chồi in vitro
Thành phần môi trường ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trong đó, chất hữu cơ bổ sung như nước dừa hay hàm lượng
đường là yếu tố quan trọng. Những hợp chất tự nhiên, acid amin, phytohormone có trong nước dừa rất cần thiết đối với cây in vitro khi sống dị
dưỡng hay khả năng tích trữ dinh dưỡng trong củ đối với Lan huệ. Vì vậy, chồi in vitro được đưa vào môi trường MS bổ sung đường hoặc nước dừa với các dải nồng độ khác nhau.
Thí nghiệm 7. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro
Nước dừa là một hợp chất tự nhiên được dùng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Thành phần nước dừa có chứa nhiều các amino acid tự do, amino acid dạng liên kết có trong protein và peptid, acid hữu cơ, saccaroza, ARN, ADN. Ngoài ra, nước dừa còn chứa các hợp chất quan trọng với các tế
bào nuôi cấy phân lập như: myoinositol, các hợp chất có hoạt tính auxin và cytokinin dạng glycoside. Nhiều nghiên cứu cho thấy khi bổ sung hàm lượng nước dừa nhất định vào môi trường nuôi cấy sẽ có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của chồi. Khi tiến hành các thí nghiệm nhân nhanh này, chúng tôi nhận thấy hệ số nhân chồi đã được cải thiện đáng kể nhưng chất lượng chồi chưa thật đẹp, khỏe. Do đó, nhằm nâng cao hơn nữa hệ số nhân chồi, đặc biệt là chất lượng củ in vitro to, khỏe và để tăng khả năng sinh trưởng và phát triển chồi trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi, củin vitro. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường nền MS + 30g/l Saccaroza + 6,5g/l agar, pH = 5.7. Kết quả thí nghiệm sau 4 tuần nghiên cứu được thể hiện qua bảng sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồiin vitro sau 4 tuần nuôi cấy
ND
(ml/l)
Chiều cao cây (cm) Số lá (Lá/cây) Đường kính củ (mm)
H1 H3 H5 H12 H37 H85 H1 H3 H5 H12 H37 H85 H1 H3 H5 H12 H37 H85 0 1,32 1,83 1,50 1,64 1,28 1,34 1,41 1,79 2,36 1,82 1,56 1,34 2,64 2,85 4,69 3,00 2,88 2,78 20 1,96 2,44 2,19 2,44 2,28 2,06 1,62 1,70 3,42 2,10 2,03 1,98 3,00 3,72 5,52 3,22 3,26 3,87 40 2,88 3,88 2,70 3,00 3,44 2,84 1,94 2,00 3,60 2,46 2,56 2,12 3,26 3,50 5,55 4,44 5,68 4,21 60 4,12 5,38 4,40 4,22 4,22 3,98 2,24 2,10 2,57 3,44 3,66 4,00 5,12 5,21 7,80 5,68 6,66 5,44 80 3,56 4,47 3,38 3,26 3,22 3,66 2,04 1,95 2,46 3,84 3,04 3,62 3,86 4,64 5,80 5,02 6,00 5,34 LSD 5% 0,16 0,18 0,17 0,11 0,16 0,13 0,74 0,12 0,16 0,11 0,16 0,13 0,19 0,20 0,42 0,21 0,29 0,29 CV (%) 3,2 2,8 3,4 2,0 3,0 2,5 2,2 3,6 3,1 2,0 3,4 2,6 2,9 2,7 3,9 2,7 3,2 3,6
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồiin vitro sau 4 tuần nuôi cấy
Saccaroza
(g/l)
Chiều cao cây (cm) Số lá (Lá/cây) Đường kính củ (mm)
H1 H3 H5 H12 H37 H85 H1 H3 H5 H12 H37 H85 H1 H3 H5 H12 H37 H85 0 1,62 1,8 1,18 1,71 1,88 1,42 1,12 1,55 1,20 1,34 1,21 1,40 3,06 3,08 4,14 3,07 3,00 3,08 20 2,31 3,60 1,51 2,06 2,43 2,00 1,86 2,12 1,67 1,82 1,62 1,72 3,12 3,07 5,19 4,21 3,21 3,24 40 3,62 3,42 1,71 2,88 3,26 2,66 1,92 2,40 2,00 2,09 1,90 1,94 3,84 4,66 5,70 5,00 4,33 3,80 60 4,38 4,05 2,20 4,00 3,98 3,24 2,26 1,76 2,28 2,66 2,44 2,08 5,66 5,92 6,07 5,46 7,64 4,32 80 5,12 5,49 3,81 3,33 3,32 4,20 2,59 2,40 2,62 2,42 2,08 2,66 5,20 5,28 8,18 5,95 5,21 5,96 LSD 5% 0,16 0,19 0,12 0,21 0,20 0,13 0,10 0,11 0,09 0,13 0,14 0,13 0,23 0,21 0,41 0,21 0,27 0,22 CV (%) 2,6 2,9 3,3 4,1 3,7 2,6 3,0 2,9 2,5 3,3 4,2 3,5 3,1 2,7 4,1 2,4 3,5 3,1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 Bảng 4.7 cho thấy, khi tăng dần hàm lượng nước dừa từ 0 – 80 ml/l nước dừa thì chiều cao và đường kính củ tăng và đạt chất lượng củ tốt nhất ở
hàm lượng 60ml/l nước dừa. Đặc biệt, đối với hầu hết các dòng lai, đường kính củ cũng như chất lượng chồi đều tăng lên và đạt cao nhất ở công thức 4 (60ml/l nước dừa). Cụ thể
Đối với dòng H3: Chiều cao cây tăng từ 1,83 – 5,38 cm, đường kính củ
tăng từ 2,85 – 5,21 mm với số lá dao động từ 1,70 – 2,10 lá/cây. Chiều cao cây và đường kính củ đạt cao nhất khi sử dụng môi trường có hàm lượng nước dừa là 60 ml/l.
Cũng với hàm lượng nước dừa là 60 ml/l thì các dòng còn lại đều đạt chiều cao cây và đường kính cao nhất.
Kết luận: Công thức 4 (hàm lượng nước dừa là 60ml/l) là công thức có hiệu quả nhất trong việc nâng cao chất lượng chồi và củ nhỏin vitro.
Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro
Nồng độ đường saccaroza với các nồng độ khác nhau được đánh giá là có ảnh hưởng rõ rệt tới chất lượng củ, đường kính củ và phản ứng tạo củ của nhóm cây thân hành. Các chồi hoa Lan huệ sau khi đã tạo ra sẽđược tách và cấy vào môi trường MTN: MS + 6,5g agar/l + 60ml/l ND + Saccaroza với các nồng độ khác nhau. Kết quả thí nghiệm được trình bày qua bảng 4.8.
Kết quả từ bảng 4.8 cho thấy nồng độ đường có ảnh hưởng rõ rệt tới chất lượng củ cũng như chồi in vitro cây hoa Lan huệ. Nồng độ đường cho
đường kính củ lớn nhất và chất lượng chồi đẹp nhất ở hầu hết các dòng lai là bổ sung từ 60-80g/l.
Nhân nhanh in vitro dòng hoa Lan huệ lai bị ảnh hưởng rõ rệt bởi hàm lượng đường. Trong thí nghiệm này khi ta tăng hàm lượng đường từ 0-80g/l thì chiều cao chồi, số lá cũng nhưđường kính củ của các dòng lai đều tăng lên
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46
Kết luận: Dòng lai H1, H3, H37: Bổ sung 60g/l saccaroza là tốt nhất cho củ
nhỏ in vitro đạt kích thước củ lần lượt là 5,66cm; 5,92; 7,64cm.
Dòng lai H5, H12, H85: Bổ sung 80g/l saccaroza là tốt nhất cho củ nhỏ in vitro đạt kích thước củ lần lượt là 8,18cm; 5,95 cm; 5,96cm
Dòng lai H3 Dòng lai H5 Dòng lai H1 Dòng lai H12 Dòng lai H37 Dòng lai H85
Hình 4.4. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa và hàm lượng đường tới chất lượng củin vitro sau 4 tuần nuôi cấy
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47
4.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Bộ rễ là cơ quan quan trọng nhất đối với cây trồng. Trong nuôi cấy mô, một cây in vitro sau khi kết thúc giai đoạn sống dị dưỡng chuyển sang giai
đoạn sống tự dưỡng trong tự nhiên cần phải có bộ rễ khỏe, hoàn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này.
Chính vì vậy giai đoạn kích thích sự ra rễ của các chồi là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu. Khi kết thúc giai đoạn nhân nhanh chúng tôi
đã tạo ra được số lượng chồi đồng nhất và khỏe mạnh. Các chồi này được đưa vào giai đoạn kích thích ra rễ. Trong môi trường này bộ rễ phát triển hoàn hảo hơn, đảm bảo tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng cao khi đưa ra ngoài vườn
ươm.
Khi các chồi đạt tiêu chuẩn cho ra rễ, có chiều cao 3 - 5 cm, chồi mập khỏe, lá to, xanh thì được chuyển sang các môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh.
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ
Các thí nghiệm được tiến hành trên môi trường nền (MTN): MS + 30g/l saccaroza + 60ml/l ND + 6,5g/l agar.
Axit α-naphtylaxetic(α-NAA) được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh ngọn chồi và từđó được vận chuyển xuống dưới (hướng gốc), là một auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phân sinh, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt, và có tác dụng đặc biệt trong sự hình thành rễ. Nhưng nếu kích thích với hàm lượng quá cao, tác dụng quá mạnh sẽ xảy ra hiện tượng ức chế ngược trở lại, lúc này auxin sẽ trở thành chất ức chế.
Môi trường ra rễ thường được bổ sung các auxin để kích thích và nâng cao khả năng ra rễ cũng như chất lượng rễ. Trong đó, α-NAA là một auxin
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 điển hình được dùng nhiều và cho hiệu quả rất tốt ở nhiều đối tượng cây trồng. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu thí nghiệm có bổ sung nồng độα-NAA từ 0-2,0mg/l vào môi trường ra rễ nhằm khảo sát ảnh hưởng của α-NAA đến sự ra rễ của chồi hoa Lan huệ lai. Kết quả thí nghiệm được trình bày qua bảng 4.9 (sau 4 tuần)
Qua kết quả theo dõi, chúng tôi nhận thấy, ở công thức đối chứng tỉ lệ
mẫu ra rễ thấp hơn các công thức còn lại. Tỉ lệ mẫu ra rễ đạt cao nhất 100% và công thức ra rễ tốt nhất cho đa số các dòng lai là 2,0mg/l. Chỉ duy nhất đối với dòng lai H3, công thức ra rễ phù hợp là 1,5mg/l. Kết quả xử lý số liệu trung IRRISTART cho thấy số rễ/mẫu ở tất cả các dòng lai đều đạt trên 4,0 rễ/mẫu. Các rễđều to, mập và có màu trắng.
Như vậy, môi trường tốt nhất với thí nghiệm trên là:
Dòng lai H1, H5, H12, H37, H85: MS+ 2,0mg/l α-NAA cho khả năng ra rễ và chất lượng rễ tốt nhất.
Dòng lai H3: MS+1,5mg/l α-NAA cho khả năng ra rễ và chất lượng rễ
tốt nhất.
Thí nghiệm 10. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Lan huệ lai
Vai trò tích cực của than hoạt tính đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Theo đó, than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp… Và đặc biệt, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do làm cho môi trường sẫm màu, nên có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ
(Vũ Văn Vụ, 2006). Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng than hoạt tính với các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường MTN: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar để xác định vai trò của than hoạt tính đối với sự ra rễ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của α-NAAđến khả năng ra rễ các dòng Lan huệ lai in vitro
α-NAA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Số rễ/mẫu (rễ) Đặc điểm rễ H1 H3 H5 H12 H37 H85 H1 H3 H5 H12 H37 H85 H1 H3 H5 H12 H37 H85 0 23,6 13,1 21,3 19,7 22,8 13,4 1,21 1,42 1,63 1,32 1,38 1,34 + + + + + + 0,5 33,1 35,3 41,4 37,9 33,2 39,1 2,31 2,32 2,78 2,45 2,28 2,21 + ++ + ++ + + 1,0 86,7 96,4 93,2 87,4 76,9 83,8 2,45 3,39 3,19 2,87 2,66 2,26 ++ ++ + ++ + ++ 1,5 100 100 96,3 100 99,6 100 3,19 4,10 3,07 3,92 3,09 2,98 ++ +++ ++ + ++ ++ 2,0 100 100 100 100 100 100 4,57 3,84 4,57 4,09 4,01 4,26 +++ ++ +++ ++ ++ +++ LSD 5% 0,16 0,23 0,20 0,20 0,19 0,24 CV (%) 3,2 4,2 3,6 3,7 4,1 5,0
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ các dòng Lan huệ lai in vitro
C (g/l) H1 H3 Tỷ lệ mH5 ẫu tạo rH12 H37 H85 ễ (%) H1 H3 Số rH5 ễ/mẫu (rH12 H37 H85 ễ) H1 H3 ĐặH5 c điểm rH12 ễ H37 H85 0 23,6 13,1 21,3 19,7 22,8 13,4 1,21 1,42 0,91 1,32 1,38 1,34 + + + + + + 0,1 73,1 75,6 68,1 57,9 53,2 49,9 1,31 1,20 1,28 1,44 1,88 2,33 + ++ + ++ + + 0,3 84,7 83,6 83,6 86,7 86,6 83,8 1,56 1,13 1,22 2,87 1,66 2,42 ++ ++ + ++ + ++ 0,5 100 92,4 81,7 91,3 94,6 100 2,09 1,57 1,63 2,96 2,21 2,98 ++ ++ ++ +++ ++ +++ 0,7 88,3 84,9 87,8 77,4 88,1 100 2,57 1,69 1,79 2,65 2,73 2,56 +++ +++ +++ ++ +++ ++ LSD 5% 0,11 0,11 0,07 0,16 0,20 0,18 CV (%) 3,4 4,2 2,8 4,0 5,6 4,2
Ghi chú: +++: Tốt (Rễđẹp, mập, màu trắng) ++: Trung bình (Rễ màu trắng, mảnh)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 Từ kết quả ở Bảng 4.10 chúng tôi nhận thấy tỷ lệ ra rễ ở các dòng lai chưa cao so với công thức bổ sung α NAA, tuy nhiên, chất lượng bộ rễ tăng lên đáng kể khi sử dụng than hoạt tính. Số rễ/chồi và chất lượng rễ đều lớn hơn so với công thức đối chứng.
Khi tăng nồng độ than từ 0,1-0,7g/l thì số rễ trung bình/chồi tăng dần ở
hầu hết các dòng lai và đạt số rễ cao nhất là 2.96 rễ/mẫu ở nồng độ 0,5g/l đối với dòng H12. Với nồng độ 0,7g/l là công thức tốt nhất đối với sự ra rễở các dòng Lan huệ còn lại: H1, H37, H85 đạt số rễ/mẫu lần lượt là 2,57; 2,73; 2,56 rễ/mẫu.
Như vậy, việc bổ sung than hoạt tính đã có tác động tích cực lên số
lượng rễ và chất lượng rễ. Khi theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây chúng tôi nhận thấy cây từ các công thức có bổ sung than hoạt tính không những phát sinh rễ tốt và sự sinh trưởng và phát triển của cây đều tốt hơn rất nhiều so với công thức đối chứng (Bảng 4.10).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51
Dòng lai H3
Dòng lai H5
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52
Dòng lai H37
Dòng lai H85
Dòng lai H1
Hình 4.5. Ảnh hưởng α-NAA của đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ của sáu dòng lai hoa Lan huệ (Sau 4 tuần)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53
4.5. Giai đoạn vườm ươm
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ lai ngoài vườn ươm
Đây là giai đoạn cuối của quá trình nhân giống in vitro. Giai đoạn này có tính chất quyết định đến khả năng ứng dụng của kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro trong nhân giống cây trồng.
Trong nuôi cấy in vitro, cây con sinh trưởng dưới điều kiện rất đặc biệt: Môi trường có ánh sáng thấp, độ ẩm cao và dinh dưỡng được kiểm soát. Trong khi điều kiện tự nhiên có ánh sáng cao, độẩm cao và dinh dưỡng khó kiểm soát. Do đó, khi chuyển cây con sang giai đoạn nuôi trồng trực tiếp ở
nhà lưới hoặc trong điều kiện tự nhiên thường có tỷ lệ chết cao.
Cây in vitro khi chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng phải chịu nhiều yếu tố tác động của ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm không khí, sâu bệnh...sẽ ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và phát triển của cây. Do đó xác định điều kiện tối ưu để ra cây cấy mô là điều vô cùng quan trọng và cần thiết. Trên cơ sởđó chúng tôi tiến hành ra cây với một số loại giá thể khác nhau.
Giá thể không chỉ là nơi để cây trồng bám rễđứng vững mà còn là nơi cung cấp nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho cây. Giá thể chính là nơi tiếp xúc đầu tiên để cây trồng làm quen với môi trường tự nhiên. Điều này rất quan trọng với cây nuôi cấy mô vì chúng thường có bộ rễ yếu.
Giá thể là cách gọi chung cho tất cả các hỗn hợp của các vật liệu có thể