Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập Gen Cystatin ở một số giống ngô chịu hạn khác nhau

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - NGUYỄN PHƯƠNG THẢO ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ CHỊU HẠN KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, ngô lƣơng thực quan trọng đƣợc trồng nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng mùa vụ gieo trồng hệ thống canh tác [4] Cây ngô không cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà trồng xóa đói giảm nghèo tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn Tuy nhiên năm qua, hạn chế điều kiện tƣới tiêu, tập quán canh tác đặc biệt việc chọn giống chịu hạn đƣa vào sản xuất chƣa đƣợc trọng, thêm vào diễn biến thời tiết phức tạp, hạn hán thƣờng xuyên xảy nên suất ngô nƣớc ta thấp Nƣớc ta có 75% diện tích đồi núi, lƣợng mƣa hàng năm không đồng vùng, tình trạng hạn hán thƣờng xuyên diễn dẫn đến suất trồng nói chung ngô nói riêng bị giảm Năm 2004, tỉnh Đắc Lắc có 28000 ngô bị hạn, trắng 60% giảm suất 40% Để hạn chế ảnh hƣởng hạn tới suất ngô, năm gần nƣớc ta tuyển chọn mở rộng trồng giống ngô lai có khả chịu hạn tốt, cho suất cao Ngoài ra, có nhiều công trình nghiên cứu đến khả chịu hạn ngô Đó kết đánh giá khả chịu hạn ngô đồng ruộng [17], đánh giá khả chịu hạn ngô non điều kiện hạn nhân tạo [11], [18]), nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả tạo mô sẹo ngô [14] Có số công trình nghiên cứu ngô tiếp cận phân tích đại phân tử DNA nhƣ: phân lập gen dehydrin dhn1/rab17 từ DNA genome [6]), phân lập gen dehydrin từ cDNA [25]) Những nghiên cứu mức độ phân tử nhằm mục đích tìm kiếm phân tích gen liên quan đến đặc tính chịu hạn ngô Các nghiên cứu thống đặc tính chịu hạn ngô nói riêng trồng nói chung nhiều gen định, có gen cystatin Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn việc chọn tạo giống ngô theo hƣớng nâng cao khả chịu hạn, tiến hành đề tài nghiên cứu “Đánh giá khả chịu hạn phân lập gen cystatin số giống ngô chịu hạn khác nhau” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc mức độ chịu hạn số giống ngô giai đoạn non -Xác định đƣợc mối liên quan hoạt tính enzyme α – amylase, protease, chiều dài rễ với khả chịu hạn số giống ngô - Phân lập xác định đƣợc trình tự gen cystatin số giống ngô có khả chịu hạn khác NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả chịu hạn phƣơng pháp gây hạn nhân tạo giai đoạn 3, 5, 7, ngày gây hạn - Xác định hoạt tính α – amylase, protease hạt 10 giống ngô nghiên cứu - Xác định chiều dài rễ ngày tuổi giai đoạn non - Tách chiết DNA tổng số 10 giống ngô nghiên cứu - Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân gen cystatin số giống ngô - Tách dòng gen cystatin giống ngô: giống chịu hạn tốt giống chịu hạn - Xác định trình tự gen cystatin giống ngô có khả chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGÔ 1.1.1 Nguồn gốc phân loại Cây ngô có tên khoa học Zea mays L., loại lƣơng thực thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo (Gramineae), hòa thảo (Graminales) Căn vào kết nghiên cứu khảo cổ học, tế bào học, di truyền học…cho thấy ngô có nguồn gốc từ Châu Mỹ, ngô lan truyền sang Châu Âu phần lại giới sau có tiếp xúc ngƣời Châu Âu với Châu Mỹ Ở Việt Nam ngô đƣợc trồng vào kỷ thứ XVII Dựa vào hạt có mày hay mày, hình thái bên cấu trúc nội nhũ hạt, ngô đƣợc phân thành loài phụ: ngô bọc, ngô đá, ngô ngựa, ngô đƣờng, ngô nổ, ngô bột, ngô nếp, ngô đƣờng bột, ngô bán ngựa Từ loài phụ vào màu sắc hạt màu sắc lõi ngô để phân thành thứ Đây cách phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngô đƣợc phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trƣởng thƣơng phẩm [8] 1.1.2 Đặc điểm sinh học Ngô lƣơng thực thấy dạng trồng bao gồm phận: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) hạt Ngô có hệ rễ tiêu biểu cho rễ hòa thảo Tuy nhiên ngô có rễ phát triển mạnh, nên có khả hút nƣớc khỏe, nhiều loài trồng khác Hệ rễ ngô hoàn chỉnh chia thành nhóm: rễ mầm, rễ đốt, rễ chân kiềng Rễ mầm mọc từ trụ mầm, chức rễ hút nƣớc, thức ăn non Rễ đốt mọc vòng quanh đốt thấp thân Đây loại rễ định trình sinh trƣởng phát triển ngô, giúp hút nƣớc chất dinh dƣỡng suốt đời sống Rễ chân kiềng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn mọc quanh đốt thấp sát mặt đất Rễ giúp chống đỡ bám chặt vào đất, chúng tham gia hút nƣớc thức ăn Số lƣợng rễ, số lông rễ độ dài rễ khác giống Đây tiêu quan trọng để đánh giá khả chịu hạn Thân ngô đặc, đƣờng kính từ - cm, cao từ 1,8 - m Thân ngô trƣởng thành bao gồm nhiều lóng nằm đốt kết thúc cờ Thân ngô nhiệm vụ giúp đứng vững, phận dự trữ vận chuyển chất hữu cơ, có khả quang hợp để tổng hợp chất hữu Lá ngô mọc từ mắt đốt mọc đối xứng xen kẽ Các phận bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa Theo hình thái vị trí thân, ngô đƣợc chia thành nhóm: mầm, thân, bẹ, bi Số lá, độ lớn phụ thuộc vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác, mùa vụ, số ngô thƣờng biến động từ 15 - 20 Đặc điểm bật ngô có nhiều khí khổng Trung bình ngô có từ - triệu khí khổng, 1mm2 có từ 500 - 900 khí khổng Cơ chế đóng mở lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ tới điều kiện hạn hán Lá ngô quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dƣỡng… Ngô loại có hoa khác tính gốc Cơ quan sinh sản đực (bông cờ) (bắp) nằm song vị trí khác Hoa đực nằm đỉnh Hoa phát sinh từ mầm nách thân, số mầm nách nhiều nhƣng có từ - mầm nách phát triển thành bắp Số bắp phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ phân bón Hạt ngô thuộc loại dĩnh gồm phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi, nội nhũ chân hạt Vỏ hạt bao xung quanh hạt màng nhẵn Lớp alơrôn nằm dƣới vỏ hạt Nội nhũ phần hạt chứa 70 - 78% khối lƣợng hạt với giá trị dinh dƣỡng cao so với loại hạt ngũ cốc khác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phôi ngô có: ngù (phần ngăn cách nội nhũ phôi), mầm, trụ dƣới mầm, rễ mầm chồi mầm Trong bốn phần mầm thƣờng phát triển rõ rệt Phôi ngô lớn chiếm - 15% trọng lƣợng hạt Màu sắc hạt phụ thuộc đặc tính di truyền giống chủng loại, hạt ngô có nhiều màu sắc khác nhƣ: trắng, vàng, tím, da cam, đỏ…Mỗi bắp ngô có từ 200 1000 hạt phụ thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh, sinh thái, trung bình bắp có từ 500 - 600 hạt Quá trình sinh trƣởng, phát triển ngô đƣợc chia thành hai giai đoạn: giai đoạn sinh dƣỡng giai đoạn sinh thực Giai đoạn sinh dƣỡng đƣợc tính từ gieo đến trỗ cờ Giai đoạn sinh thực đƣợc tính từ trỗ cờ đến chín hoàn toàn Căn vào đặc điểm trình sinh trƣởng phát triển chia giai đoạn sinh trƣởng phát triển quan trọng sau đây: giai đoạn hạt nảy mầm mọc; giai đoạn từ mọc đến lá; giai đoạn từ đến lá; giai đoạn từ đến trổ cờ; giai đoạn từ trỗ cờ đến tung phấn, phun râu; giai đoạn từ thụ phấn đến chín [8] Trong giai đoạn ngô yêu cầu điều kiện khác giai đoạn có ảnh hƣởng khác đến yếu tố tạo thành suất chất lƣợng hạt ngô [8] 1.1.3 Giá trị kinh tế ngô Ngô lƣơng thực quan trọng kinh tế toàn cầu Bên cạnh vai trò cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, ngô nguyên liệu quan trọng công nghiệp chế biến thức ăn gia súc công nghệ sinh học Nhiều nƣớc sử dụng ngô để chế biến ethanol - lƣợng tƣơng lai Ngô lƣơng thực nuôi sống gần 1/3 dân số toàn giới, tất nƣớc trồng ngô nói chung ăn ngô mức độ khác Nếu nhƣ châu Âu phần ăn là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; châu Á cơm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (gạo), cá, rau xanh (canh) châu Mỹ La Tinh bánh ngô, đậu đỗ ớt Ngoài ra, bắp ngô bao tử đƣợc sử dụng làm rau cao cấp, lấy hạt làm nguyên liệu chế biến mặt hàng có giá trị dinh dƣỡng cao nhƣ sữa ngô, ngô đóng hộp, đóng lọ… Ngô thức ăn giàu lƣợng, thành phần quan trọng thức ăn hỗn hợp cho gia súc gia cầm Hầu nhƣ 70% chất dinh dƣỡng thức ăn tổng hợp từ ngô Cây ngô thức ăn xanh ủ chua lý tƣởng cho đại gia súc, đặc biệt bò sữa Ngô cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp Ngƣời ta sản xuất khoảng 670 mặt hàng khác ngành công nghiệp lƣơng thực - thực phẩm, công nghiệp dƣợc công nghiệp nhẹ Ngoài ngô nguồn hàng hóa xuất có giá trị cao Trên giới hàng năm lƣợng ngô xuất nhập khoảng 70 triệu đem lại nguồn lợi nhuận kinh tế lớn [9] Ở Việt Nam, ngô lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa màu quan trọng đƣợc trồng nhiều vùng sinh thái khác Cây ngô không cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà trồng xóa đói giảm nghèo tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn [4] 1.1.4 Đặc điểm hóa sinh hạt ngô Thành phần hydratcacbon ngô chủ yếu tinh bột (60 - 70%), lipid chủ yếu acid béo, protein dạng zein chiếm đa số, hàm lƣợng đƣờng khoảng 3,5%, lƣợng tro khoảng - 2,4%, chất khoáng chiếm 60% khối lƣợng phôi [8] Tinh bột ngô hình tròn, hình đa diện, góc cạnh rõ rệt, kích thƣớc khoảng - 35 µm Tinh bột tập trung chủ yếu nội nhũ đƣợc chia thành hai dạng tinh bột mềm (tinh bột bột) tinh bột cứng (tinh bột sừng) Đặc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn điểm tinh bột nội nhũ hạt tiêu chuẩn để phân loại loài ngô phụ Hàm lƣợng tinh bột ngô tẻ (68%) nhiều ngô nếp (65%) [8] Tỷ lệ chất béo hạt ngô tƣơng đối cao (3 - 6%), chủ yếu tập trung mầm ngô Trong chất béo ngô có 50% acid linoleic, 31% acid oleic, 13% acid panmitic 3% stearic Hàm lƣợng lipid tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng hạt [5] Tỷ lệ protein hạt ngô - 12% Protein ngô zein, loại prolamin gần nhƣ lysine tryptophan Protein ngô đƣợc chia thành loại chính: protein hoạt tính (enzyme), protein cấu tạo protein dự trữ, protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao Hàm lƣợng protein nhƣ thành phần amino acid bị thay đổi tác động yếu tố di truyền (giống) môi trƣờng, kỹ thuật canh tác Vitamin ngô tập trung lớp hạt ngô mầm Ngô có nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6 ) Vitamin PP thấp cộng với thiếu tryptophan amino acid tạo vitamin PP Riêng ngô vàng chứa nhiều carotene (tiền vitamin A) [9] 1.1.5 Tình hình sản xuất ngô giới Việt Nam 1.1.5.1 Tình hình sản xuất ngô giới Với giá trị kinh tế sử dụng mình, ngô đƣợc xem lƣơng thực quan trọng kinh tế toàn cầu đứng thứ ba sau lúa gạo lúa mỳ Ngô có địa bàn phân bố rộng giới, trải rộng từ 40o N đến gần 55o B, từ độ cao - m đến 400 m so với mực nƣớc biển [9] Do ngô đƣợc trồng hầu hết nơi giới nhƣ Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi Châu Á Diện tích, suất, sản lƣợng ngô châu lục có chênh lệch tƣơng đối lớn đƣợc thể bảng 1.1 [58] Diện tích trồng ngô châu lục có chênh lệch nhau, Châu Mỹ khu vực có diện tích trồng ngô lớn nhất, năm 2008 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60,4 triệu đến năm 2010 63,1 triệu ha, chiếm gần 40% diện tích ngô toàn giới Đứng thứ hai Châu Á chiếm 33,2% Châu Âu có diện tích trồng ngô thấp, chiếm khoảng 8,7% diện tích trồng ngô giới Châu Mỹ khu vực có suất cao đạt 71,0 tạ/ha, đứng thứ hai khu vực Châu Âu: 60,6 tạ/ha, thấp Châu Á: 45,8 tạ/ha (năm 2010) Sở dĩ Châu Á có suất thấp nhƣ khu vực có điều kiện bất thuận nhƣ; hạn hán, lũ lụt, đất canh tác chƣa thuận lợi Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ngô số khu vực giới giai đoạn 2008 - 2010 Khu vực Diện tích Năng suất Sản lượng (Triệu ha) (Tạ/ha) (Triệu tấn) 2008 2009 2010 2008 2009 2010 2008 2009 2010 Châu Âu 15,4 13,8 14,1 60,5 60,7 60,6 93,2 84,0 85,6 Châu Á 52,4 53,5 53,7 45,5 43,8 45,8 238,4 234,5 246,1 Châu Mỹ 60,4 61,4 63,1 68,6 71,9 71,0 439,5 441,5 447,9 Thế giới 161,2 158,8 161,9 51,3 51,6 52,1 827,5 819,7 844,4 (Nguồn FAOSTAT, 2011) Giai đoạn 2008 - 2009, Châu Mỹ có suất tăng mạnh, tăng 3,3 tạ/ha; Châu Âu tăng nhẹ: 0,2 tạ/ha; khu vực Châu Á có suất giảm (giảm 1,7 tạ/ha) điều kiện bất thuận Về sản lƣợng, Châu Mỹ khu vực dẫn đầu sản lƣợng ngô toàn giới, năm 2008 đạt 439,5 triệu chiếm 53,1% tổng sản lƣợng ngô toàn giới Đứng thứ hai khu vực Châu Á đạt 238,4 triệu tấn, chiếm 28,8% tổng sản lƣợng ngô toàn giới Năm 2010 Châu Mỹ đạt 447,9 triệu tấn, chiếm 53,0% tổng sản lƣợng ngô toàn giới, khu vực Châu Á đạt 246,1 triệu tấn, chiếm 29,1% tổng sản lƣợng ngô toàn giới Nhƣ vậy, giai đoạn từ năm 2008 đến năm 2010 diện tích trồng ngô toàn giới tăng không đáng kể, nhƣng áp dụng thành tựu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn khoa học kỹ thuật tiên tiến, đặc biệt việc mở rộng diện tích trồng ngô lai nên suất sản lƣợng ngô giới có nhảy vọt, nƣớc có kinh tế phát triển có điều kiện thâm canh cao sử dụng 100% giống ngô lai sản xuất Bên cạnh đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo giống ngô chuyển gen có suất cao, có khả chống chịu sâu bệnh góp phần đƣa sản lƣợng ngô giới tăng cao Tình hình sản xuất ngô nƣớc giới có khác [58] Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô số quốc gia giới năm 2010 Diện tích Năng suất Sản lượng (Triệu ha) (Tạ/ ha) (Triệu tấn) Argentina 2,90 78,12 22,68 Mỹ 32,96 95,92 316,17 Brazin 12,81 43,75 56,06 Trung Quốc 32,52 54,60 177,54 Ấn Độ 7,18 19,60 14,10 Tên nước (Nguồn FAOSTAT, 2011) Trên giới, Mỹ nƣớc có diện tích, suất, sản lƣợng ngô lớn đạt 32,96 triệu ha, với tổng sản lƣợng đạt 316,17 triệu tấn, suất bình quân đạt 95,92 tạ/ha Kết có đƣợc, trƣớc hết nhờ đầu tƣ cho nghành nông nghiệp, không ngừng cải thiện kỹ thuật canh tác, đồng thời ứng dụng công nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống góp phần đƣa suất sản lƣợng ngô nƣớc cao nƣớc khác Các giống trồng chuyển gen đƣợc tạo nhờ công nghệ sinh học đƣợc trồng phổ biến, đem lại lợi nhuận nông nghiệp cao, nƣớc Mỹ tập trung vào mũi nhọn bông, đậu tƣơng ngô Có thể nói Mỹ Trung Quốc hai nƣớc có diện tích trồng ngô lớn cao gấp nhiều lần so với quốc gia khác Mỹ Trung Quốc, với Ấn Độ nƣớc xuất ngô lớn, nƣớc nhập ngô Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Malaysia, Mexico, châu Phi…[9] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... nâng cao khả chịu hạn, tiến hành đề tài nghiên cứu Đánh giá khả chịu hạn phân lập gen cystatin số giống ngô chịu hạn khác nhau MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc mức độ chịu hạn số giống ngô giai... chiều dài rễ với khả chịu hạn số giống ngô - Phân lập xác định đƣợc trình tự gen cystatin số giống ngô có khả chịu hạn khác NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả chịu hạn phƣơng pháp gây hạn nhân tạo... thuật PCR để nhân gen cystatin số giống ngô - Tách dòng gen cystatin giống ngô: giống chịu hạn tốt giống chịu hạn - Xác định trình tự gen cystatin giống ngô có khả chịu hạn Số hóa Trung tâm Học