Hiện nay, có nhiều quan điểm khác nhau giải thích cơ chế chịu hạn, trong đó có hai quan điểm đƣợc chấp nhận hơn cả là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Bộ rễ có hình thái khoẻ, dài, mập, có sức xuyên sâu cho cây hút đƣợc nƣớc ở những vùng sâu, vùng xa. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nƣớc của tế bào rễ cây đối với đất. Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tăng lên giúp cho tế bào rễ thu đƣợc các phân tử nƣớc hiếm hoi có trong đất nhờ vậy thực vật có thể vƣợt qua tình trạng hạn cục bộ[7].
Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nƣớc cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Nhờ khả năng hƣớng nƣớc, rễ lúa có thể tìm nguồn nƣớc và nguồn thức ăn một cách chủ động. Khi cây lúa gặp hạn, bộ rễ phát triển mạnh và ăn sâu để có thể tìm kiếm các nguồn nƣớc từ các lớp đất sâu. Vì vậy, sự phát triển và khả năng đâm xuyên của bộ rễ cũng là những chỉ tiêu để đánh giá và nhận dạng các giống ngô có khả năng chịu hạn. Cũng có thể nghiên cứu kích thƣớc rễ ở giai đoạn cây non để đánh giá khả năng chống chịu của cây lúa.
Kết quả nghiên cứu kích thƣớc rễ của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn cây non sau khi gây hạn đƣợc trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Chiều dài rễ của 9 giống lúa STT Tên mẫu Kích thƣớc rễ (cm) 1 ND 5,01 ± 0,17 2 LTB 5,49 ± 0,35 3 KD 5,56 1,12 4 LH 7,12 0,21 5 NL203 6,00 ± 0,25 6 U17 5,78 0,19 7 N97 5,82 0,02 8 Sym6 4,98 0,30 9 Q 5,61 0,14
Từ bảng 3.5 cho thấy, chiều dài rễ ở giai đoạn cây non của 9 giống lúa dao động từ 4,98 – 7,12 cm. Giống lúa có chiều dài rễ dài nhất là LH (7,12 cm), giống lúa có chiều dài rễ ngắn nhất là Sym6 (4,98 cm).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chiều dài rễ của các giống lúa nghiên cứu đƣợc xếp theo thứ tự giảm dần nhƣ sau:
LH>NL203>N97>U17>Q>KD>LTB>ND>Sym6
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA 9 MẪU LÚA Ở GIAI ĐOẠN CÂY MẠ
Khả năng chịu hạn của cây lúa đƣợc biểu hiện rõ ở từng thời điểm. Nhƣng có hai thời kỳ cây lúa mẫn cảm nhất với điều kiện hạn đó là thời kỳ cây non và thời kỳ ra hoa. Do đó, chúng tôi đã đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo theo tỉ lệ: tỉ lệ cây không héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7 ngày thí nghiệm. Từ đây tính đƣợc chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các mẫu lúa. Khi bị hạn, lƣợng nƣớc trong tế bào giảm gây tổn thƣơng cho cây. Các giống khác nhau sẽ có những đáp ứng khác nhau để làm giảm hoặc tránh bị tổn thƣơng. Tỷ lệ thiệt hại của mỗi giống lúa đƣợc xác định trên cơ sở theo dõi số cây héo, cây chết sau 3, 5, 7 ngày hạn, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.1.
Bảng 3.6. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của 9 giống lúa
Tên mẫu
3 ngày 5 ngày 7 ngày Chỉ số
chịu hạn %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH ND 92,50 100 55,00 6,67 25,00 15,40 4607 LTB 92,50 33,00 57,50 13,30 27,50 30,80 2037 KD 92,50 33,30 60,00 14,30 35,00 41,70 2322 LH 100 100 80,00 50,00 47,50 41,20 7742 NL203 100 100 77,50 44,40 45,00 41,20 7363 U17 97,50 100 72,50 30,00 40,00 37,50 6431 N97 100 100 77,50 33,3 42,50 38,90 6879 Sym6 87,50 20,00 52,50 6,67 22,50 7,70 1021 Q 95,00 50,00 67,50 25,00 35,00 31,30 3464
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.6 cho thấy, sau 3, 5, 7 ngày gây hạn, cả 9 giống nghiên cứu đều chịu ảnh hƣởng của hạn và tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra tăng theo thời gian gây hạn. Sau 3 ngày gây hạn, các giống lúa bắt đầu bị ảnh hƣởng nhƣng mức độ thấp, sau 5 ngày hạn, mức độ ảnh hƣởng đã tăng lên rõ rệt. Dựa trên số cây không héo và cây phục hồi ở trên chúng tôi tính chỉ số chịu hạn. Chỉ số chịu hạn giảm dần theo thứ tự sau:
LH>NL203>N97>U17>Q>KD>TB>ND>Sym6
Nhƣ vậy, mẫu LH có chỉ số chịu hạn cao nhất, mẫu có chỉ số chịu hạn thấp nhất là mẫu Sym6. 0 20 40 60 80 100 %CKH3 %CPH3 %CKH5 %CPH5 %CKH7 %CPH7 ND LTB KD LH NL203 U17 N97 Sym 6 Q
Hình 3.1. Đồ thị rada biểu diễn khả năng chịu hạn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chúng tôi nhận thấy có sự liên quan giữa khả năng chịu hạn với hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, hoạt tính - amylase, protease, chiều dài rễ. Những giống có khả năng chịu hạn tốt thì hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, hoạt tính - amylase, protease, chiều dài rễ cũng cao. Ngƣợc lại, những giống chịu hạn kém thì hoạt độ - amylase, protease, chiều dài rễ thấp hơn so với giống chịu hạn tốt. Từ kết quả ở trên, chúng tôi lựa chọn giống LH (chịu hạn tốt) và giống Sym6 (chịu hạn kém) để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm của gen Cystatin.
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Lấy lá non của 9 giống lúa sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Sau khi tách chiết và tinh sạch, hàm lƣợng và độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Đồng thời, DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X và chụp ảnh trên máy soi gel để đánh giá chất lƣợng DNA. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.2
Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống lúa nghiên cứu
Trong đó: M: marker lamda; 1: LH; 2: Sym6
Tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lƣợng của DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.7. Phổ hấp phụ DNA ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm của 2 giống lúa nghiên cứu
Tên giống A260 A280 A260/280 Hàm lƣợng DNA (ng/μl)
LH 0,122 0,065 1,88 1220
Sym6 0,155 0,078 1,99 1550
Từ bảng 3.7 cho thấy: tỷ số A269/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0 chứng tỏ 2 mẫu DNA tổng số tách chiết có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Kết quả nhân gen Cystatin
Sau khi tiến hành kiểm tra và đảm bảo độ tinh sạch của DNA tổng số thu đƣợc, chúng tôi đã tiến hành nhân gen cystatin của 2 giống lúa nghiên cứu, một giống lúa có khả năng chịu hạn tốt, một giống lúa có khả năng chịu hạn kém bằng phƣơng pháp PCR. Thành phần phản ứng PCR đƣợc thể hiện ở bảng 2.4. Nhiệt độ gắn mồi đƣợc chúng tôi tính toán dựa trên đặc điểm trình tự mồi đã thiết kế. Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 56oC. Sau 30 chu kì phản ứng, kết quả nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với marker 1kb và đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen cystatin ở 2 giống luá LH và Sym6
Ghi chú: M. marker 1kb; 1: LH; 2: Sym6
Qua hình 3.3 cho thấy, đã khuếch đại đƣợc gen cystatin ở cả 2 giống lúa nghiên cứu với với kích thƣớc khoảng 660 bp, kích thƣớc này đúng với kích thƣớc dự kiến khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu.
3.3.3. Kết quả xác định trình tự gen Cystatin
Để xác định trình tự gen cystatin, chúng tôi tiến hành tách dòng gen. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromid 1 % và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím (hình 3.4).
1 2
Hình 3.4.Kết quả điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen cystatin
Ghi chú: 1: LH; 2: Sym6 660bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide.
Sau khi xác định trình tự gen cystatin bằng máy xác định trình tự tự động tại viện Công nghệ sinh học, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: gen cystatin của mẫu LH 664 nucleotide còn của mẫu Sym6 dài 645 nucleotide. Nhƣ vậy, gen cystatin ở mẫu Sym6 ngắn hơn của mẫu LH là 19 nucleotide. Tuy nhiên, 19 nucleotide thiếu hụt đó nằm trong vùng intron nên không ảnh hƣởng gì đến đoạn mã hóa amino acid (hình 3.6).
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50
LH ATGTCGAGCG ACGGAGGGCC GGTGCTTGGC GGCGTCGAGC CGGTGGGGAA
Sym6 ATGTCGAGCG ACGGAGGGCC GGTGCTTGGC GGCGTCGAGC CGGTGGGGAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
LH CGAGAACGAC CTCCACCTCG TCGACCTCGC CCGCTTCGCC GTCACCGAGC
Sym6 CGAGAACGAC CTCCACCTCG TCGACCTCGC CCGCTTCGCC GTCACCGAGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150
LH ACAACAAGAA GGCCGTAAGC GCCCCGCTCT ACCCTCCTCC CTACTTCTCC
Sym6 ACAACAAGAA GGCCGTAAGC GCCCCGCTCT ACCCTCCTCC CTACTTCTCC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200
LH TCTTCGCAAG GCCGGTCGTC CAACTAGATC TGTGTTCTAT GGACTAATTA
Sym6 TCTTCGCAAG GCCGGTCGTC CAACTAGATC TGTGTTCTAT GGACTAATTA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
LH TGCAACGCAT GACACACGGC TCTATTTAAT TTTTAAATTG ATCCAATTCA
Sym6 TGCAACGCAT GACACACGGC TCTATTTAAT TTTTAAATTG AT---
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
260 270 280 290 300
LH ATTTCATTTG TTCTCGCCAA GGAAGTAATT TTGATTCCTA GTCATGTAAA
Sym6 --- -TCTCGCCAA GGAAGTAATT TTGATTCCTA GTCATGTAAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310 320 330 340 350
LH CCTGCTCGAG TCGGTGAGAA AAAAAAAGAT GCGGTGTTGC GTATGTTTGT
Sym6 CCTGCTCGAG TCGGTGAGAA AAAAAAAGAT GCGGTGTTGC GTATGTTTGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
360 370 380 390 400
LH TAAAAGTGCA ATTAGGCAAT TTTTTGTGTT CAAAGATTGT GCTGTGTTCT
Sym6 TAAAAGTGCA ATTAGGCAAT TTTTTGTGTT CAAAGATTGT GCTGTGTTCT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
410 420 430 440 450
LH CTTTTATGAC AATATGGAAC AGGAGGTTCT GGACTGATTA GCATTTAATC
Sym6 CTTTTATGAC AATATGGAAC AGGAGGTTCT GGACTGATTA GCATTTAATC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
460 470 480 490 500
LH TTGATACTAC CATGCGCAGA ATTCTCTGCT GGAGTTCGAG AAGCTTGTGA
Sym6 TTGATACTAC CATGCGCAGA ATTCTCTGCT GGAGTTCGAG AAGCTTGTGA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
510 520 530 540 550
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sym6 GTGTGAAGCA GCAAGTTGTC GCTGGCACTT TGTACTATTT CACAATTGAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
560 570 580 590 600
LH GTGAAGGAAG GGGATGCCAA GAAGCTCTAT GAAGCTAAGG TCTGGGAGAA
Sym6 GTGAAGGAAG GGGATGCCAA GAAGCTCTAT GAAGCTAAGG TCTGGGAGAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
610 620 630 640 650
LH ACCATGGATG GACTTCAAGG AGCTCCAGGA GTTCAAGCCT GTCGATGCCA
Sym6 ACCATGGATG GACTTCAAGG AGCTCCAGGA GTTCAAGCCT GTCGATGCCA
....|....| .... 660
LH GTGCAAATGC CTAA
Sym6 GTGCAAATGC CTAA
Hình 3.5.Trình tự nucleotide của gen cystatin ở hai mẫu LH và Sym6
Vì trình tự gen cystatin mà chúng tôi phân lập là từ DNA tổng số nên có intron còn trình tự gen cystatin công bố trên Ngân hàng gen NCBI phân lập từ mRNA nên không có intron.
So sánh trình tự gen cystatin mà chúng tôi thu đƣợc với trình tự gen trên Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen mà chúng tôi phân lập có 1 intron và 2 exon: exon 1 dài 114 nucleotide (từ vị trí 1 đến 114 trên hình 3.8), exon 2 dài 195 nucleotide (từ vị trí 470 đến 664 trên hình 3.5), 1 intron (từ vị trí 115 đến 469 trên hình 3.5) trong đó: intron ở mẫu Sym6 dài 336 nucleotide còn của mẫu LH dài 355 nucleotide. Đoạn mã hóa dài 309 nucleotide mã hóa cho 102 amino acid (trừ amino acid kết thúc).
So sánh trình tự đoạn mã hóa của gen cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu không thấy có sự khác biệt và giống 100% với đoạn mã hóa của trình tự đã công bố trên NCBI với mã số AF435976. Do đó, trình tự amnino acid suy diễn của protein cystatin ở 2 giống lúa nghiên cứu tƣơng đồng 100% với trình tự amino acid của mẫu AF435976 (hình 3.6).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu và AF435976
Nhƣ vậy, sự khác nhau về trình tự gen cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu chỉ xảy ra trong vùng intron (từ vị trí 243 đến 261 trên hình 3.5). Giống LH nhiều hơn giống Sym6 là 19 nucleotide. Các nucleotide này có ảnh hƣởng đến sự biểu hiện gen hay không là vấn đề cần đƣợc làm sáng tỏ. Hiện nay có nhiều nhà khoa học trên thế giới cũng đang nghiên cứu về vai trò của intron nhƣng sự ảnh hƣởng của nó tới biểu hiện gen vẫn chƣa đƣợc chứng minh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Khối lƣợng 1000 hạt của 9 giống lúa nghiên cứu dao động trong khoảng (20,21) đến (30,80), Chiều dài rễ ở giai đoạn cây non dao động từ 4,98 – 7,12 cm.
1.2. Các giống lúa nghiên cứu có hàm lƣợng protein trong hạt dao động từ: (6,68%) đến (8,66%). Hàm lƣợng lipid dao động trong khoảng (1,19%) đến (2,30%). Giống lúa LH có hoạt tính - amylase mạnh nhất (0,81 đvhđ/mg) và giống lúa Sym6 có hoạt tính - amylase yếu nhất (0,59 đvhđ/mg). Giống lúa có hoạt tính protease cao nhất là mẫu LH (0,19 đvhđ/mg) và giống lúa có hoạt tính protease thấp nhất là mẫu Sym6 (0,12 đvhđ/mg).
1.3. Khả năng chịu hạn của 9 giống lúa nghiên cứu có sự khác nhau, giống lúa LH là mẫu có khả năng chịu hạn tốt nhất, giống lúa Sym6 là mẫu có khả năng chịu hạn kém nhất.
1.4. Đã khuyếch đại, tách dòng và xác định đƣợc gen cystatin của giống lúa LH và Sym6. Mẫu LH có chiều dài gen cystatin là 664 nucleotide còn của giống Sym6 dài 645 nucleotide. Trình tự đoạn mã hóa của gen cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu không thấy có sự khác biệt và giống 100% với đoạn mã hóa của trình tự đã công bố trên NCBI với mã số AF435976 nên protein cystatin của chúng đều dài 102 amino acid
2. Đề nghị
Tiếp tục xác định thêm trình tự gen cystatin của các giống lúa khác để có cơ sở so sánh, xác định chỉ thị phân tử và phục vụ cho việc chuyển gen để có thể tạo ra đƣợc những giống lúa có khả năng chịu hạn tốt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
2. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo Dục.
3. Ngô Mạnh Dũng (2008), Nghiên cứu đặc tính di truyền và đặc tính chịu hạn của một số giống lúa (Ozyra sativa L.),Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên, Tr. 19-32.
4. Đỗ Thị Dƣơng (2011), Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý và hoá sinh của 5 giống lúa cạn địa phương, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên, Tr. 35-39.
5. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng (2002), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục. 6. Nguyễn Văn Hoan (2006), Cẩm nang cây lúa, NXB Lao động Hà Nội. 7. Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein và tính chống chịu ở thực vật, NXB
Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
8. Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền và ứng dụng, NXB Quốc gia Hà Nội.
9. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
10.Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin trong sinh học, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr: 53 – 163.
11. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
12. Nguyễn Thị Tâm (2003), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sỹ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội, Tr. 20-30.