có thể nảy thêm từ 1-5 cây con

Vì khả năng sống tốt như vậy nên Lan huệ bị quên lãng mãi cho đến vài năm trở lại đây người yêu thích Lan huệ cứ tăng dần và nhiều giống huệ có màu khác hơn màu đỏ được mọi người săn lùng Và cũng đã có nhiều người bắt đầu học tập quy trình ép Lan huệ trổ bông vào những dịp năm mới vì Lan huệ có màu đỏ được cho là sẽ đem lại may mắn

Lan huệ có rất nhiều màu khác nhau, rất phong phú đa dạng, nhưng ở Việt Nam rất khó mua đúng màu, vì những củ Lan huệ không được đóng bao

bì có nhãn mác rõ ràng như ở nước ngoài Vì thế Lan huệ trong vườn nhà ở nước ta thường chỉ có một màu đỏ duy nhất

2.3 Một số phương pháp nhân giống vô tính hoa Lan huệ

2.3.1 Phương pháp tách củ con

Trong quá trình sinh trưởng phát triển, một củ Lan huệ có thể đẻ ra nhiều củ con ở xung quanh Có thể tách những củ con đem trồng Củ con sau khi tách có khả năng sống rất cao và sớm cho hoa, thông thường sau 18-24 tháng cây sẽ cho hoa

Khi đường kính củ con được 2-3 cm thì tách khỏi cây mẹ, có thể trồng trong chậu đất hoặc chậu nhựa, nếu trồng trong chậu đất thì cần phải tưới nước thường xuyên hơn là trong chậu nhựa Nhúng phần đế của củ cùng với

bộ rễ trong nước ấm, điều này có tác dụng làm mềm rễ và thuận lợi cho bộ rễ lan ra khắp chậu Khoét một hố trên bề mặt đất rộng hơn đường kính củ, đặt

củ vào hố sao cho 1/3 củ nổi trên mặt đất [19]

2.3.2 Phương pháp cắt lát (Chipping)

Kỹ thuật cắt lát (chipping) được sử dụng khá phổ biến nhất là đối với những cây họ Hành có củ (là những lớp vảy xếp khít nhau xung quanh đỉnh

sinh trưởng trung tâm) như chi Hippeastrum, Narcissus (hoa thủy tiên),

Galanthus Các bước tiến hành [19]:

1 Chọn những củ Lan huệ bố mẹ khoẻ mạnh không bị nấm bệnh, nhổ

4 Các lát được ngâm trong dung dịch thuốc diệt nấm khoảng 10-15 phút lắc đều, sau đó được vớt ra để ráo nước

5 Cho mỗi lát vào trong 1 túi nilon có chứa đá trân châu có thêm chất khoáng, cho nhiều khí vào túi và buộc kín túi Đưa vào nơi mát và tối với nhiệt độ thích hợp 20-21oC, thường xuyên kiểm tra dấu hiệu thối hỏng

6 Sau khoảng 12 tuần các hành con sẽ xuất hiện ở gốc của lát cắt Tách các cây con trồng vào giá thể tơi xốp và thoát nước Cây con rất bé và yếu ớt nên cần đặt dưới ánh sáng tán xạ một thời gian trước khi đưa ra ngoài ánh sáng trực tiếp

Phải mất khoảng 2-4 năm cây mới sinh trưởng phát triển thành thục và cho hoa Ở Việt Nam, mùa đông không có tuyết và sương giá nên cây sẽ lớn nhanh hơn và cho hoa sớm hơn so các nước ở xứ lạnh

2.3.3 Nhân nhanh In vitro

Phương pháp này có ưu điểm là tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên cây có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao Đồng thời, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất do vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định, có thể cung ứng cho sản xuất trên quy mô rộng

Đã có một số nghiên cứu bước đầu về nhân in vitro cây Lan huệ, các

tác giả cho biết: Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo chồi ở cây Lan huệ

(Loa kèn đỏ nhung Hippeastrum equestre Herb.) là môi trường MS có bổ

sung 5 mg/l BA (Nguyễn Hạnh Hoa và cs, 2009) và cây Lan huệ mạng là môi trường MS có bổ sung 3 mg/l BA, 100% mẫu tái sinh tạo chồi và củ nhỏ Chồi và củ nhỏ tạo ra được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh Đa số các

chồi đều ra rễ Các cây con in vitro hoàn chỉnh được đưa ra thích nghi với

điều kiện giá thể cát và trấu hun theo tỷ lệ 1:1 [13],[14]

Các giai đoạn nhân giống in vitro

2.3.3.1 Giai đoạn chuẩn bị

Nhằm tạo ra cây giống tốt, bước đầu tiên rất quan trọng là phải chọn cây mẹ khỏe, sạch bệnh, có đủ đặc tính mà ta quan tâm Trên cây mẹ, có thể

sử dụng nhiều cơ quan, bộ phận khác nhau làm mô nuôi cấy như: Đỉnh chồi, mắt ngủ, mô lá non, vảy củ, bao phấn…

2.3.3.2 Khử trùng mô nuôi cấy

Do mô nuôi cấy đưa từ ngoài vào có chứa rất nhiều vi sinh vật Vì vậy cần khử trùng mô nuôi cấy trước khi đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo tạo ra nguồn vật liệu thực vật vô trùng hoặc có tỷ lệ nhiễm vi sinh vật thấp, tỷ

lệ mẫu sống sinh trưởng tốt và cao Giai đoạn này phụ thuộc vào thời gian khử trùng và nồng độ chất khử trùng

Các hóa chất thường được sử dụng để khử trùng là HgCl2 0,1% từ 5 đến 10 phút, NaClO 1% từ 15 – 20 phút, cồn 700, H2O2, Johnson 10%

2.3.3.3 Giai đoạn nuôi cấy khởi động

Ở giai đoạn này mô nuôi cấy sau khi được khử trùng được chuyển vào môi trường thích hợp về tỷ lệ và hàm lượng các chất điều tiết sinh trưởng để kích thích mẫu cấy hình thành chồi bất định, các phôi vô tính hay kích thích các chồi nách, mắt ngủ bật mầm

2.3.3.4 Giai đoạn nhân nhanh

Là giai đoạn quan trọng của quá trình nhân giống in vitro vì giai đoạn này xác định hệ số nhân của quá trình nhân giống in vitro Môi trường nuôi

cấy nhân tạo có các chất điều tiết sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin, đồng thời phải chú y đảm bảo những điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, quang chu kì…

2.3.3.5 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Là giai đoạn chuyển những chồi đã hình thành trong giai đoạn nhân nhanh sang môi trường tạo rễ để hình thành cây có đủ rễ, thân, lá, đủ tiêu chuẩn là cây giống Môi trường tạo rễ thường bổ sung α NAA để kích thích hình thành rễ

2.3.3.6 Giai đoạn đưa cây in vitro ra đất

Đây là bước quyết định để đánh giá tính thực tiễn của quy trình nhân

giống in vitro Các loại giá thể trồng cây in vitro phải đảm bảo sạch nguồn

bệnh, xốp và thoáng khí, ngoài ra phải cung cấp đủ dinh dưỡng giúp cây con đạt tỷ lệ sống cao, sinh trưởng và phát triển tốt

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

Môi trường nuôi cấy: Là yếu tố quyết định cho sự sinh trưởng, phát triển của

mô trong nuôi cấy Môi trường nuôi cấy bao gồm một số thành phần cơ bản sau [15]

* Các nguyên tố đa lượng: Gồm N, P, K, S, Mg, Ca Chúng có chức

năng là nhiên liệu để xây dựng nên các thành phần cấu trúc của mô tế bào và

mô thực vật Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng phải > 30mg/l mặc dù tỷ

lệ giữa các nguyên tố này có thể biến đổi

* Các nguyên tố khoáng vi lượng: Bao gồm Fe, Bo, Mn, I, Mo, Cu, Zn

Chứng tham gia vào thành phần của các enzyme xúc tác cho phản ứng hóa sinh diễn ra trong tế bào Hàm lượng các yếu tố vi lượng thường < 30 mg/l

* Nguồn cacbon hữu cơ: Trong nuôi cấy mô, cây sinh trưởng, phát triển

được nhờ sự kết hợp cả 2 phương thức: Dị dưỡng và tự dưỡng Chính vì vậy,

bổ sung nguồn cacbon hữu cơ vào môi trường là cần thiết Nguồn cacbon hữu

cơ thường được sử dụng là đường saccaroza 2 – 3%

* Các vitamin : Các mô tế bào khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tổng

hợp vitamin nhưng lượng đó không đủ để cung cấp cho hoạt động sống của cây

do đó phải bổ sung các vitamin vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng thích hợp Thường bổ sung các vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6

* Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật: Là các chất đảm bảo cho việc

điều khiển sự phân hóa và phản phân hóa trong môi trường nuôi cấy in vitro,

thường sử dụng 2 nhóm Auxin và Cytokinin

* Các chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch nghiền

khoai tây, chuối được bổ sung vào môi trường nhằm làm tăng cường thêm các axit amin, vitamin cũng như thêm các yếu tố dinh dưỡng khác

* Agar: Là chất làm đông cứng môi trường tạo điều kiện cho mẫu cấy phát triển, sinh trưởng tốt

* pH môi trường: pH thích hợp cho phần lớn các mô nuôi cấy là 5,5 - 5,8

2.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở trong nước và trên thế giới

2.4.1 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở Việt Nam

Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào Tế bào càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu, khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu Như vậy tế bào phôi

thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào các đỉnh sinh trưởng đang ở trạng thái hoạt động (đỉnh ngọn, chóp rễ) và sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách) [14],[15],[16],[17]

Trong nhân giống in vitro, cây con có thể được tái sinh từ các điểm sinh

trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những

mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ Có hai phương pháp tái sinh cây con:

+ Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn, chồi hay chồi nách + Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo

Tái sinh trực tiếp (direct regeneration) từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài Cây con tạo ra theo đường này hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của cây mẹ

Trong đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus) Có thể thấy ngay là

hệ số nhân của con đường này vô cùng lớn Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo Nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo, thường xuất hiện những tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể không giống với tế bào ban đầu hoặc chứa những đột biến gen do hiện tượng nội nguyên nhân (endomitosits hay endoreduplication) Nội nguyên nhân là hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào trong thực tế và là một hiện tượng tự nhiên trong

cơ thể thực vật, nhưng tăng lên dưới ảnh hưởng của cá thành phần của môi trường dinh dưỡng và điều kiện cũng như phương pháp nuôi cấy, nhất là khi cấy chuyển nhiều lần Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng

những đặc tính di truyền (trueness – to – type) trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống Ngoài việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lý tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen

Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn

lọc người tư thường tái sinh cây theo đường hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọn lọc và cải tạo giống cây trồng

Sau khi có củ mẹ, ta cắt củ mẹ thành nhiều mảnh nhỏ (đế củ mang hai vảy củ) rồi trồng vảy củ xuống nền giá thể thích hợp Sau đó nuôi trồng 2 tháng thấy trên vảy củ xuất hiện chồi và củ nhỏ Các chồi và củ nhỏ này được nuôi trong 2 – 3 vụ sẽ thu được củ hoa Lan huệ trưởng thành Đây là phương pháp nhân giống cho hệ số nhân giống cao Tuy nhiên, nếu dùng củ mẹ bị nhiễm bệnh thì sự lây lan sang các vảy vẫn còn tồn tại

Việc lựa chọn mô nuôi cấy rất quan trọng, nghiên cứu về việc sử dụng vảy củ để nuôi cấy, trong các năm 2008 – 2009, TS Nguyễn Hạnh Hoa và cộng sự cho rằng đối với hoa Lan huệ, sử dụng vảy củ làm vật liệu khởi đầu rất dễ dàng và cho hiệu quả cao hơn nhiều so với sử dụng các bộ phận khác Tiếp đó, nhằm nhân nhanh các giống sạch bệnh, đáp ứng đa dạng hóa nguồn gen và sản xuất giống gốc [7]

Cũng trong năm 2010, TS Nguyễn Hạnh Hoa, TS.Nguyễn Thị

Phương Thảo và cộng sự đã nghiên cứu nhằm tìm ra các thông số thích hợp

hướng tới nhân giống in vitro cây Lan huệ mạng (Hispeastrum reticulatum

var striatifolium) [13],[14] Trên môi trường nền MS có bổ sung BA mẫu tái sinh chồi và củ in vitro cao Chồi và củ in vitro tiếp tục được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh và cũng thu được kết quả rất tốt Các cây con in vitro

sau đó được đưa ra môi trường, tỷ lệ sống sót cao, cây con sinh trưởng khoẻ mạnh.

2.4.2 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ trên thế giới

Seabrook và cs, 1976 đã phát hiện một kỹ thuật mới cho việc phát triển

các dòng lai (Hippeasrum sp.) bằng nuôi cấy mô [21] Từ các bộ phận của cây

như lá, bên trong các vảy củ và buồng trứng có thể được nuôi cấy thành công trong ống nghiệm và cây con dễ dàng phát sinh ở các nồng độ chất điều tiết sinh trưởng khác nhau Thậm chí một số cây con cũng phát sinh trong trường hợp không có chất điều tiết sinh trưởng Cây con cũng cảm ứng phát sinh rễ ngay vào trong môi trường tổng quát mà không cần tới chất đặc biệt nào được yêu cầu [15]

Hussey, 1975 cũng đã nghiên cứu nhân giống in vitro trên một số giống cây trong đó có Hippeastrum, ông chỉ ra rằng có thể nhân in vitro trên quy mô

củ và thân cây đối với những cây thuộc chi này [20]

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu, điều kiện, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu: Sáu dòng Lan huệ lai H1, H3, H5, H12, H37,

H85 (Hispeastrum esquestre).Các dòng lai là kết quả của phép lai hữu tính

Vật liệu sử dụng cho thí nghiệm là vảy củ đôi gồm 2 vảy có kích

thước 10x10 mm có dính phần đế củ và chồi in vitro (cây Lan huệ lai con phát sinh trong điều kiện nuôi cấy mô phát sinh chồi gắn liền với củ nhỏ in vitro)

Môi trường nuôi cấy:

Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962)

Các môi trường có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng, than hoạt tính, với các nồng độ khác nhau tùy từng thí nghiệm

Giá trị pH của môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trước khi khử trùng: 5,6

Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,1 atm trong

20 phút

Vật liệu ngoài vườn ươm:

Giá thể sử dụng: Cát, Trấu hun

Phân bón qua lá: Growmore và Đầu trâu 502

3.1.3 Điều kiện nuôi cấy

- Các dụng cụ được sử dụng trong nuôi cấy:

Dao, kéo, panh được vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn

Tủ cấy được vô trùng bằng đèn tử ngoại 20 – 30 phút

Nhiệt độ phòng nuôi: 25oC ± 2

Cường độ ánh sáng: 2000 lux

Độ ẩm 70%

Thời gian chiếu sáng: 14h sáng/ 10h tối

3.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện sinh học nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thời gian: Từ tháng 5/2013 – 5/2014

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Giai đoạn nuôi cấy khởi động: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm

chất cytokinin: BA, Kinetin đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy từ vảy củ đôi

Môi trường nền (MTN): MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar

Các mẫu cấy sau giai đoạn khử trùng, sạch bệnh được cấy vào môi trường dinh dưỡng có bổ sung BA ở các nồng độ dao động từ 0 – 4,0 mg/l Thí nghiệm 1 gồm 5 công thức như sau:

CT1: MTN + 0 mg/l BA (ĐC)

Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ BA cho hệ số nhân tốt nhất ở

thí nghiệm 1 + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar

Thí nghiệm 2 gồm 4 công thức như sau:

CT1: MTN + 0,5 mg/l Kinetin

CT2: MTN + 1,0 mg/l Kinetin

CT3: MTN + 1,5 mg/l Kinetin

CT4: MTN + 2,0mg/l Kinetin

3.2.2 Giai đoạn nhân nhanh

3.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp hai nhóm chất

auxin/cytokinin đến khả năng phát sinh chồi in vitro từ vảy củ đôi

Trong nuôi cấy tế bào, sự phối trộn giữa cytokinin và auxin ở nồng độ

và tỷ lệ thích hợp không những cho khả năng tái sinh chồi cao mà còn ảnh

hưởng tích cực đến số chồi hình thành cũng như sự sinh trưởng của chồi

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin và IBA đến khả năng phát sinh chồi in vitro từ vảy củ đôi

Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là vảy củ đôi có dính đế củ

Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ BA và Kinetin cho hệ số nhân

tốt nhất ở thí nghiệm 2 + 30g/l saccaroza + 6.5 g/l agar

Thí nghiệm 3 gồm 5 công thức như sau:

CT1: MTN + 0 mg/l IBA (ĐC)

Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là vảy củ đôi có dính đế củ

Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ BA và Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất ở thí nghiệm 2 +30g/l saccaroza + 6.5g/l agar

Thí nghiệm 4 gồm 5 công thức như sau:

3.2.2.2 Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất cytokinin và auxin đến hệ số

nhân nhanh chồi từ củ nhỏ in vitro

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của BA, Kinetin và α-NAA đến hệ số nhân chồi

từ chồi in vitro

Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là chồi in vitro

Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất

ở thí nghiệm 2 + Nồng độ α NAA phù hợp nhất trong thí nghiệm 4 + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar

Thí nghiệm 5 gồm 6 công thức như sau:

CT1: MTN + 0 mg/l BA (ĐC)

CT2: MTN + 1,0 mg/ BA

CT3: MTN + 2,0 mg/l BA

CT4: MTN + 3,0 mg/l BA

CT5: MTN + 4,0 mg/l BA

CT6: MTN + 5,0 mg/l BA

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của BA, Kinetin và IBA đến hệ số nhân chồi từ chồi in vitro

Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là củ nhỏ in vitro

Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất

ở thí nghiệm 2 + Nồng độ IBA phù hợp nhất trong thí nghiệm 3 + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar

Thí nghiệm 6 gồm 6 công thức như sau:

Môi trường nền (MTN): MS + 30g/l Saccaroza + 6,5g/l agar

Thí nghiệm 7 gồm 5 công thức như sau:

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng củ in vitro

Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là các củ nhỏ in vitro có kích

3.2.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của α NAA đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ

Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là các chồi nhỏ in vitro với

các tiêu chuẩn sau: cao 2,5 – 4,0 cm và có từ 2 lá trở nên

Môi trường nền (MTN): MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar

Thí nghiệm 9 gồm 5 công thức như sau:

Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là các chồi nhỏ in vitro với

các tiêu chuẩn sau: Cao 2,5 – 4,0 cm và có từ 2 lá trở nên

Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar

Thí nghiệm 10 gồm 4 công thức như sau:

CT1: MTN + 0 g/l than hoạt tính (ĐC)

CT2: MTN + 0,3 g/l than hoạt tính

CT3: MTN + 0,5 g/l than hoạt tính

CT4: MTN + 0,7 g/l than hoạt tính

3.2.5 Giai đoạn vườm ươm

Cây cao 4 – 5 cm, mọc 2 – 3 lá và có 3 – 4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra

ngoài vườn ươm Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar

bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm

Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ lai sau in vitro ngoài vườn ươm

Thí nghiệm có 3 công thức như sau:

CT1: Giá thể 100% Cát vàng

CT2: Giá thể 50% Cát vàng + 50% Trấu hun

CT3: Giá thể 75% Cát vàng+ 25% Trấu hun

Sử dụng phân bón qua lá Growmore 20:20:20 phun định kỳ 7 ngày/ lần

Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại phân bón qua lá tới sinh trưởng của cây Lan huệ lai sau in vitro ngoài vườm ươm

Thí nghiệm gồm các công thức như sau:

CT1: Phun nước qua lá (ĐC)

3.2.6 Các chỉ tiêu theo dõi

Giai đoạn nuôi cấy khởi động: 4 – 6 tuần

1 Tỷ lệ tạo mẫu PSHT ( %) = Σ Số mẫu PSHT × 100

Σ Số mẫu nuôi cấy

2 Hệ số nhân chồi

(chồi/mẫu) =

Σ Số chồi tạo thành

Σ Số mẫu nuôi cấy ban đầu

Giai đoạn nhân nhanh: 6 – 8 tuần

* Nhân nhanh t ừ vảy củ đôi

3 Hệ số nhân chồi

Σ Số chồi tạo thành

Σ Số mẫu nuôi cấy

4 Chiều cao TB của chồi (cm) = Σ Chiều cao các chồi theo dõi

Σ Số chồi ban đầu

5 Số lá TB của chồi (lá/chồi) = Σ Số lá các chồi theo dõi

Σ Số chồi ban đầu

* Nhân nhanh từ củ in vitro

6 Hệ số nhân chồi/Củ nhỏ in

Σ Số chồi tạo thành

Σ Số củ in vitro nuôi cấy

7 Chiều cao TB của chồi

Σ Chiều cao các chồi theo dõi

Σ Số chồi ban đầu

Giai đoạn ra rễ: 3 – 4 tuần

8 Tỷ lệ ra rễ (%) = Σ Số chồi ra rễ × 100

Σ Số chồi theo dõi

9 Số rễ trung bình/chồi (Rễ) = Σ Số rễ của các chồi theo dõi

Σ Số chồi theo dõi

10 Độ dài trung bình của rễ (cm) = Σ Chiều dài các rễ theo dõi

Σ Chiều cao các cây theo dõi

Σ Số cây theo dõi

13 Số lá trung bình

( lá/cây) =

Σ Số lá các cây theo dõi

Σ Số cây theo dõi

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm trong phòng được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB), mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại từ 5-10 bình (tùy từng thí nghiệm), mỗi bình cấy từ 3-4 mẫu

Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB), mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại trồng 5 chậu, mỗi chậu trồng 3 cây

3.3.2 Phương pháp tiến hành

3.3.2.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy được khử trùng theo quy trình: Vật liệu nuôi cấy là củ (thân hành) được thu hái, được làm sạch bề mặt dưới vòi nước chảy mạnh Sau đó,

củ được rửa sạch bằng xà phòng trong 10 phút và rửa lại dưới vòi nước sạch trong 5 phút Trong buồng cấy vô trùng, củ này được ngâm trong cồn 700

trong 30 giây, tráng lại bằng nước cất vô trùng 1 - 2 lần, mỗi lần trong 1 phút Tiếp theo ngâm mẫu trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút, rửa lại 4 – 5 lần bằng nước cất vô trùng, mỗi lần 1 phút Sau đó cắt mẫu ở kích thước mặc định và cấy vào môi trường vào mẫu cơ bản là MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar

3.3.2.2 Phương pháp nghiên cứu khởi động

Các mẫu sạch bệnh, xanh tốt sau giai đoạn khử trùng sẽ được chuyển sang môi trường có bổ sung BA và Kinetin để xác định ảnh hưởng của BA và Kinetin tới khả năng tái sinh, hệ số nhân và chất lượng chồi nuôi cấy từ vảy

củ đôi

3.3.2.3 Phương pháp nhân nhanh

Vảy củ tái sinh sau giai đoạn khử trùng, chồi in vitro hình thành từ mô

nuôi cấy khởi động được cấy vào môi trường nhân nhanh có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng

Củ nhỏ in vitro hình thành trong giai đoạn đầu tiên của quá trình nhân

nhanh được tách, bổ làm 4 phần và cấy vào các môi trường nhân nhanh có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng với các nồng độ khác nhau nhằm tăng hệ

số nhân của mẫu nuôi cấy

3.3.2.4 Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4 – 5 cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo

cây hoàn chỉnh Môi trường ra rễ là môi trường nền thích hợp có bổ sung các chất thuộc nhóm auxin và than hoạt tính

3.3.2.5 Phương pháp ươm cây

Các cây Lan huệ hoàn chỉnh trong bình được rửa sạch agar rồi trồng trên các giá thể khác nhau, tưới đẫm ngay sau khi trồng Sau đó tưới định kỳ 1 lần/tuần

Khi cây hồi xanh, phun phân bón qua lá 1 lần/tuần

Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 Giai đoạn nuôi cấy khởi động

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin: BA, kinetin đến sự

phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy

Với cả sáu dòng lai trên, vật liệu sử dụng để thí nghiệm là vảy củ đôi có

dính đế củ đã được chuẩn bị sau giai đoạn khử trùng với HgCl2 0,1% trong 10

phút và được theo dõi trong 2 tuần để lựa chọn được các mẫu sạch bệnh

không nhiễm nấm và khuẩn

Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu

nuôi cấy

Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + BA (0-4,0mg/l) + 6,5g/l agar

Với mục đích nhân in vitro đối với Lan huệ thì khả năng hình thành chồi của

mẫu nuôi cấy là yếu tố quyết định cho sự phát sinh hình thái của mẫu Để tăng

khả năng phát sinh chồi được tối đa, môi trường nuôi cấy cần được bổ sung

các chất kích thích sinh trưởng với nồng độ thích hợp Vì vậy, sau khi loại

nhiễm, các mẫu sạch bệnh sẽ được chuyển sang môi trường có bố sung BA

với các dải nồng độ khác nhau thay đổi từ 0 – 4,0mg/l Kết quả thí nghiệm

được trình bày trong bảng 4.1

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu

Nhận xét:

Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng

kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro

(Miller, 1961) Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin

trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro (Nguyễn Quang

Thạch, 2007) Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin

Bảng 4.1 cho thấy ở nồng độ BA từ 2.0 - 3.0 mg/l thì cho khả năng phát sinh hình thái của mẫu tốt nhất với cả sáu dòng lai

Nhìn chung, với cả sáu dòng lai trên thì tỷ lệ mẫu tạo chồi cao kéo theo

số chồi/mẫu cũng cao theo Khi bổ sung nồng độ BA tăng dần thì khả năng bật chồi của mẫu cũng lớn hơn so với công thức ĐC Tại nồng độ từ 2.0 - 3.0 mg/l BA, tỉ lệ tạo chồi cao nhất với H5 là 97.8% , và thấp nhất ở H85 là 61.3%; và số chồi/mẫu cao nhất với H5 là 3.05 và thấp nhất ở giống H12 là 1.79 chồi/mẫu

So với công thức ĐC, tỉ lệ phát sinh chồi ở các công thức có bổ sung

BA đều cao hơn Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA lên 4.0 mg/l BA thì các tỷ lệ chồi phát sinh này giảm xuống thấp hơn so với 3.0 mg/l BA trong công thức

3 Do đối với một số loài thực vật khi vượt quá nồng độ phù hợp, chất kích thích sinh trưởng sẽ là nguyên nhân chính ức chế sự sinh trưởng, phát triển ban đầu

Kết luận: Nồng độ BA phù hợp cho sự khởi động mẫu của sáu dòng lai là:

- Dòng lai H3, H5, H85: MS + 3,0mg/l BA

- Dòng lai H1, H12, H37: MS + 2,0mg/l BA