Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau

Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ .yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyy ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC yyyyyyyyyyyyyyyyy NGUYỄN VĂN TƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN NAC LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƢƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 04 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin cảm ơn các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành một số thí nghiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó! Thái Nguyên, ngày 1 tháng 03 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Minh Phƣơng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. CÂY LÚA 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây lúa 4 1.1.3. Giá trị kinh tế của cây lúa 5 1.1.4. Đặc điểm hóa sinh hạt gạo 6 1.1.5. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam 6 1.2. HẠN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY LÚA 9 1.2.1. Hạn và ảnh hƣởng của hạn tới cây trồng 9 1.2.2. Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn của cây lúa1.2.3. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và di truyền của tính chịu hạn của cây lúa 11 1.2.4. Cystatin và vai trò của cystatin với tính chịu hạn 18 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. VẬT LIỆU 24 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.2.1. Hóa chất 25 2.2.2. Thiết bị 26 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1. Phƣơng pháp sinh lí, hóa sinh 26 2.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 33 2.3.3. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 39 2.3.4. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen 39 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii 2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 39 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA 9 MẪU LÚA NGHIÊN CỨU 41 3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng hạt 41 3.1.2. Hàm lƣợng protein và lipid 42 3.1.3. Hoạt tính α – amylase 43 3.1.4. Hoạt tính protease 44 3.1.5. Chiều dài rễ của 9 giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn cây non 44 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA 9 GIỐNG LÚA Ở GIAI ĐOẠN CÂY MẠ 46 3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 48 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 48 3.3.2. Kết quả nhân gen Cystatin 49 3.3.3. Kết quả xác định trình tự gen Cystatin 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 1. Kết luận 54 2. Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid (Axit abxisic) ASTT u Bp ) CTAB Cetyltrimethyl – amonium bromide CUC Cup Shaped Cotyledon CYS Cystatin DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid) đtg Đồng tác giả JA Jasmonic acid HSP Heat shock pro ) LTP ) MX mồi xuôi MN mồi ngƣợc LEA ) NAM No Apical Merstem PCR ) P5CS Pyroline – 5 – carboylate synthase TAE Tris Acetate EDTA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới từ năm 2000 – 2012 7 Bảng 1.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam từ năm 2000 – 2012 9 Bảng 2.1. Đặc điểm của 09 giống lúa nghiên cứu 24 Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng 26 Bảng 2.3. Cặp mồi nhân gen cystatin 35 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen cystatin 35 Bảng 2.5 . Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 36 Bảng 3.1. Hình thái và khối lƣợng hạt của 9 giống lúa 41 Bảng 3.2. Hàm lƣợng protein và lipid của 9 giống lúa 42 Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme α – amylase của 9 giống lúa 43 Bảng 3.4. Hoạt tính protease của 9 giống lúa 44 Bảng 3.5. Chiều dài rễ của 9 giống lúa 45 Bảng 3.6. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của 9 giống lúa 46 Bảng 3.7. Phổ hấp phụ DNA ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm của 2 giống lúa nghiên cứu 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh hạt của 9 giống lúa nghiên cứu……………………….25 Hình 2.2. Vector pBT 37 Hình 3.1. Đồ thị rada biểu diễn khả năng chịu hạn của 9 giống lúa nghiên cứu 47 Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống lúa nghiên cứu 48 Hình 3.3. Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen Cystatin ở 2 mẫu luá LH và Sym6 50 Hình 3.4. Kết quả điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen cystatin 50 Hình 3.5. Trình tự nucleotide của gen cystatin ở hai giống LH và Sym6 521 Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu và AF435976……………………………… ….….53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa gạo (Ozyza sativa L.) là cây lƣơng thực chiếm 10% diện tích trồng trọt và là cây lƣơng thực chính nuôi sống hơn nửa dân số thế giới. Hiện nay, lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ hai sau lúa mì về diện tích và sản lƣợng. Lúa gạo là nguồn cung cấp năng lƣợng lớn nhất cho con ngƣời. Trên thế giới, cây lúa đƣợc khoảng 250 triệu nông dân trồng ở hơn 100 nƣớc trên thế giới. Ở Việt Nam, lúa là cây lƣơng thực quan trọng đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác Trong những thập kỉ qua, loài ngƣời đang đứng trƣớc nguy cơ bùng nổ về dân số và theo FAO để đảm bảo mức tiêu dùng ổn định, mức tăng sản lƣợng hàng năm cần gấp 2 lần so với mức tăng dân số. Trƣớc tình hình đó cây lúa đã và đang là đối tƣợng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học. Trong những năm gần đây, quá trình biến đổi khí hậu trên trái đất diễn ra khá phức tạp, khó lƣờng theo chiều hƣớng xấu của môi trƣờng nhƣ: Hạn hán, lũ lụt, xói mòn, thoái hoá đất,…Ở Việt Nam, trong những năm qua, do còn có hạn chế về điều kiện tƣới tiêu, tập quán canh tác và đặc biệt là việc chọn giống chịu hạn đƣa vào sản xuất chƣa đƣợc chú trọng, thêm vào đó là diễn biến thời tiết phức tạp, hạn hán thƣờng xuyên xảy ra đã gây ảnh hƣởng không nhỏ đến năng suất và chất lƣợng của nhiều loại cây trồng trong đó có cây lúa. Cây lúa là loài cây tƣơng đối mẫn cảm với những điều kiện bất lợi của ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Vì vậy, việc tạo ra các giống lúa có năng suất cao, khả năng chống chịu tốt là yêu cầu thực tiễn đề ra cho các nhà khoa học. Trên thế giới hiện nay, chọn tạo cây trồng theo hƣớng chống chịu đang là vấn đề đƣợc đặt trọng tâm nghiên cứu, trong đó chọn tạo giống lúa theo hƣớng chống khô hạn nhận đƣợc sự quan tâm của rất nhiều các nhà khoa học. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 Nghiên cứu về gen liên quan đến tính chịu hạn cho thấy tính chống chịu khô hạn là tính trạng đa gen. Các trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn ở cây lúa đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen Quốc tế, trong đó có gen cystatin. Cystatin là chất ức chế có bản chất protein, gen này thƣờng đƣợc biểu hiện trong các điều kiện hạn, lạnh, mặn và ở các pha riêng rẽ của quá trình sinh trƣởng, phát triển của thực vật. Mặc dù các nghiên cứu về gen liên quan đến tính chịu hạn ngày càng đƣợc quan tâm nhƣng thông tin về các gen này chƣa nhiều. Vấn đề đặt ra là cần tìm hiểu đặc điểm sinh lý, hoá sinh và sinh học phân tử liên quan đến tính chịu hạn của cây lúa. Trên cơ sở đó định hƣớng cho công tác chọn giống và cải tạo giống phù hợp có khả năng chịu hạn tốt. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo giống lúa theo hƣớng nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau” 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc mức độ chịu hạn của một số giống lúa ở giai đoạn cây non. - Xác định đƣợc mối liên quan giữa hoạt tính của α – amylase, protease, chiều dài rễ với khả năng chịu hạn của một số giống lúa. - Phân lập và xác định đƣợc trình tự gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả năng chịu hạn bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo ở giai đoạn 3, 5, 7, 9 ngày gây hạn. - Xác định hoạt tính của α – amylase, protease trong hạt của 09 giống lúa nghiên cứu. - Xác định chiều dài rễ 5 ngày tuổi ở giai đoạn cây non. - Khuyếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen cystatin ở 1 giống lúa có khả năng chịu hạn tốt và 1 giống lúa chịu hạn kém. [...]... nghiên cứu và phân lập ở: táo [20], lúa [42], đậu tƣơng [29] Nghiên cứu và phân lập gen cystatin giữa các giống lúa có khả năng chống chịu khác nhau nhằm xác định chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa có khả năng chịu hạn tốt và tạo cơ sở cho việc nghiên cứu làm giảm sự tích lũy cystatin giúp thay đổi khả năng chống chịu của cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/... tính chịu hạn của cây lúa Cây lúa sống trong ruộng nƣớc, là cây cần và ƣa nƣớc điển hình nên từ lúa nƣớc” bao giờ cũng gắn liền với cây lúa Ở nƣớc ta đại bộ phận ruộng lúa đều tƣới ngập nƣớc, tuy nhiên cũng có những giống lúa có khả năng chịu hạn (lúa cạn, lúa nƣơng ) sinh trƣởng hoàn toàn phụ thuộc vào nƣớc trời, nhƣng năng suất không cao bằng lúa nƣớc Lại có những giống lúa chịu đƣợc nƣớc sâu, ở vùng... đƣợc nghiên cứu khá nhiều trên thế giới Trong số đó phải kể đến một số nghiên cứu sau: Martinez và đtg (2005) khi phân tích sự phát sinh chủng loại của họ gen cystatin chịu hạn từ Arabidopsis, lúa và lúa mì đã khẳng định sự có mặt của 12 gen cystatin riêng biệt trong lúa, 7 gen trong Arabidopsis và ít nhất 7 gen trong lúa mì [31] Ohtsubo (2005) khi tiến hành nghiên cứu Ozyzacystatin, một loại cystatin. .. thấy có 64 unique ESTs thể hiện ở mức độ cao giống lúa cạn và 79 ở giống lúa lúa nƣớc Điều đó có thể dự đoán sự thể hiện cao của các gen mục tiêu trong lúa cạn, vì vậy có thể cải tiến đƣợc khả năng chống chịu stress do khô hạn trong lúa nƣớc [48] Yin và đtg (2008) đã sử dụng 4 dạng môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo lúa với nồng độ cytokinin và auxin khác nhau để phân giải protein có liên quan đến stress hạn. .. thuộc nhóm cây đậu đỗ, gen cystatin ở cây đậu tƣơng có kích thƣớc 5863bp trên đó có 4 exon và 3 intron đƣợc Misaka phân lập năm 2000 [38] Ở cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy cũng đã phân lập đƣợc đoạn gen cystatin có chiều dài 461bp với 2 exon và 1 intron; Protein do gen mã hóa có 98 amino acid [14] Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen cystatin của ngô, các gen ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4,... kiện hạn hán [14] Ở các loài thực vật tổng hợp mạnh prolin thì cây có tính chống chịu tốt hơn so với các loài thực vật khác trong điều kiện hạn, mặn,…Ví dụ cây lúa đƣợc chuyển gen P5CS chống chịu stress tốt hơn hẳn giống đối chứng Gần đây gen P5CS đã đƣợc phân lập thàmh công ở cây lúa Kết quả phân lập cho thấy gen P5CS làm cho tính chống chịu của cây lúa đƣợc cải thiện rõ rệt 1.2.3 Tình hình nghiên cứu. .. cho chọn lọc [9] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 18 Đỗ Thị Dƣơng (2001) nghiên cứu đặc điểm hoá sinh của 5 giống lúa cạn cho thấy, khả năng chịu hạn có liên quan đến hàm lƣợng đƣờng tan và protein [4] Nguyễn Thị Tâm (2003) nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật trên các giống CR303, CS4, M1107, 79 – 1, CN2, DH60 Ở nhiệt độ 420C... ra đƣợc 197 dòng mô có khả năng chịu nóng và 520 dòng cây xanh [7] Bùi Thị Thu Thuỷ (2006) cũng bằng phƣơng pháp thổi khô mô sẹo đã sàng lọc đƣợc 174 dòng mô có khả năng chịu hạn và 397 dòng cây xanh tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật [13] Ngô Mạnh Dũng (2008) phân tích quan hệ di truyền của 7 giống lúa cạn có khả năng chống chịu là KS, LC93.4, C207,... CC6, CC7, CC8, CC9, và CC10 [26] Trong 10 gen cystatin ở ngô, có 9 gen đƣợc phân lập từ mRNA, chỉ có gen CC1 phân lập từ DNA Trong điều kiện bất lợi (nóng, hạn, lạnh…) sự biểu hiện của gen cystatin tăng cao hơn trong nhiều loại cây trồng, vì thế có thể sử dụng cystatin để nâng cao khả năng chống chịu của thực vật với môi trƣờng bất lợi [42] 1.2.4.4 Chức năng của cystatin Dự đoán kết quả về phản ứng của... 1.2.2.3 Cơ sở di truyền của tính chịu hạn của cây lúa Tính chịu hạn ở cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng do nhiều gen quy định, các gen liên quan đến tính chịu hạn đã đƣợc phân lập nhƣ: HSP, LEA, LTP, P5CS, cystatin  HSP (Heat Shock Protein) – Protein sốc nhiệt HSP có ở hầu hết các loài thực vật và chiếm khoảng 1% protein tổng số của lá HSP xuất hiện trong cả các quá trình sinh trƣởng bình thƣờng . hƣớng nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định. tự gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả năng chịu hạn bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo ở giai đoạn 3, 5, 7, 9 ngày gây hạn. . NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số