Cystatin là protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase. Các protein này có liên quan về cấu trúc và chức năng với cysteine proteinase [42]. Cystatin tồn tại trong vi sinh vật, động vật [27] và thực vật [52], [22]. Cystatin đƣợc mô tả lần đầu tiên ở lòng trắng trứng gà và sau đó đƣợc gọi là cystatin lòng trắng trứng [27].
Các cystatin mối liên quan về mặt tiến hóa và tạo thành “siêu họ cystatin”. Cystatin đƣợc chia thành bốn họ nhỏ là stefin, cystatin, kininogen và phytocystatin. Các họ này khác nhau về trình tự tƣơng đồng của các axit amin, số lƣợng liên kết disunfide và khối lƣợng phân tử của protein [24], [31], [41].
Cystatin họ 1, còn gọi là stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc nhóm carbonhydrate trong thành phần cấu tạo. Stefin có khối lƣợng phân tử khoảng 11kDa, gồm khoảng 100 gốc axit amin [31].
Cystatin họ 2, còn gọi là cystatin, chứa khoảng 120 - 126 axit amin, khối lƣợng phân tử khoảng 13,4 - 14,4 kDa. Cystatin họ 2 chứa 4 gốc cysteine đƣợc bảo tồn tạo thành hai liên kết disulfide và hầu hết không đƣợc glycosyl hóa [31].
Cystatin họ 3, còn gọi là kininogen, là họ cystatin lớn hơn so với hai họ còn lại, có khối lƣợng phân tử khoảng 60 - 120 kDa [45]. Kininogen gồm khoảng 355 axit amin, chứa các cầu nối disulfide và đƣợc glycosyl hóa. Kininogen có chức năng quan trọng trong quá trình đông máu [41].
Hầu hết các cystatin họ 1 và họ 3 đều chứa pentapeptide Gln-Val-Val-Ala- Gly và trình tự tƣơng đồng Gln-X-Val-Y-Gly ở các cystatin họ 2 [25]. Trình tự Phe- Ala-Val đƣợc định vị gần đầu C và dipeptide Pro-Trp ở gần đầu N, là trình tự bảo thủ của cystatin họ 2 nhƣng không tìm thấy ở cystatin họ 1 và họ 3. Vùng pentapeptide và dipeptide có vai trò quan trọng trong việc gắn kết với cysteine proteinase [45].
Cystatin họ 4 (còn gọi là phytocystatin) [45], [46] gồm hầu hết các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật [22], [40]. Phytocystatin có độ tƣơng đồng cao với các thành viên của họ cystatin, nhƣng không chứa cầu nối disulfide và các gốc cysteine giống stefin [48].
Phytocystatin đƣợc tìm thấy ở thực vật một lá mầm nhƣ lúa [22], ngô [40] và thực vật hai lá mầm nhƣ đậu tƣơng [64], cây dẻ [42]...
Phytocystatin là chất ức chế mạnh của cysteine proteinases (hay CPs proteinase) ở thực vật [39]. Cystatin đóng vai trò nhƣ cơ chất để xâm nhập vào trung tâm hoạt động của enzyme cysteine proteinase và ngăn chặn sự đi vào của các cơ chất protein khác. Về cấu trúc, phytocystatin là chất ức chế cạnh tranh thuộc họ
enzyme phân hủy (hay Cys protease). Phytocysatatin gồm có các vùng bảo thủ cao sau: gốc Gly ở gần đầu N, vùng trung tâm Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly (Xaa là axit amin bất kỳ) và cấu trúc kẹp tóc Pro-Trp bậc 2 gần đầu C [31]. Các vùng bảo thủ cao này
là vị trí tƣơng tác giữa phytocystatin và cysteine proteinase [24]. Ngoài ra, các phytocystatin chứa thêm so với cystatin động vật một trình tự bảo thủ [LVI]- [AGT]-[RKE]-[FY]-[AS]-[VI]-x-[HYFQ]-N ở đoạn xoắn alpha vùng đầu amino của chuỗi protein [24], [46]. Cystatin ở cây rau giền (còn gọi là AhCPI) chứa ba vùng tƣơng tác với cysteine proteinase gồm: gốc Gly47, vị trí phản ứng Gln90Val
91
Val 91Ala 93Gly 94 và gốc Trp121 thƣờng đƣợc tìm thấy dƣới dạng vòng kép. AhCPI
còn chứa trình tự bảo thủ đặc trƣng của phytocystatin là L63A 64R 65F 66A 67V 68 [44].
Cystatin đƣợc mã hóa bởi 1 họ gen tuy nhiên những hiểu biết về mối quan hệ của các thành viên trong họ gen này còn khá hạn chế. Sự biểu hiện của các gen này đƣợc giới hạn bởi các cơ quan đặc trƣng, các giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật: giai đoạn nảy mầm, quá trình rụng lá sớm, khô hạn hoặc các nhân tố bất lợi nhƣ lạnh và muối [31].
Hầu hết các phytocystatin là các protein nhỏ, trong khoảng kích thƣớc dao động từ 12 đến 85 kDa và không chứa liên kết disulphide [41]. Theo Marcia (2008) [38] và Martinez (2007) [39] dựa vào kích thƣớc phân tử chia phytocystatin thành 3 nhóm khác biệt: nhóm 1 và nhóm 2 có kích thƣớc 12 đến 16 kDa, không có cầu disunfide và vùng glycosilation giả định, gen mã hóa cũng không có intron hoặc có 1 intron ở đoạn giữa LARFAV và QxVxQ (x là axit amin bất kỳ). Nhóm thứ 3 có khối lƣợng phân tử cao hơn (23kDa) do đầu C mở rộng đƣợc chứng minh là có liên quan đến sự ức chế legumains và có 3 intron trong gen mã hóa [39], [40]. Ngoài ra, còn có các đa cystatin có kích thƣớc khoảng 80kDa, chứa 8 vùng cystatin cũng đã đƣợc tìm thấy [48].
Phytocystatin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng của tế bào, bao gồm quá trình phát sinh cơ quan; điều chỉnh quả trình phân giải protein trong giai đoạn tiềm sinh và nảy mầm của hạt; bảo vệ thực vật bằng cách ngăn ngừa hoạt
động của các protease ngoại sinh của côn trùng, giun tròn; sự già và chết theo chƣơng trình của tế bào [41].
Phytocystatin tham gia kiểm soát cysteine proteinase trong suốt quá trình chín và nảy mầm của hạt. Nhiều nghiên cứu về biểu hiện gen đã chỉ ra mối tƣơng
quan giữa việc sinh tổng hợp và tích trữ cystatin trong các cơ quan dự trữ và sự suy giảm hoạt động của các cysteine proteinase [31]. Ở cây lúa, Abe và đtg (1991) đã phát hiện có sự tích lũy của mRNA cystatin trong giai đoạn phát triển của hạt hai tuần sau khi nở hoa và một tuần trƣớc quá trình tạo glutelin. Oryzacystatin đƣợc xem là chất ức chế cysteine proteinase oryzain α, β, γ đƣợc sinh ra trong quá trình nảy mầm của hạt [22].
Phytocystatin còn đƣợc mô tả nhƣ là chất điều hòa cyssteine proteinase, có khả năng ức chế hoạt động phân giải protein nội sinh trong quá trình nảy mầm của hạt và sinh trƣởng của cây non [31], [33], [41]. Hwang và đtg (2009) đã phân lập đƣợc cDNA mã hóa cho phytocystatin của Arabidopsis thaliana (hay AtCYS6), có khối lƣợng phân tử 22,4 kDa và chứa đầu C kéo dài. Protein AtCYS6 tích lũy trong hạt, cây non và ở hoa và biểu hiện tăng cƣờng khi phản ứng với ABA (là phytohormone ức chế quá trình nảy mầm). Khi nghiên cứu biểu hiện của cây chuyển gen chứa cấu trúc AtCYS6 promoter-β-glucuronidase, nhóm tác giả nhận thấy AtCYS6 ức chế hoạt động của cysteine proteinases, ức chế hoạt động tích trữ của cysteine proteinase trong hạt. Qua đó, các tác giả đã đề xuất là biểu hiện của AtCYS6 đƣợc tăng cƣờng bởi ABA và ức chế hoạt động tích trữ cysteine proteinase nhằm kiểm soát tốc độ nảy mầm và phát triển của cây con bằng cách [33].
Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytocystatin còn tham gia vào quá trình đáp ứng lại các căng thẳng phi sinh học của môi trƣờng [40], [42], [44], [52]. Biểu hiện của phytocystatin thƣờng trong điều kiện hạn, lạnh, mặn và ở các pha riêng rẽ của các quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Pernas và đtg (2000) chỉ ra rằng cystatin của hạt dẻ biểu hiện mạnh trong rễ và lá non khi chịu tác động bất lợi của lạnh và muối và ở rễ khi chịu tác động của nhiệt độ cao [42]. Massonneau và đtg (2005) nghiên cứu gen cystatin ở ngô cho thấy biểu hiện của gen này trong đáp ứng với tác động của lạnh và hạn [40]. Gen cystatin ở
cây Arabidopsis biểu hiện tăng cƣờng trong phản ứng với tác động của muối và hạn hán, oxy hóa và tác động của lạnh, ánh sáng và bị tổn thƣơng [52]. Rodriguez và đtg (2007) phân tích biểu hiện của cystatin ở cây rau giền (còn gọi là AhCPI) cho thấy:
AhCPI biểu hiện chủ yếu ở hạt trƣởng thành và giảm dần trong quá trình nảy mầm. Trong mô sinh dƣỡng, AhCPI biểu hiện trong rễ mầm và trụ dƣới lá mầm của hạt nảy mầm, trong thân và rễ của cây con. Biểu hiện của AhCPI trong rễ và thân tăng dần trong đáp ứng với sự thiếu hụt nƣớc, tác động của mặn, lạnh và nóng. Nhiệt độ cao làm cho sản phẩm phiên mã của AhCPI đƣợc tích tụ nhanh chóng trong thời gian ngắn ở lá [44].
Nhƣ vậy, nghiên cứu gen cystatin và cysteine proteinase đã mở ra hƣớng nghiên cứu mới trong việc ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng sức chống chịu của cây trồng bằng cách tạo thực vật chuyển gen chứa gen cystatin, ức chế sự tích lũy proteinase trong cây.