Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của Khoa Khoa học sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Trình tự DNA đƣợc xác định trên thiết bị giải trình tự DNA tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA 9 GIỐNG LÚA NGHIÊN CỨU
3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng hạt
Các giống lúa đƣợc thu thập ở các huyện: Võ Nhai, Phú Bình, Phú Lƣơng, của tỉnh Thái Nguyên; huyện Chợ Mới của tỉnh Bắc Kạn. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng hạt đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hình thái và khối lƣợng hạt của 9 giống lúa
ST T
Tên
mẫu Hình thái hạt Màu vỏ hạt
Khối lƣợng 1000 hạt (gam) 1 ND Quả dài Vàng 30,80± 0,01 2 LTB Quả dài Vàng 23,70± 0,01 3 KD Quả dài Vàng 20,21± 0,01 4 LH Quả dài Vàng 25,09± 0,02 5 NL203 Quả tròn Vàng 24,80± 0,01
6 U17 Quả dài Vàng 22,10± 0,01
7 N97 Quả dài Vàng 25,06± 0,01
8 Sym6 Quả dài Vàng 29,20± 0,02
9 Q Quả dài Vàng 21,20± 0,01
Qua bảng 3.1 cho thấy khối lƣợng 1000 hạt của 9 giống lúa dao động trong khoảng (20,21± 0,01g) đến (30,80± 0,01g), cao nhất là mẫu ND, thấp nhất là mẫu KD. Thứ tự các giống lúa từ cao xuống thấp xếp theo khối lƣợng 1000 hạt là:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các tính trạng khối lƣợng hạt phụ thuộc vào kiểu gen từng giống. Tuy nhiên, khối lƣợng 1000 hạt có thể bị thay đổi do tác động của điều kiện môi trƣờng, chế độ chăm sóc và mùa vụ.
3.1.2. Hàm lượng protein và lipid
Hàm lƣợng protein và lipid là cơ sở để đánh giá chất lƣợng hạt của các giống lúa. Để đánh giá chất lƣợng hạt của các giống lúa nghiên cứu, chúng tôi tiến hành phân tích hàm lƣợng protein và lipid của 9 giống lúa nghiên cứu. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2.Hàm lƣợng protein và lipid của 9 giống lúa
STT Tên mẫu Hàm lƣợng protein (%) Hàm lƣợng lipid (%) 1 ND 8,56±0,13 1,33±0,03 2 LTB 7,83±0,06 1,19±0,01 3 KD 7,89±0,06 1,59±0,08 4 LH 8,66±0,01 2,30±0,06 5 NL203 8,47±0,12 1,27±0,07 6 U17 8,37±0,11 1,32±0,07 7 N97 8,02±0,10 1,37±0,05 8 Sym6 6,68±0,09 1,23±0,06 9 Q 8,42±0,11 1,64±0,08
Hàm lƣợng protein vừa là chỉ tiêu để đánh giá chất lƣợng hạt giống, vừa có vai trò trong quá trình chống chịu hạn của cây. Bảng 3.2 cho thấy, hàm lƣợng protein trong hạt dao động từ: (6,68±0,09%) đến (8,66 ± 0,01%). Giống lúa nghiên cứu có hàm lƣợng protein cao nhất là mẫu LH (8,66 %) và giống lúa nghiên cứu có hàm lƣợng protein thấp nhất là mẫu Sym6 (6,68%). Hàm lƣợng protein trong hạt của 9 giống lúa có thể xếp theo thứ tự giảm dần nhƣ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Qua bảng 3.2 còn cho thấy hàm lƣợng lipid của các giống lúa nghiên cứu dao động trong khoảng (1,19±0,06%) đến (2,30 ± 0,06%). Giống lúa có hàm lƣợng lipid cao nhất là mẫu LH (2,30 %) và giống lúa có hàm lƣợng lipid thấp nhất là mẫu LTB (1,19%). Hàm lƣợng lipid trong hạt của 9 giống lúa có thể xếp theo thứ tự giảm dần nhƣ sau:
LH>Q>KD>N97>ND>U17>NL203>Sym6>LTB
Hàm lƣợng lipid liên quan đến chất lƣợng hạt lúa trên hai phƣơng diện là giá trị dinh dƣỡng và chất lƣợng bảo quản hạt.
3.1.3. Hoạt tính α – amylase
Hoạt tính của - amylase chịu ảnh hƣởng lớn của điều kiện ngoại cảnh. Khi cây lúa gặp hạn sẽ làm hàm lƣợng - amylase tăng, từ đó làm tăng hàm lƣợng đƣờng và tăng áp suất thẩm thấu. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đánh giá hoạt tính - amylase trong hạt của 9 giống lúa. Kết quả đánh giá hoạt tính -
amylase của các giống lúa nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 3.3.
Qua kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, các giống lúa nghiên cứu có hoạt tính enzyme - amylase khác nhau. Hoạt tính - amylase biểu hiện mạnh nhất ở giống lúa LH (0,81đvhđ/mg) và hoạt tính - amylase biểu hiện yếu nhất ở giống lúa Sym6 (0,59đvhđ/mg).
Bảng 3.3. Hoạt tính α – amylase của 9 giống lúa STT Tên mẫu Hoạt tính α – amylase (đvhđ/mg)
1 ND 0,63±0,03 2 LTB 0,62±0,03 3 KD 0,77±0,04 4 LH 0,81±0,03 5 NL203 0,80±0,04 6 U17 0,64±0,05 7 N97 0,67±0,02 8 Sym6 0,59±0,04 9 Q 0,78±0,03
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.4. Hoạt tính protease
Protease là enzyme tham gia vào phân giải các protein lạ hoặc protein bị biến tính khi cây trồng gặp điều kiện cực đoan (hạn, lạnh, nóng…). Dựa vào sự đánh giá này, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính protease trong hạt của 9 giống lúa nghiên cứu. Kết quả xác định hoạt tính protease đƣợc thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hoạt tính protease của 9 mẫu lúa
STT Tên mẫu Hoạt tính protease (đvhđ/mg)
1 ND 0,13±0,02 2 LTB 0,15±0,01 3 KD 0,13±0,01 4 LH 0,19±0,02 5 NL203 0,16±0,03 6 U17 0,18±0,02 7 N97 0,17±0,02 8 Sym6 0,12±0,02 9 Q 0,14±0,02
Qua kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, hoạt tính protease ở các giống lúa khác nhau là khác nhau: Giống lúa nghiên cứu có hoạt tính protease cao nhất là mẫu LH (0,19 đvhđ/mg) và giống lúa nghiên cứu có hoạt tính protease thấp nhất là mẫu Sym6 (0,12 đvhđ/mg).
3.1.5. Chiều dài rễ của 9 giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn cây non
Hiện nay, có nhiều quan điểm khác nhau giải thích cơ chế chịu hạn, trong đó có hai quan điểm đƣợc chấp nhận hơn cả là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Bộ rễ có hình thái khoẻ, dài, mập, có sức xuyên sâu cho cây hút đƣợc nƣớc ở những vùng sâu, vùng xa. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nƣớc của tế bào rễ cây đối với đất. Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tăng lên giúp cho tế bào rễ thu đƣợc các phân tử nƣớc hiếm hoi có trong đất nhờ vậy thực vật có thể vƣợt qua tình trạng hạn cục bộ[7].
Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nƣớc cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Nhờ khả năng hƣớng nƣớc, rễ lúa có thể tìm nguồn nƣớc và nguồn thức ăn một cách chủ động. Khi cây lúa gặp hạn, bộ rễ phát triển mạnh và ăn sâu để có thể tìm kiếm các nguồn nƣớc từ các lớp đất sâu. Vì vậy, sự phát triển và khả năng đâm xuyên của bộ rễ cũng là những chỉ tiêu để đánh giá và nhận dạng các giống ngô có khả năng chịu hạn. Cũng có thể nghiên cứu kích thƣớc rễ ở giai đoạn cây non để đánh giá khả năng chống chịu của cây lúa.
Kết quả nghiên cứu kích thƣớc rễ của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn cây non sau khi gây hạn đƣợc trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Chiều dài rễ của 9 giống lúa STT Tên mẫu Kích thƣớc rễ (cm) 1 ND 5,01 ± 0,17 2 LTB 5,49 ± 0,35 3 KD 5,56 1,12 4 LH 7,12 0,21 5 NL203 6,00 ± 0,25 6 U17 5,78 0,19 7 N97 5,82 0,02 8 Sym6 4,98 0,30 9 Q 5,61 0,14
Từ bảng 3.5 cho thấy, chiều dài rễ ở giai đoạn cây non của 9 giống lúa dao động từ 4,98 – 7,12 cm. Giống lúa có chiều dài rễ dài nhất là LH (7,12 cm), giống lúa có chiều dài rễ ngắn nhất là Sym6 (4,98 cm).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chiều dài rễ của các giống lúa nghiên cứu đƣợc xếp theo thứ tự giảm dần nhƣ sau:
LH>NL203>N97>U17>Q>KD>LTB>ND>Sym6
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA 9 MẪU LÚA Ở GIAI ĐOẠN CÂY MẠ
Khả năng chịu hạn của cây lúa đƣợc biểu hiện rõ ở từng thời điểm. Nhƣng có hai thời kỳ cây lúa mẫn cảm nhất với điều kiện hạn đó là thời kỳ cây non và thời kỳ ra hoa. Do đó, chúng tôi đã đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo theo tỉ lệ: tỉ lệ cây không héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7 ngày thí nghiệm. Từ đây tính đƣợc chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các mẫu lúa. Khi bị hạn, lƣợng nƣớc trong tế bào giảm gây tổn thƣơng cho cây. Các giống khác nhau sẽ có những đáp ứng khác nhau để làm giảm hoặc tránh bị tổn thƣơng. Tỷ lệ thiệt hại của mỗi giống lúa đƣợc xác định trên cơ sở theo dõi số cây héo, cây chết sau 3, 5, 7 ngày hạn, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.1.
Bảng 3.6. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của 9 giống lúa
Tên mẫu
3 ngày 5 ngày 7 ngày Chỉ số
chịu hạn %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH ND 92,50 100 55,00 6,67 25,00 15,40 4607 LTB 92,50 33,00 57,50 13,30 27,50 30,80 2037 KD 92,50 33,30 60,00 14,30 35,00 41,70 2322 LH 100 100 80,00 50,00 47,50 41,20 7742 NL203 100 100 77,50 44,40 45,00 41,20 7363 U17 97,50 100 72,50 30,00 40,00 37,50 6431 N97 100 100 77,50 33,3 42,50 38,90 6879 Sym6 87,50 20,00 52,50 6,67 22,50 7,70 1021 Q 95,00 50,00 67,50 25,00 35,00 31,30 3464
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.6 cho thấy, sau 3, 5, 7 ngày gây hạn, cả 9 giống nghiên cứu đều chịu ảnh hƣởng của hạn và tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra tăng theo thời gian gây hạn. Sau 3 ngày gây hạn, các giống lúa bắt đầu bị ảnh hƣởng nhƣng mức độ thấp, sau 5 ngày hạn, mức độ ảnh hƣởng đã tăng lên rõ rệt. Dựa trên số cây không héo và cây phục hồi ở trên chúng tôi tính chỉ số chịu hạn. Chỉ số chịu hạn giảm dần theo thứ tự sau:
LH>NL203>N97>U17>Q>KD>TB>ND>Sym6
Nhƣ vậy, mẫu LH có chỉ số chịu hạn cao nhất, mẫu có chỉ số chịu hạn thấp nhất là mẫu Sym6. 0 20 40 60 80 100 %CKH3 %CPH3 %CKH5 %CPH5 %CKH7 %CPH7 ND LTB KD LH NL203 U17 N97 Sym 6 Q
Hình 3.1. Đồ thị rada biểu diễn khả năng chịu hạn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chúng tôi nhận thấy có sự liên quan giữa khả năng chịu hạn với hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, hoạt tính - amylase, protease, chiều dài rễ. Những giống có khả năng chịu hạn tốt thì hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, hoạt tính - amylase, protease, chiều dài rễ cũng cao. Ngƣợc lại, những giống chịu hạn kém thì hoạt độ - amylase, protease, chiều dài rễ thấp hơn so với giống chịu hạn tốt. Từ kết quả ở trên, chúng tôi lựa chọn giống LH (chịu hạn tốt) và giống Sym6 (chịu hạn kém) để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm của gen Cystatin.
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Lấy lá non của 9 giống lúa sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Sau khi tách chiết và tinh sạch, hàm lƣợng và độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Đồng thời, DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X và chụp ảnh trên máy soi gel để đánh giá chất lƣợng DNA. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.2
Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống lúa nghiên cứu
Trong đó: M: marker lamda; 1: LH; 2: Sym6
Tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lƣợng của DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.7. Phổ hấp phụ DNA ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm của 2 giống lúa nghiên cứu
Tên giống A260 A280 A260/280 Hàm lƣợng DNA (ng/μl)
LH 0,122 0,065 1,88 1220
Sym6 0,155 0,078 1,99 1550
Từ bảng 3.7 cho thấy: tỷ số A269/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0 chứng tỏ 2 mẫu DNA tổng số tách chiết có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Kết quả nhân gen Cystatin
Sau khi tiến hành kiểm tra và đảm bảo độ tinh sạch của DNA tổng số thu đƣợc, chúng tôi đã tiến hành nhân gen cystatin của 2 giống lúa nghiên cứu, một giống lúa có khả năng chịu hạn tốt, một giống lúa có khả năng chịu hạn kém bằng phƣơng pháp PCR. Thành phần phản ứng PCR đƣợc thể hiện ở bảng 2.4. Nhiệt độ gắn mồi đƣợc chúng tôi tính toán dựa trên đặc điểm trình tự mồi đã thiết kế. Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 56oC. Sau 30 chu kì phản ứng, kết quả nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với marker 1kb và đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen cystatin ở 2 giống luá LH và Sym6
Ghi chú: M. marker 1kb; 1: LH; 2: Sym6
Qua hình 3.3 cho thấy, đã khuếch đại đƣợc gen cystatin ở cả 2 giống lúa nghiên cứu với với kích thƣớc khoảng 660 bp, kích thƣớc này đúng với kích thƣớc dự kiến khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu.
3.3.3. Kết quả xác định trình tự gen Cystatin
Để xác định trình tự gen cystatin, chúng tôi tiến hành tách dòng gen. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromid 1 % và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím (hình 3.4).
1 2
Hình 3.4.Kết quả điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen cystatin
Ghi chú: 1: LH; 2: Sym6 660bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide.
Sau khi xác định trình tự gen cystatin bằng máy xác định trình tự tự động tại viện Công nghệ sinh học, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: gen cystatin của mẫu LH 664 nucleotide còn của mẫu Sym6 dài 645 nucleotide. Nhƣ vậy, gen cystatin ở mẫu Sym6 ngắn hơn của mẫu LH là 19 nucleotide. Tuy nhiên, 19 nucleotide thiếu hụt đó nằm trong vùng intron nên không ảnh hƣởng gì đến đoạn mã hóa amino acid (hình 3.6).
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50
LH ATGTCGAGCG ACGGAGGGCC GGTGCTTGGC GGCGTCGAGC CGGTGGGGAA
Sym6 ATGTCGAGCG ACGGAGGGCC GGTGCTTGGC GGCGTCGAGC CGGTGGGGAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
LH CGAGAACGAC CTCCACCTCG TCGACCTCGC CCGCTTCGCC GTCACCGAGC
Sym6 CGAGAACGAC CTCCACCTCG TCGACCTCGC CCGCTTCGCC GTCACCGAGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150
LH ACAACAAGAA GGCCGTAAGC GCCCCGCTCT ACCCTCCTCC CTACTTCTCC
Sym6 ACAACAAGAA GGCCGTAAGC GCCCCGCTCT ACCCTCCTCC CTACTTCTCC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200
LH TCTTCGCAAG GCCGGTCGTC CAACTAGATC TGTGTTCTAT GGACTAATTA
Sym6 TCTTCGCAAG GCCGGTCGTC CAACTAGATC TGTGTTCTAT GGACTAATTA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
LH TGCAACGCAT GACACACGGC TCTATTTAAT TTTTAAATTG ATCCAATTCA
Sym6 TGCAACGCAT GACACACGGC TCTATTTAAT TTTTAAATTG AT---
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
260 270 280 290 300
LH ATTTCATTTG TTCTCGCCAA GGAAGTAATT TTGATTCCTA GTCATGTAAA
Sym6 --- -TCTCGCCAA GGAAGTAATT TTGATTCCTA GTCATGTAAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310 320 330 340 350
LH CCTGCTCGAG TCGGTGAGAA AAAAAAAGAT GCGGTGTTGC GTATGTTTGT
Sym6 CCTGCTCGAG TCGGTGAGAA AAAAAAAGAT GCGGTGTTGC GTATGTTTGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
360 370 380 390 400
LH TAAAAGTGCA ATTAGGCAAT TTTTTGTGTT CAAAGATTGT GCTGTGTTCT
Sym6 TAAAAGTGCA ATTAGGCAAT TTTTTGTGTT CAAAGATTGT GCTGTGTTCT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
410 420 430 440 450
LH CTTTTATGAC AATATGGAAC AGGAGGTTCT GGACTGATTA GCATTTAATC
Sym6 CTTTTATGAC AATATGGAAC AGGAGGTTCT GGACTGATTA GCATTTAATC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
460 470 480 490 500
LH TTGATACTAC CATGCGCAGA ATTCTCTGCT GGAGTTCGAG AAGCTTGTGA
Sym6 TTGATACTAC CATGCGCAGA ATTCTCTGCT GGAGTTCGAG AAGCTTGTGA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
510 520 530 540 550
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sym6 GTGTGAAGCA GCAAGTTGTC GCTGGCACTT TGTACTATTT CACAATTGAG