Để xác định trình tự gen cystatin, chúng tôi tiến hành tách dòng gen. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromid 1 % và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím (hình 3.4).
1 2
Hình 3.4.Kết quả điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen cystatin
Ghi chú: 1: LH; 2: Sym6 660bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide.
Sau khi xác định trình tự gen cystatin bằng máy xác định trình tự tự động tại viện Công nghệ sinh học, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: gen cystatin của mẫu LH 664 nucleotide còn của mẫu Sym6 dài 645 nucleotide. Nhƣ vậy, gen cystatin ở mẫu Sym6 ngắn hơn của mẫu LH là 19 nucleotide. Tuy nhiên, 19 nucleotide thiếu hụt đó nằm trong vùng intron nên không ảnh hƣởng gì đến đoạn mã hóa amino acid (hình 3.6).
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50
LH ATGTCGAGCG ACGGAGGGCC GGTGCTTGGC GGCGTCGAGC CGGTGGGGAA
Sym6 ATGTCGAGCG ACGGAGGGCC GGTGCTTGGC GGCGTCGAGC CGGTGGGGAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
LH CGAGAACGAC CTCCACCTCG TCGACCTCGC CCGCTTCGCC GTCACCGAGC
Sym6 CGAGAACGAC CTCCACCTCG TCGACCTCGC CCGCTTCGCC GTCACCGAGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150
LH ACAACAAGAA GGCCGTAAGC GCCCCGCTCT ACCCTCCTCC CTACTTCTCC
Sym6 ACAACAAGAA GGCCGTAAGC GCCCCGCTCT ACCCTCCTCC CTACTTCTCC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200
LH TCTTCGCAAG GCCGGTCGTC CAACTAGATC TGTGTTCTAT GGACTAATTA
Sym6 TCTTCGCAAG GCCGGTCGTC CAACTAGATC TGTGTTCTAT GGACTAATTA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
LH TGCAACGCAT GACACACGGC TCTATTTAAT TTTTAAATTG ATCCAATTCA
Sym6 TGCAACGCAT GACACACGGC TCTATTTAAT TTTTAAATTG AT---
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
260 270 280 290 300
LH ATTTCATTTG TTCTCGCCAA GGAAGTAATT TTGATTCCTA GTCATGTAAA
Sym6 --- -TCTCGCCAA GGAAGTAATT TTGATTCCTA GTCATGTAAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310 320 330 340 350
LH CCTGCTCGAG TCGGTGAGAA AAAAAAAGAT GCGGTGTTGC GTATGTTTGT
Sym6 CCTGCTCGAG TCGGTGAGAA AAAAAAAGAT GCGGTGTTGC GTATGTTTGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
360 370 380 390 400
LH TAAAAGTGCA ATTAGGCAAT TTTTTGTGTT CAAAGATTGT GCTGTGTTCT
Sym6 TAAAAGTGCA ATTAGGCAAT TTTTTGTGTT CAAAGATTGT GCTGTGTTCT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
410 420 430 440 450
LH CTTTTATGAC AATATGGAAC AGGAGGTTCT GGACTGATTA GCATTTAATC
Sym6 CTTTTATGAC AATATGGAAC AGGAGGTTCT GGACTGATTA GCATTTAATC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
460 470 480 490 500
LH TTGATACTAC CATGCGCAGA ATTCTCTGCT GGAGTTCGAG AAGCTTGTGA
Sym6 TTGATACTAC CATGCGCAGA ATTCTCTGCT GGAGTTCGAG AAGCTTGTGA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
510 520 530 540 550
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sym6 GTGTGAAGCA GCAAGTTGTC GCTGGCACTT TGTACTATTT CACAATTGAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
560 570 580 590 600
LH GTGAAGGAAG GGGATGCCAA GAAGCTCTAT GAAGCTAAGG TCTGGGAGAA
Sym6 GTGAAGGAAG GGGATGCCAA GAAGCTCTAT GAAGCTAAGG TCTGGGAGAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
610 620 630 640 650
LH ACCATGGATG GACTTCAAGG AGCTCCAGGA GTTCAAGCCT GTCGATGCCA
Sym6 ACCATGGATG GACTTCAAGG AGCTCCAGGA GTTCAAGCCT GTCGATGCCA
....|....| .... 660
LH GTGCAAATGC CTAA
Sym6 GTGCAAATGC CTAA
Hình 3.5.Trình tự nucleotide của gen cystatin ở hai mẫu LH và Sym6
Vì trình tự gen cystatin mà chúng tôi phân lập là từ DNA tổng số nên có intron còn trình tự gen cystatin công bố trên Ngân hàng gen NCBI phân lập từ mRNA nên không có intron.
So sánh trình tự gen cystatin mà chúng tôi thu đƣợc với trình tự gen trên Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen mà chúng tôi phân lập có 1 intron và 2 exon: exon 1 dài 114 nucleotide (từ vị trí 1 đến 114 trên hình 3.8), exon 2 dài 195 nucleotide (từ vị trí 470 đến 664 trên hình 3.5), 1 intron (từ vị trí 115 đến 469 trên hình 3.5) trong đó: intron ở mẫu Sym6 dài 336 nucleotide còn của mẫu LH dài 355 nucleotide. Đoạn mã hóa dài 309 nucleotide mã hóa cho 102 amino acid (trừ amino acid kết thúc).
So sánh trình tự đoạn mã hóa của gen cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu không thấy có sự khác biệt và giống 100% với đoạn mã hóa của trình tự đã công bố trên NCBI với mã số AF435976. Do đó, trình tự amnino acid suy diễn của protein cystatin ở 2 giống lúa nghiên cứu tƣơng đồng 100% với trình tự amino acid của mẫu AF435976 (hình 3.6).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu và AF435976
Nhƣ vậy, sự khác nhau về trình tự gen cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu chỉ xảy ra trong vùng intron (từ vị trí 243 đến 261 trên hình 3.5). Giống LH nhiều hơn giống Sym6 là 19 nucleotide. Các nucleotide này có ảnh hƣởng đến sự biểu hiện gen hay không là vấn đề cần đƣợc làm sáng tỏ. Hiện nay có nhiều nhà khoa học trên thế giới cũng đang nghiên cứu về vai trò của intron nhƣng sự ảnh hƣởng của nó tới biểu hiện gen vẫn chƣa đƣợc chứng minh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Khối lƣợng 1000 hạt của 9 giống lúa nghiên cứu dao động trong khoảng (20,21) đến (30,80), Chiều dài rễ ở giai đoạn cây non dao động từ 4,98 – 7,12 cm.
1.2. Các giống lúa nghiên cứu có hàm lƣợng protein trong hạt dao động từ: (6,68%) đến (8,66%). Hàm lƣợng lipid dao động trong khoảng (1,19%) đến (2,30%). Giống lúa LH có hoạt tính - amylase mạnh nhất (0,81 đvhđ/mg) và giống lúa Sym6 có hoạt tính - amylase yếu nhất (0,59 đvhđ/mg). Giống lúa có hoạt tính protease cao nhất là mẫu LH (0,19 đvhđ/mg) và giống lúa có hoạt tính protease thấp nhất là mẫu Sym6 (0,12 đvhđ/mg).
1.3. Khả năng chịu hạn của 9 giống lúa nghiên cứu có sự khác nhau, giống lúa LH là mẫu có khả năng chịu hạn tốt nhất, giống lúa Sym6 là mẫu có khả năng chịu hạn kém nhất.
1.4. Đã khuyếch đại, tách dòng và xác định đƣợc gen cystatin của giống lúa LH và Sym6. Mẫu LH có chiều dài gen cystatin là 664 nucleotide còn của giống Sym6 dài 645 nucleotide. Trình tự đoạn mã hóa của gen cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu không thấy có sự khác biệt và giống 100% với đoạn mã hóa của trình tự đã công bố trên NCBI với mã số AF435976 nên protein cystatin của chúng đều dài 102 amino acid
2. Đề nghị
Tiếp tục xác định thêm trình tự gen cystatin của các giống lúa khác để có cơ sở so sánh, xác định chỉ thị phân tử và phục vụ cho việc chuyển gen để có thể tạo ra đƣợc những giống lúa có khả năng chịu hạn tốt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
2. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo Dục.
3. Ngô Mạnh Dũng (2008), Nghiên cứu đặc tính di truyền và đặc tính chịu hạn của một số giống lúa (Ozyra sativa L.),Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên, Tr. 19-32.
4. Đỗ Thị Dƣơng (2011), Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý và hoá sinh của 5 giống lúa cạn địa phương, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên, Tr. 35-39.
5. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng (2002), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục. 6. Nguyễn Văn Hoan (2006), Cẩm nang cây lúa, NXB Lao động Hà Nội. 7. Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein và tính chống chịu ở thực vật, NXB
Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
8. Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền và ứng dụng, NXB Quốc gia Hà Nội.
9. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
10.Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin trong sinh học, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr: 53 – 163.
11. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
12. Nguyễn Thị Tâm (2003), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sỹ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội, Tr. 20-30.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
13. Bùi Thị Thu Thuỷ (2006), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và tạo dòng vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên, Tr. 45-55.
14. Vũ Thị Thu Thủy (2011), Tạo dòng chịu hạn bằng công nghệ tế bào và phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.
15.Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn và phân lập gen Cystatin ở một số giống đậu xanh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái nguyên.
16. Vũ Văn Vụ , Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2007), Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
17. Abe K., Emori Y., Kondo H.,Susuki K., Aria S. (1987) “Molecular cloning of a cystein proteinase inhibitor of rice (Oryzacystatin) - Homology with animal cystatin and transient expression in the ripening process of rice seeds”, J Biol Chem, 262(35), pp: 16793-16797.
18. Abe M., Arai S. (1991), "Some propeties of a cystein proteinase inhibitor from corn endosperm", Agricultural and biological chemistry, 55(9), pp: 2417-2418.
19. Abrahanson M., Ritonja A., Brown M.A., Grabb A., Machleibt W., Barrett A.J. (1987), "Identification of the probable inhibitory reactive sites of the cysteine proteinase inhibitors, Human cystatin c and chicken cystatin", J. Biol, Chem, 262, pp: 9688-9494.
20. Barrett A.J. (1986), “The Cystatins: a diverse superfamily of cystein peptidase inhibitor”, Biomed Biochim Acta, 45, pp: 1363-1374.
21. Barrett A.J., Fritz H., Grubb A., Isemura S., Jarvinen M., Katunuma N., Machleidt W., Muller-Esterl W., Sasaki M., Turk V. (1986),
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
"Nomenclature and classification of the proteins homologous with the cystein–proteinase inhibitor chicken cystein", Biochem J, 1, pp: 236-312. 22. Bray Elizabeth A. (1993), “Molecular responses to water deficit”, Plant
Physiol 103, pp: 1035-1040.
23. Chou W.M., Shigaki J., Dammann C., Liu J.Q., Bhattachamy M.K. (2004), "Inhibition of pathogenesis-related genes in soybean plant biology", 6, pp: 664-672.
24. Diop N.N., Kidric., Repellin A., Gareil M., d'Acry-Lameta A., Pham Thi A.T., Zuil- Fodil Y. (2004), “A mulicystatin is induced by drough-stress in cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.) leaves”, FEBS Lett 577(3), pp: 50-545.
25. Gawel N. J., Jarret R. L. (1991) “A wodified CTAB DNA extraction procedure of Musa and Ipomoea”, Plant Mol Biol Rep, 9, pp. 262 – 266. 26. Grudkowska M., Zagdanska B. (2004), “Multifunctional role of plant
cysteine proteinases, Acta Biochim Polonica, 51(3), pp: 609 - 624. 27. Hatano K, Kojima M, Tanokura M, Takahashi K (1996), "Solution
structure of bromelain inhibitor IV from pineapple stem: structural similarity with Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor from soybean", Biochemistry, 35(17), pp: 5379-5384.
28. Kader J.C. (1996) “Lipid-transfer proteins in plant”, Annu Rev Plant Phys, 47.
29. Liu K.H., Lin T.Y. (2003), “Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate, DNA sequence”, J Seq Map, 14(6).
30. Machleidt W., Thiele U., Laber B., Arsfald, Machleidt I., Ester L., Wiegand G., Kos J., Turk V., Bode W. (1989), "Mechanism of inhibition of papain by chicken egg white cystatin: Inhibition constants of N-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
terminally truncated forms and cyano gen bromid fragments of the inhibitor.", Bio. Chem, 243(2), pp: 234-238.
31. Martinez M., Abraham Z., Carbonero P., Diaz I. (2005), “Comparative phylogenetic analysis of cytatin gen familíe from arabidopsis, rice and barley”, Mol genet gennomic, 273(5), pp. 423-432.
32. Misaka T., Kuroda M., Iwabuchi K., Abe K., Arai S. (1996), "Soyacystatin, A novel cystein proteinase inhibitor in soybean, is distinct in protein structure and gene organization from other cystatins of animal and plant origin", European Journal ofbiochemistry, 240, pp: 609.
33. Massonneau A., Condamine P., Wisniewski J. P., Zivy M., Rogowsky P. M. (2005), “Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought”, Biochim Biophys Acta, 1729 (3) pp: 99-186.
34. Ohtsubo S., Taiyọi M., Kawase T., Taniguchi M., Saitoh E. (2005), “Oryzacystatin-II, a cystatin from rice (Oryza sativa L. japonica), is a dimeric protein: posible involvement of the interconversion between dimer and monomer in the regulation of the reactivity of oryzacystatin-II”,
Agric food chem, 55(5), pp. 1762-1966.
35. Oliveira A.S., Filho J.X., Sales M.P. (2003) “Cysteine proteinases and cystatins”, Braz Arch Biol Techn, 46(1) pp: 91-104
36. Ojima A., Shiota H., Higashi K., Shimma Y., Wada M.,Satoh S. (1997), "An extracularin soluble inhibitor of cysteine proteinase in cell cultrures and seed carrot", Plant molecular biology, 34, pp: 99-109.
37. Rawlings N.D, Barrett A.J. (1994), "Families of cysteine peptidases",
Methods enzymol, 244, pp: 461-486.
38. Ryan S.N., Mc Manus M.J., Laiing W.A. (2003), "Indentification and characterisation of proteinase inhibitor and their gen from seeds of apple (Malus domestica)", Japanese Biochemical Society, 134(1), pp: 31-42.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
39. Ramanjulu S., Bartels D. (2002), “Drought- and desiccation- induced modulation of gene expression in plant”, Plant cell and environment, 25(2), pp.141-151.
40. Turk B., Turk V., Turk D. (1997), "Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinase and their protein inhibitor", Biol. Chem. Hopp seyler, 378, pp: 141-150.
41. Trysellius Y., Huttmark D. (1997), "Cysteine proteinase 1, a chatepsin L- like enzyme expressed in the Drosophila melanogaster haemocyte cell line mbn-2", Insect molecular Biol, 6(2), pp: 173-181.
42. Xiong L., Karen S.S., Zhu J.K (2001), "Cell signaling during cold, drought, and salt stress", The plant cell, pp: 165-183.
43. Valdes R. S., Guerrero R. A., Melgoza V. C., Chagolla L. A., Delgado V.F., Martinez G. N., Sanchez H. N., Delano F. J (2007), “Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus
hypochondriacus) showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress”, Plant Physiology and Biochemistry
44. Valueva J.A., Morsolov V.V (2009), “Sole of inhibitors of protecolytic enzyme in plant defense against phytipathogenic microorganisms”,
Bochemistry (Moscow), 69(11).pp.1305-1309.
45. Wangxia W ., Basia V., Oded S., Arie A. (2004), "Role of plant heat shock protein and molecular chaperon in the abiotic stress responds",
Plant science, 9(5), pp: 244-252.
46. Walsh J.A., Strick land J.A. (1993), "Proteolysis of the 85-kilodalton crystaltine cysteine proteinase inhibitor from potato release funtional cystatin domains", Plant physiol, 103(4), pp: 1227-1234.
47. Waldron C., Wegrich L.M., Merlo P.A.O, Walsh J.A. (1993), "Characterization of a genemic sequence coding for potato multicystatin,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
An eight-domain cystein proteinase inhibitor", Plant molecular biology,
23(4), pp: 801-812.
48. Wang H., Zhang H., Gao F., Li J., Li Z. (2007), “Comparision of gene expression between upland rice cultivars under water stress using cDNA microarray”, Tag, 115, pp.1109-1126.
49. YamamotoY., Takimoto K., Izumi S., Tonyamasakurai M., Kageyama T., Takahash S.Y. (1994), "Molecular cloning and sequencing of cDNA that encodes cysteine proteinase in the egg of silkmoth, bombysmory", T. Biochem, 116, pp: 1330-1335.
50.Yang W., Jifeng Y., Minika K., Maryse C., Angela S., Charlene M., Tina U., Carlene S., Jiangxin W., David T.D., Peter M., Yafan H. (2005), “Molecular tailoring of faresylation for plant drought tolerance and yield protection”, The plant journal, 43, pp.413-424.
51. Yin L., Lan Y., Zhu L. (2008), “Analysis of the protein expression profiling during rice callus differentiation under different plant hormone conditions”, Plant mol biol, 68(6), pp.597-617.
52. Zhang X., Liu S., Takano T. (2008), “Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance”, Plant Mol Biol, 68(1-2), pp: 43- 131.
MỘT SỐ TRANG WEB
53. www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X67711, Qun W., Rong-Xiang F., (2006),
Orsatyva HSP 70 gene for heat sock protein 70.
54. www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF04688, Chen P.W and Chen L.T.,
(1999), Oryza sativa group 3 LEA protein (lea) gene, complete cds.
55. www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U77295, Lee M.C., Park J.Y, Lee J.S. and
Eun M.Y., (1996), Oryza sativa lipid transfer protein (LPT) mRNA, complete cds.