3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm trong phòng được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB), mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại từ 5-10 bình (tùy từng thí nghiệm), mỗi bình cấy từ 3-4 mẫu.
Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB), mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại trồng 5 chậu, mỗi chậu trồng 3 cây.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
3.3.2. Phương pháp tiến hành
3.3.2.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy được khử trùng theo quy trình: Vật liệu nuôi cấy là củ (thân hành) được thu hái, được làm sạch bề mặt dưới vòi nước chảy mạnh. Sau đó, củđược rửa sạch bằng xà phòng trong 10 phút và rửa lại dưới vòi nước sạch trong 5 phút. Trong buồng cấy vô trùng, củ này được ngâm trong cồn 700 trong 30 giây, tráng lại bằng nước cất vô trùng 1 - 2 lần, mỗi lần trong 1 phút. Tiếp theo ngâm mẫu trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút, rửa lại 4 – 5 lần bằng nước cất vô trùng, mỗi lần 1 phút. Sau đó cắt mẫu ở kích thước mặc định và cấy vào môi trường vào mẫu cơ bản là MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar.
3.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu khởi động
Các mẫu sạch bệnh, xanh tốt sau giai đoạn khử trùng sẽ được chuyển sang môi trường có bổ sung BA và Kinetin để xác định ảnh hưởng của BA và Kinetin tới khả năng tái sinh, hệ số nhân và chất lượng chồi nuôi cấy từ vảy củđôi.
3.3.2.3. Phương pháp nhân nhanh
Vảy củ tái sinh sau giai đoạn khử trùng, chồi in vitro hình thành từ mô nuôi cấy khởi động được cấy vào môi trường nhân nhanh có bổ sung các chất
điều tiết sinh trưởng.
Củ nhỏ in vitro hình thành trong giai đoạn đầu tiên của quá trình nhân nhanh được tách, bổ làm 4 phần và cấy vào các môi trường nhân nhanh có bổ
sung các chất điều tiết sinh trưởng với các nồng độ khác nhau nhằm tăng hệ
số nhân của mẫu nuôi cấy.
3.3.2.4. Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh
Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4 – 5 cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường nền thích hợp có bổ sung các chất thuộc nhóm auxin và than hoạt tính.
3.3.2.5. Phương pháp ươm cây
Các cây Lan huệ hoàn chỉnh trong bình được rửa sạch agar rồi trồng trên các giá thể khác nhau, tưới đẫm ngay sau khi trồng. Sau đó tưới định kỳ 1 lần/tuần
Khi cây hồi xanh, phun phân bón qua lá 1 lần/tuần.
3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và IRISTART 5.0 trên máy vi tính.
Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (độ tin cậy là 95%).
Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động
4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin: BA, kinetin đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy
Với cả sáu dòng lai trên, vật liệu sử dụng để thí nghiệm là vảy củđôi có dính đế củđã được chuẩn bị sau giai đoạn khử trùng với HgCl2 0,1% trong 10 phút và được theo dõi trong 2 tuần để lựa chọn được các mẫu sạch bệnh không nhiễm nấm và khuẩn.
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + BA (0-4,0mg/l) + 6,5g/l agar. Với mục đích nhân in vitro đối với Lan huệ thì khả năng hình thành chồi của mẫu nuôi cấy là yếu tố quyết định cho sự phát sinh hình thái của mẫu. Để tăng khả năng phát sinh chồi được tối đa, môi trường nuôi cấy cần được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng với nồng độ thích hợp. Vì vậy, sau khi loại nhiễm, các mẫu sạch bệnh sẽ được chuyển sang môi trường có bố sung BA với các dải nồng độ khác nhau thay đổi từ 0 – 4,0mg/l. Kết quả thí nghiệm
được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu BA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu (chồi) H1 H3 H5 H12 H37 H85 H1 H3 H5 H12 H37 H85 0 11,1 10,9 12,4 9,21 7,62 6,51 0,12 0,18 0,21 0,23 0,15 0,11 1,0 46,1 48,8 53,2 33,6 37,4 23,2 1,21 1,34 1,67 1,56 1,46 1,32 2,0 76,2 67,3 86,6 83,1 89,5 43,7 1,92 1,77 2,32 1,79 2,09 1,67 3,0 84,3 86,2 97,8 78,3 79,6 61,3 1,86 2,11 3,05 1,65 1,91 1,82 4,0 79,4 77,6 88,1 75,5 73,2 56,9 1,55 1,71 2,43 1,55 1,88 1,67 LSD 5% 0,11 0,14 0,23 0,11 0,15 0,14 CV (%) 4,5 5,4 6,5 4,4 5,4 6,0
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31 Nhận xét:
Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro
(Miller, 1961). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro (Nguyễn Quang Thạch, 2007). Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin...
Bảng 4.1 cho thấy ở nồng độ BA từ 2.0 - 3.0 mg/l thì cho khả năng phát sinh hình thái của mẫu tốt nhất với cả sáu dòng lai.
Nhìn chung, với cả sáu dòng lai trên thì tỷ lệ mẫu tạo chồi cao kéo theo số chồi/mẫu cũng cao theo. Khi bổ sung nồng độ BA tăng dần thì khả năng bật chồi của mẫu cũng lớn hơn so với công thức ĐC. Tại nồng độ từ 2.0 - 3.0 mg/l BA, tỉ lệ tạo chồi cao nhất với H5 là 97.8% , và thấp nhất ở H85 là 61.3%; và số chồi/mẫu cao nhất với H5 là 3.05 và thấp nhất ở giống H12 là 1.79 chồi/mẫu.
So với công thức ĐC, tỉ lệ phát sinh chồi ở các công thức có bổ sung BA đều cao hơn. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA lên 4.0 mg/l BA thì các tỷ lệ
chồi phát sinh này giảm xuống thấp hơn so với 3.0 mg/l BA trong công thức 3. Do đối với một số loài thực vật khi vượt quá nồng độ phù hợp, chất kích thích sinh trưởng sẽ là nguyên nhân chính ức chế sự sinh trưởng, phát triển ban đầu.
Kết luận: Nồng độ BA phù hợp cho sự khởi động mẫu của sáu dòng lai là: - Dòng lai H3, H5, H85: MS + 3,0mg/l BA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Hình 4.1. Ảnh hưởng của BA tới hệ số nhân chồi của sáu dòng lai hoa Lan huệ (Sau 4 tuần)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy
Vật liệu tiến hành thí nghiệm này là các vảy củ đôi dính kèm đế củ sau khi đã sạch bệnh. Các mẫu này sẽ được cấy vào môi trường với nồng độ thích hợp cho từng dòng lai từ 2,0 – 3,0 mg/l BA (cho hệ số nhân chồi tốt nhất ở thí nghiệm 1). Tuy nhiên, ngoài BA thì kinetin cũng là một cytokinin kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, lại cho chất lượng chồi đẹp. Việc bổ sung kinetin sẽ hoạt hóa quá trình tổng hợp axit nucleic và protein, ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Vì vậy, trong thí nghiệm 2, các mẫu sẽ được cấy vào môi trường
được bổ sung thêm kinetin với các dải nồng độ thay đổi từ 0.5 – 2.0 mg/l. Kết quả thí nghiệm được trình bày qua bảng 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy (Sau 4 tuần)
Kinetine (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu (chồi) H1 H3 H5 H12 H37 H85 H1 H3 H5 H12 H37 H85 0,5 100 100 100 100 100 100 1,97 2,23 3,09 2,41 2,22 1,88 1,0 100 100 100 100 100 100 2,34 2,55 3,32 2,06 2,49 2,29 1,5 100 100 100 100 100 100 2,21 2,12 2,76 1,87 2,06 1,76 2,0 100 100 100 100 100 100 2,09 1,98 1,99 1,78 1,45 1,59 LSD5% 0,21 1,44 0,21 0,15 0,16 0,21 CV(%) 5,3 3,5 4,1 3,8 4,2 5,9 Nhận xét:
Trong nuôi cấy mô tế bào, BA và kinetin đều có tác dụng quyết định hình thành chồi nhưng được sử dụng ở nồng độ và tỷ lệ khác nhau phụ thuộc vào đặc điểm từng loài, từng giai đoạn khác nhau.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Khi bổ sung Kinetin vào tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt cao nhất do có nồng độ
BA tối ưu. Từ bảng 4.2 ta nhận thấy, tại nồng độ 1.0 mg/l Kinetin, cả 6 dòng lai đều cho khả năng phát sinh hình thái cao. Cụ thể với H3 thì số chồi/mẫu
đạt 2,55 chồi còn H5 đạt 3,32 chồi và thấp nhất ở giống H12 đạt 2,06 chồi/mẫu. Do vậy, Việc bổ sung nồng độ kinetin giúp cho tỉ lệ phát sinh chồi cao hơn so với ĐC, nhưng khi vượt qua mức độ phù hợp thì sựảnh hưởng đi theo hướng ngược lại và thấp hơn so với ĐC. Tại nồng độ 2,0 mg/l kinetin mẫu H3 giảm 0,57 chồi/mẫu và H5 giảm xuống 1,33 chồi/mẫu.
Như vậy khi bổ sung thêm Kinetin tăng hiệu quả cho sự phát triển chồi trong nuôi cấy mô. Nồng độ thích hợp nhất cho sự kết hợp giữa hai chất cytokinin này là 2,0 – 3,0mg/l BA và 1,0mg/l Kinetin.
4.2. Giai đoạn nhân nhanh
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến khả năng phát sinh chồi từ vảy củđôi