VÀ CÂY LẠC
Đặc tính chịu hạn của thực vật đƣợc hình thành trong quá trình tiến hóa dƣới tác động của chọn lọc tự nhiên. Nghiên cứu tính chịu hạn về mặt sinh lí, hóa sinh và cấu trúc tế bào nhận thấy hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở tất cả các mức độ khác nhau, trong các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển khác nhau. Điều này chứng tỏ tính chống chịu của thực vật là một hệ đa gen, nhiều gen quy định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây. Ngày nay, trên thực tế vẫn chƣa tìm đƣợc gen giữ vai trò chính quyết định tính chịu hạn, mà chỉ tìm thấy các gen liên quan đến đặc tính này [8], [11].
* Gen liên quan đến tăng cường áp suất thẩm thấu
LEA là loại protein đƣợc tổng hợp với số lƣợng lớn trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi và liên quan đến điều kiện mất nƣớc của tế bào. LEA điều chỉnh quá trình mất nƣớc sinh lý khi hạt chín, đồng thời hạn chế sự mất nƣớc bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra nhƣ nóng, lạnh, muối cao. Mức độ phiên mã của gen LEA đƣợc điều kiển bởi ABA, độ mất nƣớc của tế bào và áp suất thẩm thấu trong tế bào [43]. Ngày nay, nhiều gen LEA đã đƣợc nghiên cứu, phân lập, và xác định chức năng. Dramé và đtg (2007) đã phân lập mRNA của gen LEA trên cây lạc dài 556 nucleotide [29]. Hundertmark và đtg (2008) đã xác định đƣợc 51 gen mã hóa cho protein LEA từ hệ gen của cây Arabidopsis và đƣợc phân loại thành 9 nhóm riêng biệt. Bằng phƣơng pháp định lƣợng Real Time PCR, các tác giả đã tìm thấy bằng chứng về sự biểu hiện của cả 51 gen LEA này ở các giai đoạn phát triển của thực vật, trong các cơ quan và các tác nhân bất lợi, hormone. LEA phản ứng với ABA, nhiệt độ thấp, lạnh hoặc hạn [34].
hạn chế sự mất nƣớc và tăng khả năng giữ nƣớc của chất nguyên sinh. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của proline thể hiện ở khả năng giữ nƣớc và lấy nƣớc vào tế bào. Proline còn có khả năng thay thế nƣớc ở nơi xảy ra có phản ứng sinh hóa, khả
năng tƣơng tác với lipid và protein màng, ức chế sự phá hủy của các phức protein...[2], [11].
P5CS (pyrroline - 5 - carboxylase) là một trong những enzyme chức năng, tham gia vào quá trình tổng hợp proline. Proline đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong cơ thể thực vật. Gen P5CS biểu hiện mạnh mẽ làm tăng hàm lƣợng proline, có vai trò tăng cƣờng áp suất thẩm thấu của tế bào và cây trong điều kiện khô hạn. Gen mã hóa cho enzyme P5CS đã đƣợc nghiên cứu và tách dòng ở nhiều loại cây khác nhau. Nhiều dòng cây trồng đã đƣợc chuyển gen
P5CS nhằm tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh... [11].
* Gen liên quan đến khả năng bảo vệ thành tế bào
Gen LTP có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid qua màng. LTP xúc tác sự vận chuyển lipid qua màng tế bào, tham gia vào cấu tạo lớp sáp, lớp biểu bì, làm tăng độ dày của lớp màng tế bào, giúp thực vật có thể giảm mất nƣớc, phản ứng bảo vệ chống bệnh của cây và thích nghi với những biến đổi của môi trƣờng. Khi gặp điều kiện cực đoan của môi trƣờng, các nhân tố nhƣ hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đƣờng truyền tín hiệu… sẽ điều khiển gen LTP hoạt động, tổng hợp nên protein tƣơng ứng giúp cây tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác động của các nhân tố bất lợi của môi trƣờng [28], [32]. Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu và đtg (2003) nhận thấy rằng hàm lƣợng mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stress muối, stress hạn hay khi hàm lƣợng ABA ngoại bào tăng lên [37].
* Các gen liên quan đến chất bảo vệ tế bào: Môi giới phân tử, các protein sốc nhiệt (HSP).
HSP chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá và có ở hầu hết các loài thực vật. HSP đƣợc tổng hợp thêm trong điều kiện môi trƣờng cực đoan nhƣ hạn,
nhiệt độ cao, muối cao. Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy do stress nóng và mở rộng giá trị ngƣỡng chống chịu nhiệt độ cao [49]. Kumar và đtg (2007) đã phân lập đƣợc mRNA của gen mã hóa HSP ở cây lạc dài
450 bp. Đoạn mRNA này có kích thƣớc 17,3 kDa, và đƣợc công bố trên GenBank với mã số DQ294615.1 [58]. Đoạn mRNA của gen mã hóa protein sốc nhiệt đã đƣợc Bi và đtg (2008) phân lập thành công. Đoạn mRNA này đƣợc phân lập từ hạt lạc và có kích thƣớc 533 nucleotide (GenBank: mã số DQ889543) [59].
* Các gen mã hóa sản phẩm điều khiển quá trình phiên mã
Đây là các gen có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn thông qua việc bám vào đoạn DNA điều kiển (cis acting element) trên vùng khởi động (promoter) của gen và tƣơng tác với RNA polymerase, tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng...Có nhiều yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn của thực vật nhƣ: DREB, bZIP, MYB... Gen DREB (dehydration responsive elemen binding) ở cây lạc đã đƣợc tác giả Liu (2008) tách từ lá (GenBank: mã số FM955398) dài 687 nucleotide, mã hóa phân tử protein tƣơng ứng dài 221 amino acid [60].
Cystatin là một loại protein phổ biến trong cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật… Cystatin tham gia ức chế hoạt động của enzyme tham gia vào quá trình phân cắt phân tử protein là cysteine proteinase. Gần đây, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng cystatin có liên quan đến khả năng chống chịu của thực vật dƣới tác động bất lợi của các nhân tố môi trƣờng, giúp cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh [31], [41], [42], [52].
1.5. CYSTATIN VÀ GEN CYSTATIN Ở THỰC VẬT 1.5.1. Cysteine proteinase
Cysteine proteinase có vai trò thiết yếu trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật, sự già và chết theo chƣơng trình của tế bào, tích lũy và huy động protein dự trữ trong hạt, cung cấp đạm cho sự phát triển của cây non. Ngoài ra, cysteine proteinase còn liên quan đến khả năng chống chịu với những tác động bất
lợi của môi trƣờng [31], [41].
Cysteine proteinase là enzyme tham gia phân cắt chuỗi peptide ở vị trí bên trong mạch polypeptide (endopeptidyl hydrolase). Trung tâm hoạt động của cysteine proteinase có chữa nhóm SH (hay còn gọi là thiol, sunfuhydryl). Nhóm SH
có khả năng phản ứng cao, tham gia vào nhiều biến đổi hóa học quan trọng nhƣ ion hóa, oxyl hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, ankyl hóa... Nhóm SH có vai trò quan trọng đối với hoạt động của enzyme. Khi chức năng của nhóm SH bị khóa, hoạt động của enzyme sẽ bị ức chế [8], [31], [41].
Cysteine proteinase đƣợc kí hiệu với tiếp đầu ngữ C với hơn 40 họ và đƣợc xếp vào ít nhất là 6 họ chung. Hầu hết các cysteine proteinase thực vật thuộc họ papain (C1) và họ legumin (C13). Các thành viên khác của cysteine proteinase gồm: caspases (C14) và calpains (C2), ubiquitin C – terminal hydrolase (C12) và ubiquitin
– specific proteinase (C19) [31].
Ở động vật có xƣơng sống, cysteine proteinase liên quan đến hệ thống phân giải protein của lysosome và giữ vai trò ngoại bào trong một vài quá trình trao đổi chất. Ở động vật không xƣơng sống, cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa. Đối với động vật chân đốt, cysteine proteinase giữ vai trò tiêu hóa và liên quan đến hệ thần kinh [31], [41].
Ở thực vật, cysteine proteinase đƣợc tìm thấy chủ yếu trong không bào và thành tế bào, và vẫn chƣa rõ liệu cysteine proteinase trong lục lạp có liên quan đến quá trình thoái hóa protein trong lục lạp [31]. Lindhal (1995) chỉ ra rằng cysteine liên quan đến màng thylakoid chịu trách nhiệm cho sự phân hủy trung tâm phản ứng của hệ thống quang hóa II ở cây rau Bina [36]. Cysteine proteinase còn đƣợc tìm thấy trong môi trƣờng ngoại bào [41].
1.5.2. Cystatin chất ức chế cysteine proteinase
Cystatin là protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase. Các protein này có liên quan về cấu trúc và chức năng với cysteine proteinase [42]. Cystatin tồn tại trong vi sinh vật, động vật [27] và thực vật [52], [22]. Cystatin đƣợc mô tả lần đầu tiên ở lòng trắng trứng gà và sau đó đƣợc gọi là cystatin lòng trắng trứng [27].
Các cystatin mối liên quan về mặt tiến hóa và tạo thành “siêu họ cystatin”. Cystatin đƣợc chia thành bốn họ nhỏ là stefin, cystatin, kininogen và phytocystatin. Các họ này khác nhau về trình tự tƣơng đồng của các axit amin, số lƣợng liên kết disunfide và khối lƣợng phân tử của protein [24], [31], [41].
Cystatin họ 1, còn gọi là stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc nhóm carbonhydrate trong thành phần cấu tạo. Stefin có khối lƣợng phân tử khoảng 11kDa, gồm khoảng 100 gốc axit amin [31].
Cystatin họ 2, còn gọi là cystatin, chứa khoảng 120 - 126 axit amin, khối lƣợng phân tử khoảng 13,4 - 14,4 kDa. Cystatin họ 2 chứa 4 gốc cysteine đƣợc bảo tồn tạo thành hai liên kết disulfide và hầu hết không đƣợc glycosyl hóa [31]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cystatin họ 3, còn gọi là kininogen, là họ cystatin lớn hơn so với hai họ còn lại, có khối lƣợng phân tử khoảng 60 - 120 kDa [45]. Kininogen gồm khoảng 355 axit amin, chứa các cầu nối disulfide và đƣợc glycosyl hóa. Kininogen có chức năng quan trọng trong quá trình đông máu [41].
Hầu hết các cystatin họ 1 và họ 3 đều chứa pentapeptide Gln-Val-Val-Ala- Gly và trình tự tƣơng đồng Gln-X-Val-Y-Gly ở các cystatin họ 2 [25]. Trình tự Phe- Ala-Val đƣợc định vị gần đầu C và dipeptide Pro-Trp ở gần đầu N, là trình tự bảo thủ của cystatin họ 2 nhƣng không tìm thấy ở cystatin họ 1 và họ 3. Vùng pentapeptide và dipeptide có vai trò quan trọng trong việc gắn kết với cysteine proteinase [45].
Cystatin họ 4 (còn gọi là phytocystatin) [45], [46] gồm hầu hết các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật [22], [40]. Phytocystatin có độ tƣơng đồng cao với các thành viên của họ cystatin, nhƣng không chứa cầu nối disulfide và các gốc cysteine giống stefin [48].
Phytocystatin đƣợc tìm thấy ở thực vật một lá mầm nhƣ lúa [22], ngô [40] và thực vật hai lá mầm nhƣ đậu tƣơng [64], cây dẻ [42]...
Phytocystatin là chất ức chế mạnh của cysteine proteinases (hay CPs proteinase) ở thực vật [39]. Cystatin đóng vai trò nhƣ cơ chất để xâm nhập vào trung tâm hoạt động của enzyme cysteine proteinase và ngăn chặn sự đi vào của các cơ chất protein khác. Về cấu trúc, phytocystatin là chất ức chế cạnh tranh thuộc họ
enzyme phân hủy (hay Cys protease). Phytocysatatin gồm có các vùng bảo thủ cao sau: gốc Gly ở gần đầu N, vùng trung tâm Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly (Xaa là axit amin bất kỳ) và cấu trúc kẹp tóc Pro-Trp bậc 2 gần đầu C [31]. Các vùng bảo thủ cao này
là vị trí tƣơng tác giữa phytocystatin và cysteine proteinase [24]. Ngoài ra, các phytocystatin chứa thêm so với cystatin động vật một trình tự bảo thủ [LVI]- [AGT]-[RKE]-[FY]-[AS]-[VI]-x-[HYFQ]-N ở đoạn xoắn alpha vùng đầu amino của chuỗi protein [24], [46]. Cystatin ở cây rau giền (còn gọi là AhCPI) chứa ba vùng tƣơng tác với cysteine proteinase gồm: gốc Gly47, vị trí phản ứng Gln90Val
91
Val 91Ala 93Gly 94 và gốc Trp121 thƣờng đƣợc tìm thấy dƣới dạng vòng kép. AhCPI
còn chứa trình tự bảo thủ đặc trƣng của phytocystatin là L63A 64R 65F 66A 67V 68 [44].
Cystatin đƣợc mã hóa bởi 1 họ gen tuy nhiên những hiểu biết về mối quan hệ của các thành viên trong họ gen này còn khá hạn chế. Sự biểu hiện của các gen này đƣợc giới hạn bởi các cơ quan đặc trƣng, các giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật: giai đoạn nảy mầm, quá trình rụng lá sớm, khô hạn hoặc các nhân tố bất lợi nhƣ lạnh và muối [31].
Hầu hết các phytocystatin là các protein nhỏ, trong khoảng kích thƣớc dao động từ 12 đến 85 kDa và không chứa liên kết disulphide [41]. Theo Marcia (2008) [38] và Martinez (2007) [39] dựa vào kích thƣớc phân tử chia phytocystatin thành 3 nhóm khác biệt: nhóm 1 và nhóm 2 có kích thƣớc 12 đến 16 kDa, không có cầu disunfide và vùng glycosilation giả định, gen mã hóa cũng không có intron hoặc có 1 intron ở đoạn giữa LARFAV và QxVxQ (x là axit amin bất kỳ). Nhóm thứ 3 có khối lƣợng phân tử cao hơn (23kDa) do đầu C mở rộng đƣợc chứng minh là có liên quan đến sự ức chế legumains và có 3 intron trong gen mã hóa [39], [40]. Ngoài ra, còn có các đa cystatin có kích thƣớc khoảng 80kDa, chứa 8 vùng cystatin cũng đã đƣợc tìm thấy [48].
Phytocystatin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng của tế bào, bao gồm quá trình phát sinh cơ quan; điều chỉnh quả trình phân giải protein trong giai đoạn tiềm sinh và nảy mầm của hạt; bảo vệ thực vật bằng cách ngăn ngừa hoạt
động của các protease ngoại sinh của côn trùng, giun tròn; sự già và chết theo chƣơng trình của tế bào [41].
Phytocystatin tham gia kiểm soát cysteine proteinase trong suốt quá trình chín và nảy mầm của hạt. Nhiều nghiên cứu về biểu hiện gen đã chỉ ra mối tƣơng
quan giữa việc sinh tổng hợp và tích trữ cystatin trong các cơ quan dự trữ và sự suy giảm hoạt động của các cysteine proteinase [31]. Ở cây lúa, Abe và đtg (1991) đã phát hiện có sự tích lũy của mRNA cystatin trong giai đoạn phát triển của hạt hai tuần sau khi nở hoa và một tuần trƣớc quá trình tạo glutelin. Oryzacystatin đƣợc xem là chất ức chế cysteine proteinase oryzain α, β, γ đƣợc sinh ra trong quá trình nảy mầm của hạt [22].
Phytocystatin còn đƣợc mô tả nhƣ là chất điều hòa cyssteine proteinase, có khả năng ức chế hoạt động phân giải protein nội sinh trong quá trình nảy mầm của hạt và sinh trƣởng của cây non [31], [33], [41]. Hwang và đtg (2009) đã phân lập đƣợc cDNA mã hóa cho phytocystatin của Arabidopsis thaliana (hay AtCYS6), có khối lƣợng phân tử 22,4 kDa và chứa đầu C kéo dài. Protein AtCYS6 tích lũy trong hạt, cây non và ở hoa và biểu hiện tăng cƣờng khi phản ứng với ABA (là phytohormone ức chế quá trình nảy mầm). Khi nghiên cứu biểu hiện của cây chuyển gen chứa cấu trúc AtCYS6 promoter-β-glucuronidase, nhóm tác giả nhận thấy AtCYS6 ức chế hoạt động của cysteine proteinases, ức chế hoạt động tích trữ của cysteine proteinase trong hạt. Qua đó, các tác giả đã đề xuất là biểu hiện của AtCYS6 đƣợc tăng cƣờng bởi ABA và ức chế hoạt động tích trữ cysteine proteinase nhằm kiểm soát tốc độ nảy mầm và phát triển của cây con bằng cách [33].
Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytocystatin còn tham gia vào quá trình đáp ứng lại các căng thẳng phi sinh học của môi trƣờng [40], [42], [44], [52]. Biểu hiện của phytocystatin thƣờng trong điều kiện hạn, lạnh, mặn và ở các pha riêng rẽ của các quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Pernas và đtg (2000) chỉ ra rằng cystatin của hạt dẻ biểu hiện mạnh trong rễ và lá non khi chịu tác động bất lợi của lạnh và muối và ở rễ khi chịu tác động của nhiệt độ cao [42]. Massonneau và đtg (2005) nghiên cứu gen cystatin ở ngô cho thấy biểu hiện của gen này trong đáp ứng với tác động của lạnh và hạn [40]. Gen cystatin ở
cây Arabidopsis biểu hiện tăng cƣờng trong phản ứng với tác động của muối và hạn hán, oxy hóa và tác động của lạnh, ánh sáng và bị tổn thƣơng [52]. Rodriguez và đtg (2007) phân tích biểu hiện của cystatin ở cây rau giền (còn gọi là AhCPI) cho thấy:
AhCPI biểu hiện chủ yếu ở hạt trƣởng thành và giảm dần trong quá trình nảy mầm. Trong mô sinh dƣỡng, AhCPI biểu hiện trong rễ mầm và trụ dƣới lá mầm của hạt nảy mầm, trong thân và rễ của cây con. Biểu hiện của AhCPI trong rễ và thân tăng dần trong đáp ứng với sự thiếu hụt nƣớc, tác động của mặn, lạnh và nóng. Nhiệt độ cao làm cho sản phẩm phiên mã của AhCPI đƣợc tích tụ nhanh chóng trong thời gian ngắn ở lá [44].
Nhƣ vậy, nghiên cứu gen cystatin và cysteine proteinase đã mở ra hƣớng nghiên cứu mới trong việc ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng sức chống chịu của cây trồng bằng cách tạo thực vật chuyển gen chứa gen cystatin, ức chế sự tích lũy proteinase trong cây.
1.5.3. Gen mã hóa cystatin ở thực vật và cây lạc
Hiện nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về phân lập, biểu hiện gen cystatin ở nhiều loài cây trồng khác nhau.
Cystatin có nguồn gốc thực vật đƣợc phát hiện đầu tiên ở lúa gạo (Oryza