Seabrook và cs, 1976 đã phát hiện một kỹ thuật mới cho việc phát triển các dòng lai (Hippeasrum sp.) bằng nuôi cấy mô [21]. Từ các bộ phận của cây như lá, bên trong các vảy củ và buồng trứng có thểđược nuôi cấy thành công trong ống nghiệm và cây con dễ dàng phát sinh ở các nồng độ chất điều tiết sinh trưởng khác nhau. Thậm chí một số cây con cũng phát sinh trong trường hợp không có chất điều tiết sinh trưởng. Cây con cũng cảm ứng phát sinh rễ
ngay vào trong môi trường tổng quát mà không cần tới chất đặc biệt nào được yêu cầu [15].
Hussey, 1975 cũng đã nghiên cứu nhân giống in vitro trên một số giống cây trong đó có Hippeastrum, ông chỉ ra rằng có thể nhân in vitro trên quy mô củ và thân cây đối với những cây thuộc chi này [20].
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18
PHẦN III
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, vật liệu, điều kiện, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu: Sáu dòng Lan huệ lai H1, H3, H5, H12, H37, H85 (Hispeastrum esquestre).Các dòng lai là kết quả của phép lai hữu tính giữa các dòng bố mẹ sau:
Ký hiệu dòng Lan huệ lai
Nguồn gốc tổ hợp lai Màu sắc H1 ♂Đỏ TrNhung x ắng ♀ H3 ♂Đỏ ♀Đỏ Sọc Nhung Trắng x H5 ♂ Trắng x ♀Đỏ Sọc Trắng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19 H12 ♂TrSắngọc T x rắng♀Đỏ H37 ♂Đỏ ♀Đỏ Sọc Nhung Trắng x H85 ♂Đỏ Sọc Trắng x ♀Đỏ Nhung 3.1.2. Vật liệu
Vật liệu sử dụng cho thí nghiệm là vảy củ đôi gồm 2 vảy có kích thước 10x10 mm có dính phần đế củ và chồiin vitro (cây Lan huệ lai con phát sinh trong điều kiện nuôi cấy mô phát sinh chồi gắn liền với củ nhỏin vitro).
Môi trường nuôi cấy:
Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962).
Các môi trường có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng, than hoạt tính, với các nồng độ khác nhau tùy từng thí nghiệm.
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trước khi khử
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,1 atm trong 20 phút.
Vật liệu ngoài vườn ươm: Giá thể sử dụng: Cát, Trấu hun.
Phân bón qua lá: Growmore và Đầu trâu 502.
3.1.3. Điều kiện nuôi cấy
- Các dụng cụđược sử dụng trong nuôi cấy:
Dao, kéo, panh được vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn.
Tủ cấy được vô trùng bằng đèn tử ngoại 20 – 30 phút. Nhiệt độ phòng nuôi: 25oC ± 2
Cường độ ánh sáng: 2000 lux
Độ ẩm 70%
Thời gian chiếu sáng: 14h sáng/ 10h tối.
3.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện sinh học nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian: Từ tháng 5/2013 – 5/2014
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin: BA, Kinetin đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi chất cytokinin: BA, Kinetin đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy từ vảy củđôi
Môi trường nền (MTN): MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar.
Các mẫu cấy sau giai đoạn khử trùng, sạch bệnh được cấy vào môi trường dinh dưỡng có bổ sung BA ở các nồng độ dao động từ 0 – 4,0 mg/l.
Thí nghiệm 1 gồm 5 công thức như sau: CT1: MTN + 0 mg/l BA (ĐC)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 CT2: MTN + 1,0 mg/l BA
CT3: MTN + 2,0 mg/l BA CT4: MTN + 3,0 mg/l BA CT5: MTN + 4,0 mg/l BA
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy từ vảy củđôi
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là vảy củ đôi có dính đế củ, sạch bệnh.
Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ BA cho hệ số nhân tốt nhất ở
thí nghiệm 1 + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar. Thí nghiệm 2 gồm 4 công thức như sau: CT1: MTN + 0,5 mg/l Kinetin
CT2: MTN + 1,0 mg/l Kinetin CT3: MTN + 1,5 mg/l Kinetin CT4: MTN + 2,0mg/l Kinetin
3.2.2. Giai đoạn nhân nhanh
3.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp hai nhóm chất
auxin/cytokinin đến khả năng phát sinh chồi in vitro từ vảy củđôi
Trong nuôi cấy tế bào, sự phối trộn giữa cytokinin và auxin ở nồng độ
và tỷ lệ thích hợp không những cho khả năng tái sinh chồi cao mà còn ảnh hưởng tích cực đến số chồi hình thành cũng như sự sinh trưởng của chồi.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin và IBA đến khả năng phát sinh chồi in vitro từ vảy củđôi
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là vảy củđôi có dính đế củ. Môi trường nền(MTN): MS + Nồng độ BA và Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất ở thí nghiệm 2 + 30g/l saccaroza + 6.5 g/l agar.
Thí nghiệm 3 gồm 5 công thức như sau: CT1: MTN + 0 mg/l IBA (ĐC)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 CT2: MTN + 0,25 mg/l IBA
CT3: MTN + 0,5 mg/l IBA CT4: MTN + 0,75 mg/l IBA CT5: MTN + 1,0 mg/l IBA
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BA, Kinetin và α NAA đến khả năng phát sinh chồi từ vảy củđôi.
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là vảy củđôi có dính đế củ. Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ BA và Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất ở thí nghiệm 2 +30g/l saccaroza + 6.5g/l agar.
Thí nghiệm 4 gồm 5 công thức như sau: CT1: MTN + 0 mg/l α NAA (ĐC) CT2: MTN + 0,25 mg/ α NAA CT3: MTN + 0,5 mg/l α NAA CT4: MTN + 0,75 mg/l α NAA CT5: MTN + 1,0 mg/l α NAA
3.2.2.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất cytokinin và auxin đến hệ số nhân nhanh chồi từ củ nhỏ in vitro
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của BA, Kinetin và α-NAA đến hệ số nhân chồi từchồi in vitro
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là chồi in vitro
Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất
ở thí nghiệm 2 + Nồng độ α NAA phù hợp nhất trong thí nghiệm 4 + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar.
Thí nghiệm 5 gồm 6 công thức như sau: CT1: MTN + 0 mg/l BA (ĐC)
CT2: MTN + 1,0 mg/ BA CT3: MTN + 2,0 mg/l BA CT4: MTN + 3,0 mg/l BA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 CT5: MTN + 4,0 mg/l BA
CT6: MTN + 5,0 mg/l BA
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của BA, Kinetin và IBA đến hệ số nhân chồi từ chồi in vitro
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là củ nhỏ in vitro.
Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất
ở thí nghiệm 2 + Nồng độ IBA phù hợp nhất trong thí nghiệm 3 + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar.
Thí nghiệm 6 gồm 6 công thức như sau: CT1: MTN + 0 mg/l BA (ĐC) CT2: MTN + 1,0 mg/ BA CT3: MTN + 2,0 mg/l BA CT4: MTN + 3,0 mg/l BA CT5: MTN + 4,0 mg/l BA CT6: MTN + 5.0 mg/l BA
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro chồi in vitro
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là các chồi nhỏ in vitro có kích thước nhỏ, đồng đều
Môi trường nền (MTN): MS + 30g/l Saccaroza + 6,5g/l agar Thí nghiệm 7 gồm 5 công thức như sau:
CT1: MTN + 0 ml/l ND (ĐC) CT2: MTN + 20 ml/ ND CT3: MTN + 40 ml/l ND CT4: MTN + 60 ml/l ND CT5: MTN + 80 ml/l ND
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng củ in vitro
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là các củ nhỏ in vitro có kích thước nhỏ, đồng đều
Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ nước dừa tốt nhất ở thí nghiệm 7 + 6,5g/l agar
Thí nghiệm 8 gồm 5 công thức như sau: CT1: MTN + 0 g/l Saccaroza (ĐC) CT2: MTN + 20 g/l Saccaroza CT3: MTN + 40 g/l Saccaroza CT4: MTN + 60 g/l Saccaroza CT5: MTN + 80 g/l Saccaroza
3.2.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của α NAA đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là các chồi nhỏ in vitro với các tiêu chuẩn sau: cao 2,5 – 4,0 cm và có từ 2 lá trở nên.
Môi trường nền (MTN): MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar. Thí nghiệm 9 gồm 5 công thức như sau:
CT1: MTN + 0 mg/l α NAA (ĐC) CT2: MTN + 0,5 mg/ α NAA CT3: MTN + 1,0 mg/l α NAA CT4: MTN + 1,5 mg/l α NAA CT5: MTN + 2,0 mg/l α NAA
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là các chồi nhỏ in vitro với các tiêu chuẩn sau: Cao 2,5 – 4,0 cm và có từ 2 lá trở nên.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar.
Thí nghiệm 10 gồm 4 công thức như sau: CT1: MTN + 0 g/l than hoạt tính (ĐC) CT2: MTN + 0,3 g/l than hoạt tính CT3: MTN + 0,5 g/l than hoạt tính CT4: MTN + 0,7 g/l than hoạt tính
3.2.5. Giai đoạn vườm ươm
Cây cao 4 – 5 cm, mọc 2 – 3 lá và có 3 – 4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm.
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ lai sau in vitro ngoài vườn ươm
Thí nghiệm có 3 công thức như sau: CT1: Giá thể 100% Cát vàng
CT2: Giá thể 50% Cát vàng + 50% Trấu hun CT3: Giá thể 75% Cát vàng+ 25% Trấu hun
Sử dụng phân bón qua lá Growmore 20:20:20 phun định kỳ 7 ngày/ lần
Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại phân bón qua lá tới sinh trưởng của cây Lan huệ lai sau in vitro ngoài vườm ươm
Thí nghiệm gồm các công thức như sau: CT1: Phun nước qua lá (ĐC)
CT2: Đầu trâu 502
CT3: Growmore 20:20:20 + Đầu trâu 502 (1:1) CT4: Growmore 20:20:20
Các cây lựa chọn trồng có kích thước và khối lượng tương đương nhau và
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
3.2.6. Các chỉ tiêu theo dõi
Giai đoạn nuôi cấy khởi động: 4 – 6 tuần
1. Tỷ lệ tạo mẫu PSHT ( %) = Σ Số mẫu PSHT × 100 Σ Số mẫu nuôi cấy 2. Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) = Σ Số chồi tạo thành Σ Số mẫu nuôi cấy ban đầu
Giai đoạn nhân nhanh:6 – 8 tuần
* Nhân nhanh từ vảy củđôi
3. Hệ số nhân chồi
(chồi/mẫu) =
Σ Số chồi tạo thành
Σ Số mẫu nuôi cấy
4. Chiều cao TB của chồi (cm) = Σ Chiều cao các chồi theo dõi
Σ Số chồi ban đầu
5. Số lá TB của chồi (lá/chồi) = Σ Số lá các chồi theo dõi
Σ Số chồi ban đầu
* Nhân nhanh từ củ in vitro
6. Hệ số nhân chồi/Củ nhỏin vitro (chồi/mẫu) = Σ Số chồi tạo thành Σ Số củin vitro nuôi cấy 7. Chiều cao TB của chồi (cm) =
Σ Chiều cao các chồi theo dõi
Σ Số chồi ban đầu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
Giai đoạn ra rễ: 3 – 4 tuần
8. Tỷ lệ ra rễ (%) = Σ Số chồi ra rễ × 100
Σ Số chồi theo dõi
9. Số rễ trung bình/chồi (Rễ) = Σ Số rễ của các chồi theo dõi
Σ Số chồi theo dõi
10. Độ dài trung bình của rễ (cm) = Σ Chiều dài các rễ theo dõi
Σ Số rễ theo dõi
Giai đoạn đưa cây in vitro ra vườn ươm: 6 – 8 tuần
11. Tỷ lệ cây sống ( %) = Σ Số cây sống × 100
Σ Số cây đưa ra giá thể
12. Chiều cao trung bình của cây (cm) =
Σ Chiều cao các cây theo dõi
Σ Số cây theo dõi
13. Số lá trung bình
( lá/cây) =
Σ Số lá các cây theo dõi
Σ Số cây theo dõi
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm trong phòng được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB), mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại từ 5-10 bình (tùy từng thí nghiệm), mỗi bình cấy từ 3-4 mẫu.
Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB), mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại trồng 5 chậu, mỗi chậu trồng 3 cây.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
3.3.2. Phương pháp tiến hành
3.3.2.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy được khử trùng theo quy trình: Vật liệu nuôi cấy là củ (thân hành) được thu hái, được làm sạch bề mặt dưới vòi nước chảy mạnh. Sau đó, củđược rửa sạch bằng xà phòng trong 10 phút và rửa lại dưới vòi nước sạch trong 5 phút. Trong buồng cấy vô trùng, củ này được ngâm trong cồn 700 trong 30 giây, tráng lại bằng nước cất vô trùng 1 - 2 lần, mỗi lần trong 1 phút. Tiếp theo ngâm mẫu trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút, rửa lại 4 – 5 lần bằng nước cất vô trùng, mỗi lần 1 phút. Sau đó cắt mẫu ở kích thước mặc định và cấy vào môi trường vào mẫu cơ bản là MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar.
3.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu khởi động
Các mẫu sạch bệnh, xanh tốt sau giai đoạn khử trùng sẽ được chuyển sang môi trường có bổ sung BA và Kinetin để xác định ảnh hưởng của BA và Kinetin tới khả năng tái sinh, hệ số nhân và chất lượng chồi nuôi cấy từ vảy củđôi.
3.3.2.3. Phương pháp nhân nhanh
Vảy củ tái sinh sau giai đoạn khử trùng, chồi in vitro hình thành từ mô nuôi cấy khởi động được cấy vào môi trường nhân nhanh có bổ sung các chất
điều tiết sinh trưởng.
Củ nhỏ in vitro hình thành trong giai đoạn đầu tiên của quá trình nhân nhanh được tách, bổ làm 4 phần và cấy vào các môi trường nhân nhanh có bổ
sung các chất điều tiết sinh trưởng với các nồng độ khác nhau nhằm tăng hệ
số nhân của mẫu nuôi cấy.
3.3.2.4. Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh
Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4 – 5 cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường nền thích hợp có bổ sung các chất thuộc nhóm auxin và than hoạt tính.
3.3.2.5. Phương pháp ươm cây
Các cây Lan huệ hoàn chỉnh trong bình được rửa sạch agar rồi trồng trên các giá thể khác nhau, tưới đẫm ngay sau khi trồng. Sau đó tưới định kỳ 1 lần/tuần
Khi cây hồi xanh, phun phân bón qua lá 1 lần/tuần.
3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và IRISTART 5.0 trên máy vi tính.
Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (độ tin cậy là 95%).
Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30