2.2.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Sử dụng lá non của cây lạc để tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và đtg, 1991 có cải tiến [30]. Hóa chất sử dụng tách chiết DNA: Tris HCl 1M, pH=8,0; NaCl 5M; EDTA 0,5M; CTAB 4%; Isopropanol; Ethanol; Sorbitol 2M; Cloroform: isoamyl (24: 1); NaH2PO4 0,4%; nƣớc cất.
2.2.5.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số
DNA tổng số đƣợc định lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 1%.
2.2.5.3. Phương pháp nhân gen cystatin bằng kỹ thuật PCR
DNA tổng số thu đƣợc sử dụng để nhân gen cystatin bằng kỹ thuật PCR. Cặp mồi CysAra F/CysAra R đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotide gen cystatin do Yan và đtg công bố tại ngân hàng gen quốc tế với mã số AY723693 [57].
CysAra F 5’ATGGCAGCAGTGGGTGCA 3’ CysAra R 5’ TTAAGCATTGGAGCCATCAC 3’
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong hỗ hợp gồm: PCR Master mix 12,5μl; Mồi (10pmol/μl ) 2μl; DNA tổng số (50ng/μl ) 2μl; Nƣớc khử ion vừa đủ 25 μl. Hỗn hợp đƣợc thực hiện với 30 chu kỳ phản ứng, gồm các giai đoạn: 94oC/3 phút; 94oC/30 giây; 56oC/1 phút; 72oC/1 phút; 72oC/10 phút và lƣu giữ sản phẩm ở 4oC. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, sau đó tinh sạch (thôi gel) theo bộ kit AccuPrep PCR Purification của hãng Bioneer.
2.2.5.4. Phương pháp tách dòng gen
Tạo plasmid tái tổ hợp
Sản phâm PCR đã tinh sạch đƣơc găn vao vector pTZ 57R/T của hãng Invitrogen. (hình 2.2). Thành phần phản ứng gồm: Sản phẩm PCR 4 μl; Vector
pTZ57R/T 1μl; Đệm T4 2μl; T4 ligase 0,8μl; Nƣớc khử ion vừa đủ 25μl. Hỗn hợp trên đƣợc ủ ở 22oC trong 1 giờ.
Hình 2.2. Vector pTZ57R/T
Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α
Vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α. Các khuẩn lạc E. coli chứa vector tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng LB đặc chứa ampicillin và IPTG.
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng (Colony – PCR)
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng colony - PCR với dịch nuôi vi khuẩn, sử dụng cặp mồi CysAra F/CysAra R. Chu trình nhiệt của colony – PCR giống phản ứng PCR. Sản phẩm colony – PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1%.
Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp
Tách DNA plasmid tái tổ hợp bằng bộ kit tách plasmid của hãng BIONEER (AccuPrep™ Plasmid Mini Extraction Kit).
Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp
DNA plasmid tái tổ hợp sau khi đƣợc tách chiết, đƣợc cắt kiểm tra bằng 2 loại enzyme giới hạn: EcoRI và BamHI. Thành phần phản ứng cắt gồm: DNA plasmid 1μl; EcoRI 1μl; BamHI 1μl; Buffer 2μl; Nƣớc khử ion vừa đủ 15 μl. Ủ hỗn hợp sản phẩm trên ở 37oC trong 3 giờ. Sau đó kiểm tra sản phẩm cắt trên gel
2.2.5.5. Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy đọc tự động
Trình tự của gen cystatin đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyner (Applied Biosystem) sử dụng bộ hóa chất sinh chuẩn BigDye® Terminator v3.1 cycle sequencing với bộ mồi có gắn huỳnh quang