Gen cystatin phân lập đƣợc có sự thay đổi vị trí nucleotide ở exon là lý do để chúng tôi tiến hành so sánh trình tự amino acid của protein cystatin của dòng RM5.46 và R5.44 với 4 trình tự amino acid đã công bố trên GenBank, kết quả thể hiện ở hình 3.13. 10 20 30 ---+---+---+- RM46 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H R44 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H AY722693 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H FR745399 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D D T FN811133 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H FR691053 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H 40 50 60 ---+---+---+- RM46 N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L R44 N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L AY722693 N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L FR745399 T R N R N A L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L FN811133 N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L FR691053 N K K Q N A L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L 70 80 90 ---+---+---+- RM46 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K R44 E A A R G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K AY722693 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K FR745399 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K FN811133 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K FR691053 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K --- RM46 L A G D G S N A R44 L A G D G S N A AY722693 L A G D G S N A FR745399 L A G D G S N A FN811133 L A G D G S N A FR691053 L A G D G S N A
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid của gen cystatin ở dòng lạc R5.44 và RM5.46 với ba trình tự gen cystatin lạc công bố trên Genbank
Vùng mã hóa cho protein của gen cystatin ở lạc dài 297 nucleotide, mã hóa phân tử protein tƣơng ứng gồm 98 amino acid, có 2 vùng bảo thủ là L22A23R24F25A26V27 và Q49V50V51A52G53. Đoạn intron gồm 164 nucleotide trong gen nằm giữa 2 vùng bảo thủ và là đoạn nối của trình tự amino acid glutamine34 (Gln34) và asparagin35 (Asn35).
Dòng RM5.46 có hai vị trí nucleotide sai khác nằm trong exon nhƣng không làm sai khác trình tự amino acid. Dòng R5.44 có 1 sai khác amino acid ở vị trí 64 (Serine64 đƣợc thay bằng Arginine64), tuy nhiên chƣa tìm thấy mối liên hệ nào của sự sai khác về amino acid với khả năng chịu hạn.
Đối chiếu với kết quả công bố của các tác giả Marcia và đtg (2008) [38], Martinez và đtg (2008) [39], chúng tôi đã xác định gen cystatin phân lập đƣợc từ dòng RM5.46 và R5.44 thuộc nhóm I trong phân họ cystatin thực vật (hay phytocystatin).
Tuy có sự sai khác về trình tự nucleotide mã hóa chuỗi amino acid, nhƣng trình tự amino acid của dòng lạc RM5.46 không có sự sai khác so với giống lạc L18 và AY722693. Hai dòng lạc RM5.46 và R5.44 có 8 vị trí amino acid sai khác với dòng RM48 (ở các vị trí 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36) và 1 vị trí sai khác với giống L23 (vị trí 36). Trình tự amino acid do gen cystatin của dòng lạc R5.44 mã hóa có 1 amino acid sai khác so với 4 trình tự còn lại ở vị trí 64. Đây là kết quả của sự thay thế
1 nucleotide (T thay bằng C ở vị trí 195) dẫn đến sự thay đổi 1 amino acid (serine64 đƣợc thay bằng arginine64). Sự thay đổi amino acid do sự thay thế T thay bằng C ở trình tự nucleotide của gen mã hóa cystatin của dòng R5.44 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu thổi khô có thể do trong quá trình nuôi cấy mô sẹo đã xảy ra đột biến điểm, làm thay thế 1 nucleotide. Dòng lạc R5.44 đƣợc đánh giá là dòng lạc có khả năng chịu hạn kém so với 2 dòng RM5.46 và RM48, vậy phải chăng có sự liên quan đến sự thay thế amino acid ở dòng lạc này. Tuy nhiên, tính chịu hạn là tính trạng liên quan đến nhiều gen trong đó có gen cystatin cho nên cần có những nghiên cứu
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1.1. Các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm và thứ Sáu có hệ số biến động di truyền về các chỉ tiêu nghiên cứu thấp và ổn định so với giống gốc. Kết quả nghiên cứu thu đƣợc một số dòng có triển vọng: Dòng RM5.46 có khối lƣợng
100 quả, 100 hạt lớn. Dòng R5.44 và R5.46 có tỷ lệ nhân cao.
1.2. Hàm lƣợng lipid dao động từ 34,95% đến 39,10%. Dòng lạc có hàm lƣợng lipid cao nhất là RM5.48 (39,10%). Hàm lƣợng protein dao động từ 26,25% đến
38,11%. Dòng RM5.47 có hàm lƣợng protein cao nhất (38,11%).
1.3. Hàm lƣợng đƣờng tan và hoạt độ của α - amylase, hàm lƣợng protein và hoạt độ của protease của các dòng lạc ở giai đoạn nảy mầm có mối tƣơng quan thuận chặt chẽ, liên quan đến khả năng chịu hạn của từng dòng.
1.4. Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học, chất lƣợng hạt và năng suất. khả năng chịu hạn, kết quả đã tuyển chọn đƣợc một số dòng lạc ƣu việt: Dòng RM46 có khối lƣợng 100 quả, 100 hạt cao. Dòng RM5.48 có hàm lƣợng lipid cao. Dòng RM5.47 có hàm lƣợng protein cao. Dòng có khả năng chịu hạn cao là RM5.48. 1.5.Tách dòng và xác định trình tự gen cystatin của hai dòng lạc RM5.46 và R5.44.
Gen cystatin của hai dòng lạc có kích thƣớc 461 nucleotide, chứa 2 exon và 1 intron. Đoạn mã hóa của gen cystatin cây lạc dài 297 nucleotide, mã hóa cho chuỗi polypeptide dài 98 amino acid. Dòng R5.44 có sự thay thế amino acid của cystatin so với giống gốc ở vị trí 64 (Serine64 đƣợc thay bằng Arginine64).
2. ĐỀ NGHỊ
1.1. Tiếp tục đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lạc ở các giai đoạn phát triển khác nhau để khẳng định hiệu quả của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong chọn dòng lạc ở cây lạc.
1.2. Thiết kế vector chứa gen cystatin để chuyển vào cây lạc và các cây trồng khác để nghiên cứu ảnh hƣởng của gen đến khả năng chống chịu của cây lạc.
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Phạm Tuấn Oanh, Vũ Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu
(2011), Sự sai khác về trình tự nucleotide trong gen cystatin ở một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo của giống lạc L18, Tạp chí Khoa học&Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 85(09)/1: 133-141.
2. Chu. M. H., Vu. T. T. T., Pham. O. T., Hoang. M. V., (2011), Arachis hypogaea
cst gene for cystatin, cultivar L18, isolated from irradiated and dehydrated peanut line.GenBank, Accessi o n : HE575221.1.
3. Chu. M. H., Vu. T. T. T., Pham. O. T., Hoang. M. V., (2011), Arachis hypogaea cst gene for cystatin, cultivar L18, isolated from dehydrated peanut line, GenBank, Accessi o n : HE575222.1.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Trần Thị Ân (2006), "Tuyển chọn các giống lạc có năng suất, phẩm chất cao thích hợp cho vùng đất cát biển Thanh Hóa", Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, kỳ 1, tháng 1/2006: 61-68.
2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở lúa, Nxb Đại học Quốc Gia Hà Nội: 1 – 57, 154-165.
3. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hóa sinh học, Nxb Giáo Dục: 54-55.
4. Đƣờng Hồng Dật (2007), Cây lạc và biện pháp thâm canh nâng cao hiệu quả sản xuất, Nxb Thanh Hóa: 5-80.
5. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tập 3: 134-139. 6. Đinh Thị Vĩnh Hà, Nguyễn Văn Mã (2008), ''Sự biến đổi hoạt độ enzim
protease, lipase, amylase của hạt đậu tƣơng nảy mầm trong điều kiện thiếu nƣớc'', Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 46(6): 51-58.
7. Vũ Công Hậu, Ngô Thế Dân, Trần Thị Dung (1994), Cây lạc, Nxb Nông nghiệp Hà Nội: 7- 76.
8. Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
9. Trần Thị Phƣơng Liên, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (2005), ''Amylaza trong hạt của một số giống đậu tƣơng chịu nóng và một số giống đậu tƣơng chịu hạn'', Tạp chí Sinh học, 27(1): 58-63.
Nguyễn Xuân Thu, Phạm Thị Thủy, Vũ Thị Ngọc Phƣợng (2009), "Đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống lạc 2008", Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 7: 67-72.
11. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong chọn giống cây trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên.
12. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Thu Trang, (2008), So sánh trình tự gien cystatin ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L,) Wilczek), Tạp chí Sinh học, 30(3): 121-128.
13. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa học và Kỹ Thuật. 14. Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2004), "Kết quả tạo giống lúa
DR3 bằng kỹ thuật chọn dòng biến dị soma", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 42(5): 27-33.
15. Nguyễn Thị Tâm, Võ Văn Ngọc (2009), "Đặc điểm hóa sinh của một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R4 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc, Báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc: 340-343.
16. Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thị Thu Ngà (2007) " Ảnh hƣởng của hạn sinh lý đến một số chỉ tiêu sinh hóa ở giai đoạn hạt nảy mầm của một số giống lạc",
Tạp chí Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, (6): 34-39.
17. Trần Minh Tâm (2006), Bảo quản và chế biến nông sản sau thu hoạch, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội: 289 - 291.
18. Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây lạc, Nxb Lao Động, Hà Nội: 7-43, 105-112.
19. Tạ Quốc Tuấn, Trần Văn Lợt ( 2006), Cây đậu phộng, kỹ thuật trồng và thâm canh, Nxb Nông Nghiệp, TP, Hồ Chí Minh: 7-53.
20. Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), "Chọn lọc dòng biến dị chịu mất nƣớc và chiếu xạ ở cây lạc",
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 93: 349-356.
21. Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), "Nghiên cứu đặc điểm trình tự gien cystatin của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ và xử lý mất nƣớc", Tạp chí Sinh học, 33(1): 86-95.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
22. Abe K., Emori Y., Kondo H., Suzuki K., Arai K., (1987), "Molecular cloning of a cysteine proteinase inhibitor of rice (oryzacystatin), Homology with animal cystatin and transient expression in ripening process of rice seeds", J Biol Chem, 262,35: 16793-16797,
23. Adkins S. M., Shiraishi T., Kunavuvatchaidach R., Godwin I. D. (1995), "Somaclonal variation in rice drought – tolerance and other agronomic characters", Aust J Bot, 4: 201-209.
24. Barrett A. J. (1987), "The Cystatins; a new class of peptidase inhibitors", Trend Biochem Sci, 12: 318-326.
25. Barett A. J., Rawlings N. D., Davies M. E., Machleidt W., Salvesen G., Turk V. (1986), Cystein proteinnase inhibitor of the cystatin superfamily, in: AJ Barett, G, Salvesen (Eds), Proteinase inhibitor. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands: 519-569.
26. Bond J. S, Butlern P. E, (1987), "Intracellular proteases", Ann Rev Biochem., 56: 333-364.
27. Colella R., Sakaguchi Y., Nagase H., Bird J. W. C. (1989), "Chicken egg white cystatin", J Biol Chem, 264: 17164 – 17169.
28. Douliez J. P., Michon T., Elmorjani K., Marion D. (2000), "Structure, biological and technological functions of lipid transfer proteins and indolines, the major lipid binding proteins from Cereal Kernels", J Cereal Sci, 32(1): 1-20. 29. Dramé K. N., Clavel D., Repellin A., Passaquet C., Zuily-Fodil Y. (2007),
"Water deficit induces variation in expression of stress-responsive genes in two peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars with different tolerance to drought",
Plant Physiol Biochem, 45(3-4):236-243.
30. Gawel N. J, Jarret R. L. (1991), Genomic DNA isolation, http: //www.wei h enst e pha n . de/ p b p z / ba m bra/ht m l/ d na . ht m n.
31. Grudkowska M., Zagdanska B. (2004), "Multifunctional role of plant cysteine proteinases", Acta Biochim Pol, 51(3): 609-624.
32. Guerbette F., Grosbois M., Jolliot C. A. , Kader J. C., Zachowski A. (1999), "Lipid-transfer proteins from plants: Structure and binding properties", Mol Cell Biochem, 192: 157-161.
33. Hwang J. E., Hong J. K., Je J. H., Lee K. O., Kim D. Y., Lee S. Y., Lim C. O. (2009), "Regulation of seed germination and seedling growth by an Arabidopsis
phytocystatin isoform, AtCYS6", Plant Cell Rep, 28: 1623–1632.
34. Hundertmark M., Hincha D. K. (2008), "LEA ( Late Embryogenesis Abundant) protein and their encoding genes in Arabidopsis thaliana", BMC Genomics, 9(118).
35. Ismail C (2005), "The role of potassium in alleviating detrimental effects of abiotic stresses in plants", J Plant Nutr Soil Sci, 168: 521-530.
36. Lindhal M., Yang D. H., Andersson B. (1995), "Regulatory proteolysis of the major light-harvesting chlorophyll a/b protein of photosystem II by a light- induced membrane-associated enzymatic system", Eur J Biochem, 231: 503–509. 37. Liu K. H., Lin T. Y. (2003), "Cloning and characterization of two novel lipid
transfer protein I genes in Vigna radiate", DNA seq, 14(6): 420-426.
38. Marcia M. P., Andreia C. T. Z., Quilherme L., Giancarlo P., Rogerio M. (2008), "Molecular evolution and diversification of plant cysteine proteinase inhibitors: New insights after the poplar genome", Mol Phylogenet Evol, 49(1): 349-355. 39. Martinez M., Diaz-Mendoza M., Carrillo L., Diaz I. (2007), "Cacboxyl terminal
extended phytocystatins are bifunctional inhibitors of papain and legumain cystein proteinase", FEBS Lett, 581: 2914-2918.
40. Massonneau A., Condamine P., Wisniewski J. P., Zivy M., Rogowsky P. M. (2005) "Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought", Biochim Biophys Acta, 1729: 186-199.
41. Oliveira A, S., Xarvier – Fihlo J., Sales M. P. (2003),"Cysteine proteinases and cystatins", Braz Arch Biol Technol , 46 (1): 91 – 104.
42. Pernas M., R, Sanchez-Mong G., Salcedo (2000), "Biotic and abiotic stress can induce cystatin expression in chestnut", FEBS Lett, 467: 206– 210.
43. Raesh S., Manickam A., (2006), "Predictiion of functions of two LEA proteins from mungbean", Bioinformation, 1(4): 133-138.
44. Rodriguez V. S., Rangel G. A., Villagomez M. C., Lopez C. A., Vargas D. F., Martinez G. N., Hernandez C., Delano-Frier J. (2007), "Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus)
showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress", Plant Physiol, Biochem, 45(10-11): 790-798.
45. Turk B., Turk V., Turk D, (1997), "Structural and functional aspects of papain like cysteine proteinases and their protein inhibitors", Biol Chem, 378(3-4): 141-150.
46. Turk V., Bode W., (1991), "The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases", FEBS Lett, 285(2): 213-219.
47. Turner N., C., (1979), Drought resistance and adaptation to water deficits in crop plants, In: Stress Physiology in crop plants, Musell H., Staples R. C. (eds.),