2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu
Hạt lạc sau khi bóc vỏ gỗ đƣợc ngâm nƣớc 2 giờ, sau đó ủ ẩm bằng dung dịch sorbitol 7%. Hạt nảy mầm sau các khoảng thời gian ủ 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày đƣợc lấy để xác định hoạt độ của α – amylase, hàm lƣợng đƣờng khử, hoạt độ của protease, hàm lƣợng protein tan. Đối chứng là hạt lạc đƣợc ủ bằng nƣớc cất, không chứa sorbitol 7%.
2.2.4.2. Xác định hoạt độ của α - amylase
Sử dụng đệm photphat 0,2M (pH=6,8) để chiết α - amylase. Hoạt độ của enzyme đƣợc xác định thông qua lƣợng tinh bột bị thủy phân ở 30 oC trong 30 phút dựa vào đồ thị chuẩn tinh bột với giá trị OD đo ở bƣớc sóng 560nm [5].
Định tính hoạt độ của α - amylase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch với cơ chất là tinh bột 1%.
2.2.4.3. Xác định hàm lượng đường tan bằng phương pháp vi phân tích
Xác định hàm lƣợng đƣờng tan dựa trên nguyên tắc: Trong môi trƣờng kiềm, đƣờng khử kaliferixianua thành kaliferoxianua. Với sự có mặt của gelatin, kaliferoxianua kết hợp với sắt sunphat axit tạo thành phức chất màu xanh bền. Hỗn hợp thu đƣợc đo trên máy ở bƣớc sóng 585 nm [3].
2.2.4.4. Xác định hoạt độ của enzyme protease
Hoạt độ protease xác định bằng phƣơng pháp Anson cải tiến theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [13]. Sử dụng đệm photphat pH=6,5 để chiết protease. Xác định hoạt độ của enzyme trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo ra trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau. Hoạt độ enzyme đƣợc tính dựa trên đồ thị đƣờng chuẩn xây dựng bằng tyrozin với giá trị OD đo ở bƣớc sóng 750nm
Định tính hoạt độ của protease: Tiến hành tƣơng tự nhƣ định tính hoạt độ α- amylase, cơ chất là cazein 1%.
2.2.4.5. Xác định hàm lượng protein tan
Hàm lƣợng protein tan ở giai đoạn hạt nảy mầm đƣợc xác định nhƣ mô tả ở mục 2.2.3.2.