Hiện nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về phân lập, biểu hiện gen cystatin ở nhiều loài cây trồng khác nhau.
Cystatin có nguồn gốc thực vật đƣợc phát hiện đầu tiên ở lúa gạo (Oryza sativa Japonica Group) là Oryzacystatin [22]. Abe và đtg (1987) đã phân lập đƣợc đoạn cDNA mã hoá cho oryzacystatin gồm có 598 cặp base. Gen quy định oryzacystatin phiên mã chuỗi mRNA dài 700 nucleotide, mã hóa cho 102 axit amin. Oryzacystatin có mối quan hệ về mặt cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng. Do không có liên kết disulfide, chuỗi pentapeptide đƣợc tạo thành vởi Gln- Val-Val-Ala-Gly (gốc 71-61), khối lƣợng phân tử khoảng 11,5 kDa với 102 gốc axit amin, nên oryzacystatin đƣợc xếp vào cystatin nhóm 1. Tuy nhiên, trình tự của oryzacystatin giống 30% so với cystatin họ 2, chúng chứa vùng bảo thủ Phe-Ala- Val (gốc thứ 29-31) và Pro-Trp-Met (gốc thứ 83-85), nên oryzacystatin cũng có thế xếp vào cystatin nhóm 2 [22].
Misaka và đtg (1996) đã phân lập thành công cDNA của gen mã hóa cystatin từ cây đậu tƣơng (Glycine max). Đoạn cDNA này đƣợc công bố trên GenBank
với mã số BAA19608, có kích thƣớc 1175 nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide dài
245 axit amin [64].
CeCPI) từ thân cây khoai sọ (Colocasia esculenta). Đoạn cDNA này dài 1008 bp, mã hóa chuỗi polypeptide dài 206 amino acid với kích thƣớc 29 kDa. Trình tự này chứa motif bảo thủ Gln-Val-Val-Ser-Gly của chất ức chế cysteine proteinase và trình tự tƣơng đồng LARFAV của phytocystatin. Tarocystatin thuộc nhóm 2 của phân họ cystatin thực vật [51].
Rodriguez và đtg (2007), phân lập thành công cDNA mã hóa cho cystatin (còn gọi là AhCPI) từ hạt non cây rau giền (Armanthus hypochondriacus). Đoạn cDNA dài 1016 bp, khung đọc mở dài 741 nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide dài 247 axit amin. AhCPI bao gồm 1 peptide tín hiệu N-terminal, vùng Gly, motif PW (Pro-Trp) có tính bảo thủ, trình tự LARFAV của phytocystatin và vị trí phản ứng Gln-Val-Val-Ala-Gly. Trình tự axit amin đƣợc giả định của AhCPI có tính tƣơng đồng với các cystatin ở các thực vật khác [44].
Chu Hoàng Mậu và đtg (2008) phân lập đƣợc gen cystatin ở cây đậu xanh
Vigna radiata L. Wilzek từ DNA hệ gen dài 1115 nucleotide, gồm 2 exon và 1 intron, đoạn mã hoá dài 267 nucleotit mã hoá chuỗi polipeptide dài 88 axit amin. Tác giả đã không tìm thấy đƣợc sự sai khác khi so sánh gen cystatin đậu xanh phân lập đƣợc với các trình tự công bố trên GenBank [12].
Gen cystatin cây lạc (Arachis hypogaea L.) đƣợc Yan và đtg (2004) phân lập từ mRNA và công bố trên GenBank với mã số mã số AY722693 [58]. Năm 2009, 2011, Vũ Thị Thu Thủy và đtg đã phân lập thành công gen cystatin của giống lạc L18 (GenBank, mã số FN811133) [61] và L23 (GenBank, mã số FR691053.1) [63]. Gen cystatin lạc có kích thƣớc 461 bp, gồm 2 exon và 1 intron, đoạn mã hóa dài 297 nucleotide, mã hóa cho phân tử protein dài 98 axit amin [21].
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu thực vật
Trên cơ sở chọn dòng chịu hạn của giống lạc L18, chúng tôi tiếp tục theo dõi, đánh giá một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu. Sử dụng hạt của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Tƣ có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc và xử lý chiếu xạ kết hợp gây mất nƣớc của giống lạc L18, trong đó:
- Giống lạc L18 (đối chứng) có nguồn gốc từ Trung Quốc, do Trung tâm Nghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện Cây lƣơng thực và cây thực phẩm thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. L18 là giống lạc chịu thâm canh cao, có khả năng kháng sâu cao, kháng bệnh hại lá, kháng bệnh héo xanh vi khuẩn trung bình và khả năng chịu hạn kém.
- 4 dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ 2Krad kết hợp với xử lý gây mất nƣớc liên tục trong 9 giờ: thế hệ thứ Năm - kí hiệu: RM5.46; RM5.47; RM5- .48; RM5.49; thế hệ thứ Sáu - kí hiệu RM6.46; RM6.47; RM6.48; RM6.49
- 3 dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý gây mất nƣớc liên tục trong 9 giờ: thế hệ thứ Năm - kí hiệu: R5.44; R5.46; R5.48; thế hệ thứ Sáu - kí hiệu R6.44; R6.46; R6.48.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
- Sử dụng các hóa chất của các hãng có uy tín: P etroleum ether, gelatin, sunfosalycilic axit, Tris hydrochloride (Tris HCl), CTAB, ETDA, Cloroform, Isoamyl, Agarose, X-gal (hãng Sigma và Difco, Mỹ).
- PCR master mix; Cặp mồi CysAra F/CysAra R tổng hợp tại hãng DNA anpha; Bộ kit thôi gel và bộ kit tách plasmid (hãng Bioneer); Các enzyme giới hạn
2.1.2.2. Thiết bị
Máy li tâm (Eppendorf, Đức); Pipette (Thermo Labsystem, Phần Lan); Máy quang phổ Biomate3 (Thermo Scientific, Mỹ); Máy PCR Amplied Biosystems (USA/Singapore); Máy DNA sequencing ABI Prism 3130 (USA/Japan)...
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Các chỉ tiêu nông sinh học và năng suất đƣợc thực hiện tổ Rừng Vầu, phƣờng Quang Vinh, thành phố Thái Nguyên.
- Các chỉ tiêu hóa sinh và sinh học phân tử đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh, phòng thí nghiệm Di truyền - Khoa Sinh – KTNN thuộc Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên; Bộ môn Sinh học phân tử thuộc Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái nguyên; Xác định trình tự gen cystatin tại Viện Công nghệ Sinh học.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU