Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học và phân lập gen cystatin của một số dòng lạc (Arachis hypogaea L.) có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và xử lý chiếu xạ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM TUẤN OANH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN CỦA MỘT SỐ DÕNG LẠC (Arachis hypogaea L.) CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC VÀ XỬ LÝ CHIẾU XẠ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2011 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM TUẤN OANH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN CỦA MỘT SỐ DÕNG LẠC (Arachis hypogaea L.) CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC VÀ XỬ LÝ CHIẾU XẠ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2011 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình h ƣ ớng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Thị Thu Thủy (Khoa Sinh - KTNN) đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các kỹ thuật viên phòng Hóa sinh; Phòng Công nghệ tế bào; Phòng Di truyền và Công nghệ gen (Khoa Sinh - KTNN - Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Thái Nguyên); Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen (Viện Khoa học Sự sống - ĐH Thái Nguyên) và các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên, Khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN và các thầy cô giáo, cán bộ trong khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời những cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên và ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Tác giả Phạm Tuấn Oanh Trang bìa phụ MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh mục các chữ viết tắt iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình vi MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. CÂY LẠC 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây lạc 3 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của hạt lạc 4 1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 5 1.2. TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 7 1.2.1. Hạn và tác động của hạn đến thực vật 7 1.2.2. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn 8 1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 10 1.4. MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY TRỒNG VÀ CÂY LẠC 12 1.5. CYSTATIN VÀ GEN CYSTATIN Ở THỰC VẬT 14 1.5.1. Cysteine proteinase 14 1.5.2. Cystatin chất ức chế cysteine proteinase 15 1.5.3. Gen mã hóa cystatin ở thực vật và cây lạc 19 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.1.1. Vật liệu thực vật 21 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 21 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 22 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1. Mô hình nghiên cứu tổng quát 22 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng 23 2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng hạt 23 2.2.4. Khả năng chịu hạn của các dòng lạc đƣợc đánh giá ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng phƣơng pháp gây hạn sinh lý 24 2.2.5. Phƣơng pháp sinh học phân tử 25 2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC VÀ CHẤT LƢỢNG HẠT CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU 28 3.1.1. Đặc điểm nông học của một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 28 3.1.2. Chất lƣợng hạt của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 31 3.1.3. Đặc điểm nông học của một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Sáu 35 3.1.4. Nhận xét về đặc điểm nông học, chất lƣợng hạt của các dòng lạc nghiên cứu 37 3.2. KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở GIAI ĐOẠN NẢY MẦM CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU Ở THẾ HỆ THỨ NĂM TRONG ĐIỀU KIỆN GÂY HẠN SINH LÝ 40 3.2.1. Hoạt độ của α - amylase trong điều kiện gây hạn sinh lý 40 3.2.2. Hàm lƣợng đƣờng trong điều kiện gây hạn sinh lý 42 3.2.3. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ của α - amylase và hàm lƣợng đƣờng của các dòng lạc nghiên cứu trong giai đoạn hạt nảy mầm 43 3.2.4. Hoạt độ của protease trong điều kiện gây hạn sinh lý 44 3.2.5. Hàm lƣợng protein trong điều kiện gây hạn sinh lý 46 3.2.6. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ của protease và hàm lƣợng protein ở giai đoạn hạt nảy mầm 48 3.2.7. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các dòng lạc nghiên cứu trong điều kiện hạn sinh lý ở giai đoạn hạt nảy mầm 48 3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN Ở LẠC 49 3.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 49 3.3.2. Kết quả PCR nhân gen cystatin 50 3.3.3. Kết quả tách dòng gen cystatin 51 3.3.4. Kết quả xác định trình tự nucleotide 52 3.3.5. Kết quả so sánh trình tự amino acid 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid bp Base pair CTAB N- Cetyl- N,N,N- trimethyl amonium bromide Cv Hệ số biến động cDNA Complementary DNA ĐC Đối chứng DNA Deoxyribose Nucleic Acid ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ đtg Đồng tác giả EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid HSP Heat shock protein IPTG Isopropyl β – D –1 thiogalactopyranoside ha Hecta Krad Kilorad Kb Kilo base kDa Kilo dalton LB Luria – Bertani LEA Late embryogenesis abundant LTP Lipid transfer protein MGPT Môi giới phân tử mRNA Messenger Ribonucleic acid Nxb Nhà xuất bản OD Optical density PCR Polymerase chain reaction TAE Tris acetate EDTA TN Thí nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lƣợng lạc trên thế giới từ năm 2005 – 2009 5 Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc ở Việt Nam từ 2005 – 2009 6 Bảng 3.1. Một số đặc điểm nông học của các dòng lạc ở thế hệ thứ Năm 28 Bảng 3.2. Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất và chất lƣợng hạt của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 32 Bảng 3.3. Đặc điểm nông học của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Sáu 35 Bảng 3.4. Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất các dòng lạc ở thế hệ thứ Sáu 37 Bảng 3.5. Hoạt độ của α - amylase trong điều kiện gây hạn sinh lý 41 Bảng 3.6. Hàm lƣợng đƣờng tan trong điều kiện gây hạn sinh lý 43 Bảng 3.7. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ của α - amylase và hàm lƣợng đƣờng tan ở giai đoạn hạt nảy mầm 44 Bảng 3.8. Hoạt độ của protease trong điều kiện gây hạn sinh lý 45 Bảng 3.9. Hàm lƣợng protein trong điều kiện gây hạn sinh lý 47 Bảng 3.10. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ của protease và hàm lƣợng protein ở giai đoạn hạt nảy mầm 48 Bảng 3.11. Sự sai khác về trình tự nucleotide ở dòng R 5 .44, RM 5 .46 và ba trình tự gen cystatin lạc đã công bố trên GenBank 55 Bảng 3.12. Độ tƣơng đồng và độ sai khác của trình tự gen cystatin ở dòng lạc RM 5 .46 và R 5 .44 với ba trình tự gen cystatin lạc công bố trên Genbank 56 [...]... các dòng cây lạc mang các tính trạng mong muốn, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học và phân lập gen cystatin của một số dòng lạc (Arachis hypogaea L.) có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và xử lý chiếu xạ 2 Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn đƣợc dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý thổi khô và thổi khô kết hợp chiếu xạ ƣu việt về một số đặc điểm nông sinh học và. .. năng chịu hạn ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu Xác định đƣợc điểm khác biệt về trình tự gen cystatin của dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý thổi khô và thổi khô kết hợp chiếu xạ so với giống gốc ở thế hệ thứ Năm 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý thổi khô và chiếu xạ ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu 3.2 Đánh. .. thế hệ thứ Sáu 3.2 Đánh giá chất lƣợng hạt của một số dòng lạc nghiên cứu thông qua xác định hàm lƣợng lipid và protein trong hạt tiềm sinh ở thế hệ thứ Năm 3.3 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm của các dòng lạc nghiên cứu trong điều kiện hạn sinh lý ở thế hệ thứ Năm 3.4 Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen cystatin của dòng lạc chịu hạn tốt và dòng lạc chịu hạn kém ở thế hệ... không thay thế Các dòng chọn lọc tiếp tục đƣợc đánh giá về khả năng chịu hạn để chọn lọc dòng ƣu việt [15] Vũ Thị Thu Thủy và đtg (2011) bằng kỹ thuật xử lý mất nƣớc mô sẹo và gây đột biến bằng chiếu xạ liều 2 krad kết hợp với thổi khô 9 giờ giống lạc L18 đã thu đƣợc 167 dòng mô, từ đó tạo ra 198 dòng lạc Đánh giá các đặc điểm nông sinh học qua 5 thế hệ, tác giả đã thu đƣợc 7 dòng có sự ổn định các... EcoRI và BamHI 52 Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide của gen cystatin ở dòng R5.44, RM5.46 và ba trình tự gen cystatin lạc đã công bố trên GenBank 54 Hình 3.12 Mối quan hệ di truyền của gen cystatin ở dòng lạc R5.44 và RM5.46 với ba trình tự gen cystatin lạc đã công bố trên Genbank 56 Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid của gen cystatin ở dòng lạc R5.44 và RM5.46 với ba trình tự gen cystatin. .. chống chịu của cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào nhƣ chịu hạn lúa [14] Adkins và đtg (1995) bằng việc bổ sung PEG8000 vào môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105 đã chọn đƣợc dòng lúa chịu hạn có những tính trạng nông học quan trọng và khả năng chịu hạn đƣợc duy trì và ổn định ở thế hệ R2 [23] Nguyễn Thị Tâm và đtg (2009) tiến hành đánh giá một số đặc điểm hóa sinh của các dòng. .. mức độ khác nhau (gen, tế bào, mô, cơ quan nuôi cấy, phân lập cây hoàn chỉnh) Tính ƣu việt của kỹ thuật này đã đƣợc khẳng định trên cây lúa [2] Đối với cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy và đtg (2009), bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, kết hợp gây mất nƣớc và xử lý mô sẹo bằng chiếu xạ đã chọn lọc đƣợc một số dòng cây xanh từ mô sẹo giống lạc L18 Các dòng lạc chọn lọc đƣợc trồng và đánh giá qua các thế... LIỆU 1.1 CÂY LẠC 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây lạc Cây lạc là loại cây thân thảo, thuộc học đậu (Leguminosae), chi Arachis, phân họ cánh bƣớm phƣợng (Papillionaceae), bộ NST 2n = 40 Chi Arachis có 9 loài Loài lạc trồng là Arachis hypogaea L Loài Arachis hypogaea gồm nhiều kiểu, dạng và biến chủng khác nhau [4] Cây lạc có nguồn gốc từ Nam Mỹ Sau đó, lạc đƣợc đƣa... tuyển chọn và phân loại các dòng theo nhóm có triển vọng về năng suất, chất lƣợng hạt và có khả năng chống chịu hạn [20] Để góp phần nghiên cứu bản chất của tính chống chịu ở thực vật, việc nghiên cứu và phân lập các gen liên quan đến tính chống chịu là rất cần thiết Qua đó, giúp các nhà chọn giống phân tích và đánh giá hệ gen thực vật một cách nhanh chóng, xác định sự thay đổi của các dòng chọn lọc... thân chính, số quả/cây, số quả chắc/cây tốt hơn so với giống gốc Phân tích một số đặc điểm nông học, chỉ tiêu năng suất, chất lƣợng hạt ở thế hệ thứ năm và sự sai khác hệ gen của 7 dòng chọn lọc đã tuyển chọn 3 dòng ƣu việt về năng suất, chất lƣợng hạt Các dòng ƣu việt trên đƣợc tiếp tục đánh giá, theo doi về các tính trạng liên quan đến khả năng chịu hạn của cây lạc [20] Đinh Thị Phòng và đtg (2004) . THẢO LUẬN 28 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC VÀ CHẤT LƢỢNG HẠT CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU 28 3.1.1. Đặc điểm nông học của một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 28 3.1.2. Chất. tiêu/năm 2005 2006 2007 20 08 2009 Diện tích (triệu ha) 24,05 21,62 22,47 23,96 23,95 Năng suất (tấn/ha) 1,60 1,54 1,65 1,57 1,52 Sản lƣợng (triệu tấn) 38, 44 33,19 36, 98 37,65 36,46 ( Nguồn: FAOSTAT,. 33 Hình 3.2. Một số dòng lạc nghiên cứu và giống lạc L 18 ở thế hệ thứ Năm 34 Hình 3.3. Hình ảnh quả và hạt của các dòng lạc nghiên cứu và giống L 18 ở thế hệ thứ Sáu 39 Hình 3.4. Hoạt độ của α - amylase