1.2.4.1. Cystatin
Cystatin (CYS) là một dạng protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase. Trong cơ thể sống, cysteine proteinase thực hiện nhiều chức năng quan trọng nhƣ: Trƣởng thành protein, làm mới protein để phù hợp với những thay đổi bên ngoài và loại bỏ protein bất thƣờng, protein gấp cuộn [26]. Khi thực vật gặp hạn, cysteine proteinase hiện diện nhƣ những proteinase tham gia vào quá trình thủy phân protein dự trữ. Quá trình này có thể bị cản trở bởi những chất ức chế proteinase đƣợc gọi là cystatin [20].
Cystatin đƣợc phân bố ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật cho thấy đây là nhóm chất đóng vai trò quan trọng với sự tồn tại, sinh trƣởng và phát triển của sinh vật [52].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sự sai khác về kích thƣớc, khối lƣợng của phân tử protein, về số lƣợng và vị trí các liên kết disulphide…là căn cứ để phân loại cystatin thành 4 họ [26].
Cystatin họ 1, đƣợc biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc các nhóm carbohydrate, nó có trọng lƣợng phân tử khoảng 11kDa, gồm 100 gốc amino acid [47].
Cystatin họ 2, là protein có hai liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu carbon cuối cùng và đƣợc glycosyl hóa, có trọng lƣợng phân tử khoảng 13 - 24 kDa với 115 amino acid [19].
Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết tƣơng, nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết là các phức hợp phân tử cystatin có trọng lƣợng phân tử cao (60 - 120 kDa) với khoảng 355 gốc amino acid có chứa các liên kết disulfide. Các Kininogen giữ vai trò quan trọng trong quá trình đông tụ máu.
Ngƣời ta đã tìm thấy ở các cystatin họ I và II dạng pentapeptide Gln- Val-Val-Ala-Gly và trình tự tƣơng đồng Gln-X-Val-Y-Gly ở các cystatin họ II. Ngoài ra, trình tự Phe-Ala-Val đƣợc định vị gần đầu carboxyl và dipeptide Phe-Try gần đầu amino, là trình tự bảo thủ của cystatin họ II nhƣng không tìm thấy ở các cystatin họ I và III. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng vùng pentapeptide và dipeptide này đóng vai trò quan trọng trong việc bám với cysteine proteinase [47].
Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa cystatin phân lập từ động vật và thực vật, ngƣời ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [22], gồm hầu hết các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với hầu hết các cystatin họ I và II. Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt gạo là chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên đƣợc nghiên cứu. Nó có mối liên hệ về mặt cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng gà (Barett). Oryzacystatin cũng đƣợc xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng mặt của liên kết disulfide, chuỗi pentapeptide cũng đƣợc tạo thành bởi Gln-Val-Val-Ala-Gly ( gốc thứ 57 - 61) và khối lƣợng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với 102 gốc amino
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
acid. Trình tự amino acid của oryzacystatin giống 30% với cystatin họ II, nó có vùng trình tự Phe-Ala-Val (gốc thứ 29 - 31) và Phe - Try (gốc thứ 83 - 84), điều đó chứng tỏ oryzacysstatin cũng có thể xếp vào nhóm cystatin họ II.
Các chất ức chế cysteine proteinase có nguồn gốc từ thực vật đƣợc chia làm hai nhóm, nhóm 1 gồm chủ yếu là phytocystatin có chứa vùng đơn và nhóm thứ 2 có chứa vùng đa, nhƣ multicystatin đƣợc phân lập từ củ khoai tây và cystatin của lá cà chua. Cystatin phân lập từ củ khoai tây không chứa vùng bảo thủ Gln-X-Val-Y-Gly [19]. Tám chất ức chế bromelain dạng iso đƣợc phân lập từ thân dứa cũng thể hiện sự khác biệt so với các cystatin khác vì không chứa vùng bảo thủ Gln-X-Val-Y-Gly nhƣng lại có sự tƣơng đồng về mặt cấu trúc với chất ức chế trypsin/chymotrypsin từ hạt đậu tƣơng. Từ thực tế này ngƣời ta đã cho rằng, rất có thể các chất ức chế protease có chung nguồn gốc [27].
Nhiều mô hình tƣơng tác giữa cystatin và cysteine proteinase đã đƣợc mô tả. Nhìn chung có ba vùng tƣơng tác là: gốc Gly gần đầu amino, vùng bảo thủ trung tâm Gln-Val-Val-Ala-Gly và cấu trúc kẹp tóc bậc 2 gần đầu carboxyl. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, liên kết disulfide không tham gia vào tƣơng tác này [21]. Đối với Oryzacystatin, Abe và Arai đã tiến hành nghiên cứu về vùng hoạt động ức chế của nó với papain. Kết quả cho thấy, Oryzacystatin bậc một có khả năng ức chế papain, vùng Gln-Val-Val-Ala-Gly và vùng Pro - Trp là những đồng yếu tố trong tƣơng tác này [18].
Gen cystatin đã đƣợc nghiên cứu và phân lập ở: táo [20], lúa [42], đậu tƣơng [29].
Nghiên cứu và phân lập gen cystatin giữa các giống lúa có khả năng chống chịu khác nhau nhằm xác định chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa có khả năng chịu hạn tốt và tạo cơ sở cho việc nghiên cứu làm giảm sự tích lũy cystatin giúp thay đổi khả năng chống chịu của cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.2.4.2. Cysteine proteinase
Quá trình phân giải protein ở thực vật diễn ra phức tạp với sự tham gia của nhiều enzyme, bằng nhiều con đƣờng khác nhau trong các thành phần khác nhau của tế bào. Trong đó, sự phân giải protein với sự tham gia của enzyme cysteine protease chiếm tới 30% tổng hoạt động phân giải protein.
Cysteine proteinase là enzyme có vai trò thiết yếu trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật, sự già và chết theo chƣơng trình của tế bào, sự tích lũy protein dự trữ trong hạt, huy động protein dự trữ và khả năng chống chịu với những stress của môi trƣờng. Chúng tham gia vào sự hoàn thiện protein, tái tạo protein và loại bỏ protein biến tính nhằm giúp cây thích ứng với những tác động của môi trƣờng bên ngoài.
Cysteine proteinase hoạt động bằng cách loại bỏ đoạn amino tận trong chuỗi polypeptide để tạo ra các enzyme hoạt động. Vùng amino tận (hay còn gọi là proregion) không những giữ vai trò trong việc ức chế hoạt động của enzyme mà còn giúp protein mới đƣợc tổng hợp cuộn xoắn chính xác và bảo vệ enzyme chống lại tác động bất lợi của ngoại cảnh. Ở động vật có xƣơng sống, cysteine proteinase liên quan đến hệ thống phân giải protein của lysosome và giữ vai trò ngoại bào trong một vài quá trình trao đổi chất [33]. Ở động vật không xƣơng sống nhƣ giun tròn, cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa. Ở động vật chân đốt nhƣ tôm hùm, chúng không những giữ vai trò trong tiêu hóa mà còn liên quan đến hệ thần kinh [43]. Ở côn trùng, cystein proteinase tìm thấy trong cả cơ quan tiêu hoá và một số mô khác nữa, chứng tỏ chúng giữ nhiều vai trò khác nhau [46].
Ở thực vật, cysteine proteinase đƣợc tìm thấy chủ yếu trong không bào và có thể tham gia biến đổi protein dự trữ trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, điều đó cung cấp nguồn dinh dƣỡng nitơ hỗ trợ cho sự phát triển của cây non. Ngoài ra, ngƣời ta còn tìm thấy cysteine proteinase trong môi trƣờng ngoại bào của cây sung và cây đu đủ [24].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.2.4.3. Gen cystatin
Gen cystatin ở thực vật mã hóa protein cystatin ức chế hoạt động của cysteine protease. Trong những năm gần đây, cystatin đƣợc bàn luận nhiều bởi mối liên quan của nó tới tính chống chịu yếu tố bất lợi của ngoại cảnh nhƣ: nóng, lạnh, mặn, hạn…[26], đặc biệt là tính chống chịu hạn. Khi gen này hoạt động, sản phẩm tạo thành sẽ tham gia vào việc hạn chế sự phân giải các chất và do đó bảo vệ các từ nhiều phần khác nhau của cây. Gen cystatin đƣợc phân lập đầu tiên từ mRNA của cây lúa, ký hiệu là OC1 có đoạn mã hóa dài 309 nucleotide, mã hóa phân tử protein dài 102 amino acid [17]. Ở cây đậu xanh, gen cystatin đƣợc Kang và đtg phân lập, đọc trình tự từ mRNA và công bố tại ngân hàng gen Quốc tế có mã số D38130 với kích thƣớc 304 nucleotide, đoạn mã hóa gồm 267 nucleotide mã hóa 88 amino acid [49]. Cũng thuộc nhóm cây đậu đỗ, gen cystatin ở cây đậu tƣơng có kích thƣớc 5863bp trên đó có 4 exon và 3 intron đƣợc Misaka phân lập năm 2000 [38]. Ở cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy cũng đã phân lập đƣợc đoạn gen cystatin có chiều dài 461bp với 2 exon và 1 intron; Protein do gen mã hóa có 98 amino acid [14].
Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen cystatin của ngô, các gen ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, và
CC10 [26]. Trong 10 gen cystatin ở ngô, có 9 gen đƣợc phân lập từ mRNA, chỉ có gen CC1 phân lập từ DNA.
Trong điều kiện bất lợi (nóng, hạn, lạnh…) sự biểu hiện của gen cystatin tăng cao hơn trong nhiều loại cây trồng, vì thế có thể sử dụng cystatin để nâng cao khả năng chống chịu của thực vật với môi trƣờng bất lợi [42].
1.2.4.4. Chức năng của cystatin
Dự đoán kết quả về phản ứng của tế bào khi bị thiếu hụt nƣớc, Bray (1993) đã đề cập sản phẩm của các gen tham gia duy trì chức năng tế bào trong suốt giai đoạn mất nƣớc, đó là nhóm chất ức chế hoạt động của protease [22]. Khi gen này hoạt động, sản phẩm tạo thành sẽ tham gia vào bảo vệ các enzym, hạn chế sự phân giải các chất do đó bảo vệ các cấu trúc trong tế bào.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Diop và đtg (2004) đã phân lập trình tự gen VuCl từ mRNA (cDNA) mã hóa cystatin từ lá cây đậu cô ve (Vigna unguiculata (L.) Walp). Các protein VuCl tái tổ hợp (rVuCl) đƣợc biểu hiện từ cDNA là một chất ức chế hiệu quả hoạt động của papain. Sự biểu hiện của gen VuCl trong tế bào phản ứng với tác động của các yếu tố bất lợi phi sinh học (hạn hán, ABA ngoại sinh) đƣợc phân tích bởi phƣơng pháp Northern blot và Western blot. Kết quả cho thấy, trong các mô lá của cây đậu cô ve thuộc hai giống khác nhau về khả năng chịu hạn, các yếu tố bất lợi phi sinh học đã tạo ra sự tích tụ các polypeptide VuCl. Sự khác nhau về mật độ tích tụ cystatin tƣơng ứng với mức độ chịu đựng của cây đậu cô ve [24].
Việc nghiên cứu gen cystatin không những giải quyết mối liên quan của gen với tính chống chịu hạn mà còn liên quan đến khả năng chống vi sinh vật, chống côn trùng gây bệnh đối với cây trồng [21], [30].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU