đánh giá một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống l23, l18, md7 và md9

đánh giá một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống l23, l18, md7 và md9

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Tâm

Thái Nguyên - 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học và nghiên cứu đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn động viên và ủng hộ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tác giả

Đinh Tiến Dũng

MỤC LỤC

Trang

Mở đầu……… 1

Chương 1 Tổng quan tài liệu……… 3

1.1 Giới thiệu về cây lạc……… 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, phân bố và đặc điểm sinh học cây lạc ……… 3

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây lạc……… 4

1.1.3 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam……… 5

1.2 Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật……… 7

1.2.1 Khái niệm về hạn và ảnh hưởng của hạn tới thực vật ……… 7

1.2.2 Tác động của hạn đối với cây lạc… ………… 8

1.2.3 Cơ sở sinh lý, sinh hoá và di truyền của tính chịu hạn ở cây lạc……… 9

1.2.3.1 Cơ sở sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn……… 9

1.2.3.2 Cơ sở phân tử của tính chịu hạn……… 10

1.2.4 Ứng dụng của công nghệ tế bào thực vật trong đánh giá và chọn dòng chịu hạn ở lạc ……… 12

1.3 Kĩ thuật RAPD trong phân tích hệ gen thực vật 13

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu ……… 18

2.1.1 Vật liệu thực vật……… 18

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông học các dòng chọn lọc 19

2.2.2 Phương pháp đánh giá chất lượng hạt ……… 20

2.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn …… 22

2.2.3.1 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm 22

2.2.3.2 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phương pháp gây hạn nhân tạo ……… 24

2.2.4 2.2.4 Phương pháp đánh giá sự thay đổi ADN genome……… 25

2.2.5 Xử lý số liệu và tính toán kết quả………… ……… 27

Chương 3 Kết quả và thảo luận

3.1.1 Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc thế hệ R2 29 3.1.2 Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc thế hệ R3 37 3.1.3 Nhận xét về đặc điểm nông học và kết quả chọn lọc ngoài đồng ruộng 41

R4 49 3.3.1.1 Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ α – amylase trong giai đoạn hạt

nảy mầm………

49 3.3.1.2 Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hàm lượng đường tan trong giai đoạn hạt

3.3.1.3 Mối tương quan giữa hoạt độ α-amylase và hàm lượng đường tan……… 55 3.3.1.4 Nhận xét về khả năng chịu hạn của các dòng lạc và giống gốc trong điều

kiện hạn sinh lý ở giai đoạn hạt nảy mầm……… 56

3.3.2.5 Mối tương quan giữa hàm lượng proline và chỉ số chịu hạn……… 66

3.3.2.6 Nhận xét về khả năng chịu hạn của các dòng lạc và giống gốc ở giai

đoạn cây non ……… 67

3.4 Đánh giá sự thay đổi ADN genome một số dòng chọn lọc bằng kĩ thuật RAPD ……….……… 69

3.4.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số……… 69

3.4.2 Phân tích đa hình ADN bằng kĩ thuật RAPD……… 70

3.4.3 So sánh sự khác nhau của các dòng chọn lọc và giống gốc ở mức độ phân tử……… 73

3.4.4 Nhận xét về đa hình RAPD……… 75

Kết luận……… …… 76

Công trình đã công bố liên quan đến luận văn………… ……… 77

Tài liệu tham khảo ……… 78

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc trên thế giới từ năm 2000-2008 6

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc ở Việt Nam từ 2000 – 2008 7

Bảng 2.1 Các dòng chọn lọc ở thế hệ R3 và giống gốc ……… 18

Bảng 2.2 Thành phần hóa chất trong phân tích hàm lượng - amylase ……… 23

Bảng 2.3 Trình tự 5 mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD……… 27

Bảng 3.1 Đặc điểm nông học của các dòng lạc R2 30

Bảng 3.2 Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất ở các dòng thế hệ R2 32

Bảng 3.3 Giá trị Tα, Ttn của các đặc điểm nông học thế hệ R2 35

Bảng 3.4 Đặc điểm nông học của các dòng lạc thế hệ R3 37

Bảng 3.5 Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất của của các dòng thế hệ R3………. 39

Bảng 3.6 Giá trị Tα, Ttn của các đặc điểm nông học thế hệ R3 40

Bảng 3.7 Một số chỉ tiêu hóa sinh trong hạt các dòng thế hệ R3 44

Bảng 3.8 Hàm lượng amino acid liên kết trong hạt của một số dòng chọn lọc và giống gốc thế hệ R3……… 45

Bảng 3.9 Hàm lượng amino acid liên kết trong protein hạt của một số dòngchọn lọc thế hệ R3 và giống gốc 47

Bảng 3.10 Thành phần và hàm lượng các amino acid không thay thế trong hạt của các dòng lạc 47

Bảng 3.11 Hoạt độ của -amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 10% 50 Bảng 3.12 Hàm lượng đường tan trong giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 10% 52

Bảng 3.13 Tương quan giữa hoạt độ của α-amylase và hàm lượng đường ở giai đoạn hạt nảy mầm ……… 55

Bảng 3.14 Khối lượng tươi, khô của thân lá cây non 3 lá sau khi xử lý hạn………… 57

Bảng 3.15 Khối lượng tươi, khô của rễ cây non 3 lá sau khi xử lý hạn……… 58

Bảng 3.16 Chiều dài rễ của các dòng lạc ở giai đoạn cây non thế hệ R4 ……… 60

Bảng 3.17 Tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước và chỉ số chịu hạn tương đối của các giống lạc ở giai đoạn cây non thế hệ R4……… 62

Bảng 3.18 Khả năng phục hồi của các dòng lạc chọn lọc sau khi gây hạn nhân tạo… 64

Bảng 3.19 Hàm lượng prolin của thân lá của các dòng lạc ở giai đoạn cây non các

Bảng 3.20 Tương quan giữa chỉ số chịu hạn và hàm lượng proline……… 67 Bảng 3.12 Hàm lượng và độ tinh sạch của ADN tổng số tách từ các dòng chọn lọc… 70 Bảng 3.22 Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD

với 5 mồi ngẫu nhiên………

70 Bảng 3.23 Tỷ lệ phần trăm phân đoạn đa hình khi sử dụng 5 mồi RAPD……… 71 Bảng 3.24 Hệ số sai khác di truyền của 3 dòng lạc giống L23 và giống gốc ……… 74

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Một số hình ảnh dòng R2.9 và giống gốc ……… 36 Hình 3.2 Một số hình ảnh dòng chọn lọc thế hệ R3……… 42 Hình 3.3 Sắc kí đồ amino acid của dòng R3.26 (giống MD7)……… 46 Hình 3.4 Biểu đồ hàm lượng amino acid không thay thế của các dòng lạc

nghiên cứu với giống gốc……… ……… 48 Hình 3.5 Sự biến động hoạt độ α-amylase của các dòng lạc thế hệ R4 có

nguồn gốc mô sẹo chịu mất nước giống MD7……… 52 Hình 3.6 Biểu đồ sự biến động hàm lượng đường tan của các dòng lạc thế hệ

Hình 3.7 Đồ thị hình rada biểu thị khả năng chịu hạn của các dòng và giống

Hình 3.8 Đồ thị hình rada biểu thị khả năng chịu hạn của các dòng và giống

Hình 3.9 Sự biến động hàm lượng prolin e ở giai đoạn cây non của các dòng

thuộc giống MD7, L18 và giống gốc……… 66 Hình 3.10 Một số hình ảnh giai đoạn cây non, chiều dài rễ của các dòng chọn

lọc thế hệ R4 trước và sau khi gây hạn và phục hồi……… 68 Hình 3.11 Kết quả tách chiết ADN tổng số của các giống lạc……… 69 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới mồi M1

CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic Acid

ADN Deoxyribose Nucleic Acid

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân bản)

ASTT Áp suất thẩm thấu

CNSH Công ngệ sinh học CSCHTĐ Chỉ số chịu hạn tương đối ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ

ĐHSP Đại học sư phạm

HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)

LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi)

KLK Khối lượng khô

MGPT Môi giới phân tử MS Murashige Skoog (Môi trường theo Murashige và Skoog) NXB Nhà xuất bản

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RAPD Random Amplified Polymorphism ADN (Phân tích ADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên)

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị

kinh tế cao Cây lạc được gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích 25,6 triệu ha [13]

Hạt lạc là một trong những nguồn thực phẩm chứa nhiều chất béo và protein cần thiết cho khẩu phần ăn của con người Ngoài ra, hạt lạc còn chứa nhiều vitamin và một lượng hydratcacbon nhất định Hạt lạc là nguyên liệu chính để sản xuất dầu ăn, bánh kẹo, fomat, và là mặt hàng xuất khẩu có giá trị Các phụ phẩm của lạc (khô dầu, thân, lá) được sử dụng làm thức ăn cho gia súc hay phân bón đều rẻ tiền Trồng lạc có tác dụng chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông nghiệp hiện nay [12], [13]

Ở Việt Nam, cây lạc đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu nông nghiệp, đặc biệt ở những nơi khí hậu thường xuyên biến động và điều kiện canh tác còn gặp nhiều khó khăn Trong những năm gần đây, việc tổng kết kinh nghiệm thực tiễn và áp dụng khoa học tiên tiến vào sản xuất đã góp phần tăng năng suất một cách đáng kể [20] Tuy nhiên, do điều kiện khí hậu của Việt Nam nắng nóng, mưa nhiều nên sản xuất lạc ở nước ta vẫn còn nhiều yếu tố hạn chế, một trong những nhân tố chính có ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng lạc là khô hạn Để hạn chế ảnh hưởng của năng suất cây trồng nói chung, cây lạc nói riêng, ngoài các biện pháp tưới tiêu hợp lý cần sử dụng các giống có năng suất và khả năng chịu hạn cao, đặc biệt ở những vùng đất không chủ động nước Vì vậy, nghiên cứu các đặc điểm nông học, chất lượng hạt và khả năng chịu hạn của các giống lạc là rất cần thiết

Một trong những hướng nghiên cứu đang được quan tâm hiện nay là sử dụng các chỉ thị phân tử và công nghệ tế bào thực vật để cải tiến đặc điểm năng suất, chất lượng hạt và khả năng chịu hạn của một số giống cây trồng, trong đó có cây lạc Bằng kĩ thuật nuôi cấy invitro, chúng tôi đã tạo được một số dòng cây từ mô sẹo chịu mất nước của các giống lạc L18, L23, MD7 và MD9 Trên cơ sở nghiên cứu chọn dòng chịu hạn của các giống và các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô

sẹo chịu mất nước ở quần thể R0 và thế hệ R1 [49] và với mục đích chọn tạo được các dòng lạc có các đặc điểm nông học mong muốn, chất lượng hạt và khả

năng chịu hạn cao, chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Đánh giá một số dòng lạc chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống L18, L23, MD7 và MD9”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thông qua việc đánh giá các đặc điểm nông học, sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử nhằm chọn dòng có năng suất, chất lượng và khả năng chịu hạn cao tại Thái Nguyên từ một số dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

của các giống lạc L18, L23, MD7 và MD9

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân tích một số đặc điểm nông học của các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống L18, L23, MD7, MD9 ở thế hệ R2, R3

3.2 Đánh giá chất lượng hạt các dòng chọn lọc thông qua phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh: protein, đường, lipit và thành phần amino acid trong hạt tiềm sinh ở thế hệ R3

3.3 Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thế hệ R4 ở giai đoạn nảy mầm và cây non

3.4 Phân tích sự thay đổi ADN genome của một số dòng chọn lọc thế hệ R4 bằng kĩ thuật RAPD

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây lạc

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, phân bố và đặc điểm sinh học

Vào thời kì phát hiện ra châu Mĩ, cùng với sự xâm nhập của châu Âu vào lục địa này, người ta đã biết đến cây lạc Những người Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha đầu tiên đến châu Mĩ đã thấy dân bản xứ trồng lạc cùng với những cây lương thực khác Hiện nay, cây lạc được trồng phổ biến trên thế giới và Việt Nam [10]

Lạc thuộc họ đậu Leguminosae, chi Arachi, phân họ cánh Bướm phượng Papillonacea, có tên khoa học là Arachis hypogaea L và có bộ nhiễm sắc thể 2n

= 40 Về đặc điểm hình thái, cây lạc có 3 bộ phận chính là: rễ, thân và lá [4], [43]

Rễ cây lạc thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và rễ bên Khi cây lạc được 5 lá thật thì bộ rễ tương đối hoàn chỉnh Bộ rễ có thể ăn sâu 18cm - 30cm và rộng khoảng 30cm - 40cm Sau khi gieo từ 15 - 30 ngày, những nốt sần đầu tiên xuất

hiện do loại vi khuẩn Rhyzobium cộng sinh với hệ rễ Tại nốt sần xảy ra quá trình

cố định đạm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây [8], [13]

Thân cây lạc thuộc loại thân thảo ít gỗ Khi còn non thân thường tròn và đặc Khi thân già có hình góc cạnh và rỗng giữa Tốc độ tăng trưởng của thân tăng dần và đạt cao nhất ở thời kì ra hoa rộ Cây lạc phân cành ngay từ gốc Cành cấp 1 được mọc từ gốc thường có nhiều hoa, cành cấp 2 mọc từ cành cấp 1 và thường có ít hoa hơn Số cành/cây khác nhau tuỳ giống và có ảnh hưởng trực tiếp đến số hoa và quả của cây [4], [12], [13]

Lá lạc thuộc lá kép lông chim chẵn, gồm 2 đôi lá chét Hai lá mầm có vai trò cung cấp chất dinh dưỡng cho cây ở giai đoạn đầu Hai lá kèm hình mũi mác có nhiệm vụ bảo vệ mầm, lá thật có màu xanh thẫm và nhọn ở đầu Diện tích lá đạt tối đa ở thời kỳ hình thành quả và hạt nhưng lại giảm nhanh và có thể đạt giá trị âm vào thời kỳ chín Khi hoa tắt thì lá không mọc thêm nữa Hoa tắt được vài ngày bộ lá chuyển sang màu vàng Lúc quả chín, bộ lá đen và rụng [13]

Hoa lạc mọc ở nách lá thành chùm từ 3 - 5 hoa/chùm Hoa lạc màu vàng, không có cuống gồm 5 phần: lá bắc, lá đài, tràng hoa, nhị đực và nhụy cái Khi cây có từ 9 - 10 lá thật thì hoa nở Khi hoa nở là đã thụ phấn xong, sau đó cuống nhụy mọc dài, nghiêng xuống, đầu bầu nhụy cắm vào đất Quá trình phân hoá hoa kéo dài nên quá trình nở hoa cũng kéo dài [13]

Quả lạc là loại quả khô thường có 2 - 3 hạt Quả lạc bao gồm gốc quả, mỏ quả và eo quả Eo rõ hay không rõ, vỏ quả có gân hay không có gân là đặc điểm khác nhau giữa các giống Hạt lạc bao gồm vỏ lụa bao bọc bên ngoài, bên trong hạt có phôi với hai lá mầm và một trục thẳng Kích thước và màu sắc hạt thay đổi tuỳ theo giống, thời vụ gieo trồng và chế độ chăm sóc [13]

Các chất khoáng cần thiết cho cây lạc bao gồm các nguyên tố đa lượng (N, P, K…) và các nguyên tố vi lượng (Mo, Bo, Cu…) Ngoài ra, số giờ nắng/ngày cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự ra hoa, tạo quả của lạc Trong những ngày nắng hoa nở rộ và quá trình thụ phấn, thụ tinh thuận lợi hơn ngày không nắng Điều kiện đất đai, thổ nhưỡng cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây lạc Từ những đặc điểm đó, cần có biện pháp kỹ thuật thích hợp để nâng cao năng suất, chất lượng và tính chống chịu của cây lạc [12], [13]

Căn cứ theo thời gian sinh trưởng của cây lạc, người ta chia thành giống chín sớm (thời gian sinh trưởng 90- 125 ngày) và giống chín muộn (140- 160 ngày) Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của cây lạc từ 24o

C - 33oC, dưới 12oC hạt lạc không nảy mầm, từ 15oC tỉ lệ nảy mầm khá cao, dưới 17oC hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm khoảng 60 - 70%, lượng mưa phân bố đều Đất thích hợp nhất cho trồng lạc là đất có màu sáng, thoát nước nhanh, dễ vỡ, lượng canxi, lân, chất hữu cơ vừa phải, mùn ít hơn 2%, pH= 6,0 – 6,4 [13]

1.1.2 Giá trị kinh tế

Ở nước ta, lạc được coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị rất đa dạng Trước hết, với giá trị dinh dưỡng cao nên lạc là cây thực phẩm quan trọng trong đời sống của người dân Trong dầu lạc chứa hàm lượng axit béo chưa no cao (80% trong thành phần axit béo của dầu lạc) đây chính là loại dầu thực phẩm tốt Trong hạt lạc có chất lecithin (photphattidyl cholin) có tác dụng trong việc làm giảm lượng cholesterol trong máu, chống hiện tượng xơ vữa

mạch máu Lạc là loại thực phẩm cung cấp năng lượng cao, 100g hạt lạc cung cấp 590 cal, trong khi đậu tương là 400 cal Hạt có thể sử dụng trực tiếp hoặc ép làm dầu thực vitamin mật, sữa lạc, bơ lạc, phomat lạc [12]

Hạt lạc chứa nhiều loại vitamin, đặc biệt là vitamin A Vì vậy, sử dụng các sản phẩm từ hạt lạc sẽ khắc phục được sự thiếu hụt vitamin A [7]

Lạc còn được sử dụng trong chăn nuôi, khô dầu lạc chế biến thành thức ăn gia súc, vitamin mỏ quả lạc có thể nghiền thành cám, cám lạc có giá trị tương đương vitamin với cám gạo Vỏ lạc có thành phần là cellulo và hemicellulo được sử dụng để chế biến thành vật liệu hấp phụ kim loại nặng, đây là một trong những hướng nghiên cứu có tính ứng dụng quan trọng trong việc xử lí nước thải, bảo vệ nguồn nước [10]

Ngoài giá trị dinh dưỡng, lạc còn là cây cải tạo đất rất tốt Cũng như các cây họ đậu khác, ở rễ lạc có các nốt sần do các vi sinh vật cộng sinh cố định đạm hình thành Nhờ khả năng này mà lượng protein ở hạt và các cơ quan như thân, lá, … cao hơn nhiều cây trồng khác Cũng nhờ khả năng cố định đạm nên sau khi thu hoạch đất trồng lạc cũng được cải thiện rõ rệt, lượng đạm trong đất tăng, nhờ hoạt động của vi khuẩn nốt sần mà sau một vụ lạc sẽ để lại trong đất 40 – 60kg N/ha Thân, lá lạc dùng làm phân bón cũng có hàm lượng N, P, K tương đương với phân chuồng [10]

1.1.3 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và Việt Nam

Hiện nay, lạc được trồng trên 100 nước và sản lượng đạt 53,38 triệu tấn Châu Á là nơi có diện tích trồng và sản lượng lạc cao nhất, chiếm trên 60% sản lượng của thế giới Châu Phi đứng thứ hai chiếm 30%, các châu lục khác rất ít (châu Mỹ 5%, châu Âu 0,22%) Sản lượng lạc (trên 60%) tập chung ở một số nước như Ấn Độ (chiếm 31% sản lượng lạc toàn thế giới), Trung Quốc (15%), Xenegan, Nigieria và Mỹ [48]

Ấn Độ là nước đứng đầu thế giới về diện tích trồng lạc (trên 8 triệu ha) nhưng năng suất thấp (6,9 - 9,89 tạ/ha), sản lượng hàng năm chỉ đạt 5,4 triệu tấn Nói chung, năng suất lạc ở Ấn Độ không đồng đều, có vùng chỉ đạt 0,5 tấn/ha, có vùng lại đạt tới 3tấn/ha [53]

Trung Quốc là nước đứng thứ hai về diện tích trồng lạc Diện tích trồng lạc ở Trung Quốc có xu hướng tăng (năm 1993 tổng diện tích là 3379,0 nghìn ha, đến năm 2002 tổng diện tích là 4920,7 nghìn ha) Năng suất lạc ở Trung Quốc khá đồng đều ở các vùng Nhiều năm nay, sản phẩm lạc Trung Quốc là một trong các mặt hàng nông sản xuất khẩu nổi tiếng trên thị trường quốc tế Vào năm 60 của thế kỉ XX, năng suất lạc toàn quốc trung bình đạt 3,0 tấn/ha Sản lượng lạc hàng năm đạt 11,89 triệu tấn, đứng đầu thế giới [48]

Mỹ là nước trồng lạc không lớn (0,59 triệu ha), nhưng năng suất lạc cao nhất thế giới (3,1tấn/ha) , sản lượng đạt 1,8 triệu tấn (số liệu năm 2003) Điều đó chứng tỏ Mỹ là nước đứng đầu về áp dụng các tiến bộ khoa học kĩ thuật [53]

Diện tích trồng lạc ở Đông Nam Á không nhiều, chỉ chiếm 12,61% diện tích thu hoạch và 12,95% sản lượng lạc của châu Á Trong số 7 nước có trồng lạc ở khu vực này thì Myanmar là nước có diện tích trồng lạc lớn nhất, theo sau là Indonesia Tổng diện tích trồng lạc của hai nước này chiếm tới gần 75% diện tích trồng lạc trong khu vực Về năng suất, nhìn chung năng suất lạc trong khu vực còn ở mức thấp, trung bình là 1,17 tấn/ha Malaysia là nước có diện tích trồng lạc không lớn (6000 ha) nhưng lại có năng suất cao nhất khu vực, trung bình năng suất đạt 2,33 tấn/ha và tương đương với mức năng suất cao của một số nước trên thế giới [51]

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc trên thế giới từ năm 2000 – 2008

Chỉ tiêu/năm 2000 2004 2005 2006 2007 2008 Diện tích (triệu ha) 24,49 26,37 26,96 24,67 25,45 25,06 Năng suất (tấn/ha) 1,45 1,79 1,81 1,87 2,00 2,09 Sản lượng (triệu tấn) 35,53 46,90 48,93 46,25 51,00 53,38

( Nguồn: PAS, USDA 2008) [15]

Ở Việt Nam, cây lạc được trồng rộng rãi ở hầu hết các tỉnh, thành trong cả nước và được chia theo các vùng sinh thái ở hai miền Nam, Bắc Diện tích, năng suất và sản lượng lạc không ngừng phát triển Năm 2000, diện tích lạc chỉ đạt 24,1 nghìn ha, với năng suất 1450kg/ha, đạt sản lượng 349,0 ngàn tấn nhưng đến năm 2007 diện tích lạc ở nước ta đã lên 27,99 ngàn ha, năng suất 1980 kg/ha, với sản lượng 554,2 ngàn tấn Do lạc là cây trồng nhiệt đới và á nhiệt đới,

hơn nữa yêu cầu về đất đai không quá khắt khe nên phù hợp với điều kiện nước ta [48]

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc ở Việt Nam từ 2000 – 2008

Năm 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Diện tích

(1000 ha) 244,9 244,6 244,7 243,8 263,7 269,6 264,7 254,5 256 Năng suất

(tấn/ha) 1,45 1,48 1,62 1,67 1,78 1,81 1,87 2,00 2,09 Sản lượng

(1000 tấn) 355,3 363,1 400,4 306,2 469 489,3 462,5 510 533,8

(Nguồn: theo tổng cục thống kê Việt Nam 2010) [16]

Tình hình sản xuất lạc ở các vùng sinh thái khác nhau cũng rất khác nhau về diện tích, năng suất và sản lượng Nhìn chung, các vùng trồng lạc ở miền Bắc có diện tích ổn định hơn ở miền Nam Trong những năm gần đây, khí hậu thay đổi phức tạp, đất nông nghiệp bị rửa trôi và phong hóa nhanh, hàm lượng mùn và dinh dưỡng thấp (đất bạc màu, đất phù sa cổ, đất dốc tụ, ) Vì vậy, trồng lạc là một trong những biện pháp cải tạo đất, tạo nền nông nghiệp bền vững [7]

1.2 Hạn và cơ chế chịu hạn

1.2.1 Khái niệm về hạn và ảnh hưởng của hạn đến thực vật

Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh, mặn, Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho sự sinh trưởng và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học [54]

Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu hụt nước do môi trường gây nên trong suốt cả quá trình hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau như chết, chậm phát triển hay phát triển tương đối bình thường Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây nên gọi là tính chịu hạn [1]

Hạn dẫn đến một số biến đổi trong mô và tế bào như làm biến tính và kết tủa protein, làm tăng độ lỏng của lipit màng, mở xoắn các axit nucleic Hạn cũng phá hoại hệ thống quang hóa II trên màng thylacoid Ảnh hưởng của hạn trước

hết là gây ra sự mất nước của tế bào và mô Thiếu nước nhẹ làm ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, thiếu nước năng gây biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, già hóa tế bào, làm cho cây bị héo Cuối cùng hệ nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn thương và chết Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng suất gieo trồng [54]

Phản ứng của cây đối với hạn là sự đóng khí khổng, giảm tỷ lệ thoát hơi nước của mô, giảm quang hợp và làm tăng tích lũy axit abxisic (ABA), proline, manitol, sorbitol, sự cấu thành nhóm ascobat, glutathione, α-tocopherol, và sự tổng hợp protein mới [72]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịu hạn ở cây lúa, ngô, đậu tương, đậu xanh như Lê Trần Bình và cs, 1988 [1], Chu Hoàng Mậu, 2009 [49], Đinh Thị Phòng, 2001 [41], …

1.2.2 Tác động của hạn đối với cây lạc

Nước là yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất lạc Tuy rằng, lạc được coi là cây trồng hạn, nhưng thực ra cây lạc chỉ chịu hạn ở một giai đoạn nhất định Tình trạng nước trong đất có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của cây lạc Điểm khủng hoảng nước của cây được nhiều tác giả công nhận là thời kỳ ra hoa rộ, thời kỳ đâm tia, thời kì sinh trưởng sinh dưỡng, thời kỳ hình thành quả và hạt Thời kỳ nhu cầu nước của cây tương đối thấp và cũng là thời kỳ cây có khả năng chịu hạn tốt nhất là thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng Sự hấp thu nước của cây lạc trong thời kỳ này ít hơn các thời kỳ tiếp theo Điều này giải thích được nguyên nhân cây ít mẫn cảm với thiếu nước trong pha đầu sinh trưởng Tuy nhiên nếu hạn hán kéo dài thì dù trong thời kỳ cây con cũng ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và năng suất [54]

Khi cây lạc bị thiếu nước, chiều cao cây giảm rõ rệt, lá nhỏ, dày và cứng hơn trong điều kiện bình thường, lá từ màu xanh đậm chuyển dần sang xanh nhạt do diệp lục bị phá hủy Thiếu nước trong thời kỳ ra hoa sẽ làm giảm số hoa, thời gian ra hoa kéo dài, quá trình thụ phấn bị cản trở Ở điều kiện hạn, rễ có thể ăn sâu hơn 5- 10%, nhưng bán kính phân bố rễ giảm 2/3 Trong giai đoạn hình thnàh quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ chất khô tích lũy cũng cao cho nên

cần lượng nước lớn nhất so với các giai đoạn khác trong chu kì sinh trưởng [7], [10], [51]

1.2.3 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn 1.2.3.1 Cơ sở sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn

Khi môi trường khô hạn, thực vật chống lại sự mất nước và nhanh chóng bù lại phần nước đã mất nhờ hoạt động của bộ rễ và sự điều chỉnh ASTT của tế bào Sự thích nghi đặc biệt về cấu trúc hình thái của rễ và chồi nhằm giảm thiểu tối đa sự mất nước hoặc tự điều chỉnh ASTT nội bào thông qua tích lũy của các chất hòa tan, các protein và axit amin nhằm duy trì lượng nước tối thiểu trong tế bào Khả năng thu nhận nước chủ yếu phụ thuộc vào chức năng của bộ rễ Bộ rễ có hình thái khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những vùng sâu Ngoài ra, cây có hệ mạch dẫn phát triển dẫn nước lên các cơ quan thoát hơi nước, hệ mô bì phát triển sẽ hạn chế sự thoát hơi nước của cây [1], [41]

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của tế bào rễ cây đối với đất Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn trong đất Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ [1]

Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên cứu đều cho rằng khi cây gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hàm lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axit hữu cơ, giảm CO2, protein và các axit nucleic [1], [41] Các chất trên có chức năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng giữ và lấy nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, ngoài ra còn có thể thay thế vị trí của nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương tác với protein và lipit màng, ngăn chặn sự phá hủy màng [56]

Nghiên cứu sự đa dạng và hoạt động của enzyme trong điều kiện gây hạn đã được nhiều tác giả quan tâm Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu đặc tính hóa sinh của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, hạn đã nhận xét rằng áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần và hoạt độ protease, kìm hãm sự phân giải protein dự trữ [27] Một số nghiên cứu trên các đối tượng như lạc, lúa, đậu xanh, đậu tương cho thấy, có mối tương quan

thuận giữa hàm lượng đường tan và hoạt độ α-amylase [23], [27], [36], Đường tan là một trong những chất tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào Sự tăng hoạt độ α-amylase sẽ làm tăng tăng hàm lượng đường tan do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng chịu hạn của cây trồng [27], [42]

Một trong các chất liên quan đến thẩm thấu được chú ý là proline Proline là một amino acid có vai trò quan trọng trong sự điều hòa áp suất thẩm thấu trong tế bào Theo thông báo của Chen và Muranta (2002), sức chống chịu của thực vật tăng lên khi được chuyển các gen mã hóa enzym tham gia vào con đường sinh tổng hợp proline trong tế bào [59] Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Cường và cs (2003) cho rằng, sự gia tăng hàm lượng proline của các giống lúa nghiên cứu có mối tương quan thuận với tính chống chịu lạnh, mặn và hạn [3] Chu Hoàng Mậu và cs (2005) khi nghiên cứu về hàm lượng proline ở các giống lúa cạn đã nhận thấy khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn có liên quan đến hàm lượng protein và hàm lượng proline Khi gặp hạn, cây lúa giảm hảm lượng protein, tăng hàm lượng proline Khả năng chịu hạn của cây lúa cạn phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline [32] Nghiên cứu trên đối tượng cây lạc cũng cho kết quả tương tự [25] Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tích lũy proline có thể tăng 10 đến 100 lần ở thực vật dưới tác động của áp suất thẩm thấu [19], [41], …

1.2.3.2 Cơ sở phân tử của tính chịu hạn

Phản ứng của thực vật trước tác động của hạn rất đa dạng, phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có kiểu gen, độ dài và tính khốc liệt của điều kiện ngoại cảnh Biểu hiện của quá trình này là việc sinh tổng hợp của một loạt các chất trong tế bào, một số hoocmon hoặc chất kích thích để giúp cây có khả năng thích ứng Khi đi sâu vào nghiên cứu ở mức độ phân tử của hiện tượng nóng, hạn ở thực vật người ta đã có những bước tiếp cận khác nhau trên nhiều loài cây trồng ở các giai đoạn phát triển Được nghiên cứu nhiều nhất là các protein sản phẩm biểu hiện gen Các nhóm protein được đặc biệt quan tâm bao gồm: protein sốc nhiệt, môi giới phân tử, LEA, [55]

thực vật như lúa mì, lúa mạch, lúa gạo, ngô, đậu nành, hành, tỏi, chúng chiếm

khoảng 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này HSP được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan như: nóng, hạn, lạnh, phèn, mặn, Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn chặn hoặc sửa chữa sự phá hủy do stress nóng và mở rộng giá trị ngưỡng chống chịu nhiệt độ cao Trong các tế bào thực vật HSP tế bào chất tập chung thành các hạt sốc nhiệt (HSG – heat shock granules) Người ta cho rằng các HSP gắn kết trên các ARN polymeraza để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mARN trong quá trình bị stress nóng Sau sốc nóng các hạt này phân tán và liên kết dày đặc với các riboxom hoạt động sinh tổng hợp protein [55]

HSPs được chia thành 6 nhóm dựa trên cơ sở khối lượng phân tử khác nhau: 110, 90, 70,60, 20, 8.5 kDa Trong đó nhóm HSP 60 và HSP 70 có nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (chaperonin), HSP 8,5 kDa (ubiquitin) có chức năng bảo vệ tế bào nhưng không phải chất môi giới phân tử Ubiquitin có hoạt tính proteaza với chức năng phân giải các protein không có hoạt tính enzym Ubiquitin ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ cao nên có vai trò tự sửa chữa khi tế bào gặp điều kiện cực đoan, đặc biệt là nhiệt độ cao [27]

Môi giới phân tử (MGPT): MGPT là một nhóm nhiều loại protein khác

nhau, phần lớn các chất MGPT có hoạt tính ATP – aza Chức năng chính của MGPT ở thực vật là tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới tổng hợp từ bước đầu tiên tới bước cuối cùng, ngay từ trong riboxom; chuyển protein quan màng; duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein; ngăn chặn sự hủy hoại protein chưa tạo cấu trúc không gian đúng; khởi đầu cho sự phân hủy protein biến tính [27], [71]

MGPT có 5 họ chính là : HSP70 (DnaK), chaperonin (HSP60), HSP90, HSP100 và sHSP (small HSP) Các phân tử HSP được định vị trong tế bào chất và nội bào quan như là nhân, ty thể, lập thể và mạng lưới nội chất Có 2 họ môi giới phân tử được nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70 [71] Ở thực vật HSP70 được phân lập từ nhiều loại cây khác nhau như lúa [67], ngô [64], đậu xanh [73]

LEA (Late embryogenesis abundant protein – protein tích lũy với lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi): LEA là protein có

vai trò bảo vệ thực vật bậc cao khi môi trường xảy ra stress, đặc biệt là hạn LEA là một trong nhóm gen liên quan đến sự mất nước của tế bào thực vật Protein LEA hạn chế sự mất nước do điều kiện ngoại cảnh bất lợi và đóng vai trò điều chỉnh quá trình mất nước sinh lý khi hạt chín Trong tự nhiên, phôi sau khi hình thành trong giai đoạn chín thường được chuyển sang trạng thái ngủ, lượng nước trong phôi và trong hạt giảm đến mức tối thiểu Protein LEA được tạo ra hàng lọat trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi ABA, độ mất nước của tế bào và áp suất thẩm thấu trong tế bào [65] Protein LEA có những đặc điểm chính sau: Giàu amino acid ưa nước, không chứa cystein và tryptophan, có khả năng chịu nhiệt Protein LEA thực hiện các chức năng như cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu Nhiều gen LEA đã được nghiên cứu và phân lập trên các đối tượng cây trồng khác nhau [58], [64]

1.2.4 Ứng dụng của công nghệ tế bào thực vật trong đánh giá và chọn dòng chịu hạn

Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể được sử dụng để đánh giá khả năng chống chịu của cây trồng ở nhiều mức độ khác nhau như mức gen, mức tế bào riêng rẽ, các loại mô, cơ quan nuôi cấy, phân lập và cây hoàn chỉnh Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng chống chịu như chịu hạn mang lại hiệu quả cao trong chọn lọc các giống cây trồng phù hợp với điều kiện sinh thái của từng vùng miền khác nhau [21], [49]

Mundy và Chua (1998) tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa đã nhận thấy ABA (abscisic acid) là chất làm tăng khả năng giữ nước và chống chịu mất nước của mô sẹo ở lúa Nồng độ ABA thích hợp cho xử lý tiền mô sẹo ở lúa là 10-5

M và thời gian xử lý là 5 – 7 ngày [69]

Tác giả Đinh Thị Phòng (2001) bằng các phương pháp thổi khô mô sẹo của các giống lúa CR203, CH133, Lốc, X11, C70 đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn Tác giả đã chọn tạo được giống DR1, DR2 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳng giống gốc [41]

Nguyễn Thị Thu Hoài (2005) khi nghiên cứu về khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn địa phương đã kết luận rằng khả năng chịu mất nước và tốc độ sinh trưởng của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô của các giống nghiên cứu có sự sai khác rõ rệt, giống BC12 là giống chịu hạn tốt nhất so với các giống nghiên cứu [17]

Ngô Thị Liêm (2006) khi đánh giá khả năng chịu hạn của 5 giống lạc (DBG, L14, MD7, L18) ở mức độ mô sẹo trên cơ sở xác định độ mất nước, khả năng chống chịu mất nước khả năng sống sót và khả năng tái sinh cây đã cho thấy khả năng chịu hạn của các giống lạc nghiên cứu là khác nhau, cao nhất là ĐBG, thấp nhất là L18 [24], [25]

Theo tác giả Nguyễn Thị Thu Ngà (2007) khả năng chịu hạn của các giống lạc ở mức độ mô sẹo được xếp theo thứ tự từ cao xuống thấp như sau: L12 > L14 > V79 > L15 > L25 [36]

Nguyễn Thị Thu Giang (2008) khi đánh giá khả năng chịu hạn của 6 giống lạc ở giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn cây non 3 lá và ở mức độ mô sẹo được sắp xếp theo thứ tự sau: L24> LCB> L23 > LBK> LTB >L08 Tác giả đã tiến hành sàng lọc được 159 dòng mô sẹo có khả năng chịu hạn và 315 dòng cây xanh của 5 giống lạc L23, L08, LTB, LCB, LBK [21]

Hoàng Tú Hằng (2009) khi đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng thế hệ R1, R2 của 5 giống lạc (L08, L23, LCB, LTB, LBK) trong điều kiện hạn sinh lý ở giai đoạn nảy mầm đã cho thấy các dòng R2.04, R2.09, R2.15, R2.18, R2.24 có khả năng chịu hạn tốt hơn so với các dòng chọn lọc khác và giống gốc [18]

Thân Mỹ Ngọc (2009) khi đánh giá khả năng chịu hạn của 6 dòng lạc và giống gốc ở giai đoạn hạt nảy mầm trong môi trường có bổ sung sorbitol 10% thu được kết quả dòng RD1.5 có khả năng chịu hạn cao nhất [37]

1.3 Kĩ thuật RAPD trong phân tích hệ gen thực vật

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS(1990), Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng Thành phần và các bước của phản ứng RAPD dựa trên cơ sở của phản ứng PCR, chỉ khác ở kích thước mồi và nhiệt độ bắt cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp mồi của phản ứng RAPD

vào khoảng 350

C- 450C Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit Mồi có thể bám vào bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotit bổ sung trên phân tử ADN khuôn [29], [33], [35] Do vậy, xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN mẫu là rất lớn Sự khác nhau về vị trí và số lượng các đoạn ADN có thể ghép cặp bổ sung với mồi chính là cơ sở của sự đa hình về phổ băng ADN được nhân bản Sản phẩm được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hóa chất đặc trưng Vì vậy, tính đa hình thường được nhận ra là do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản từ một locus [63]

Từ khi ra đời kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng khác nhau như đậu xanh, đậu tương, đu đủ, lạc, lúa, chuối trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài [11], [31], [60] phân tích và đánh giá bộ genome thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [5], [40], [60] Ngoài ra còn được ứng dụng hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau

Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng,Nông Văn Hải (2004) khi

phân tích tính đa dạng di truyền của 8 giống tằm dâu nuôi ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD với 5 đoạn mồi, kết quả nhận được 67 băng ADN nhân bản trong đó có 26 (38,8%) băng đơn hình và 41 (61,2%) băng đa hình Đoạn mồi 0P016 cho số băng đa hình phong phú nhất, mồi 101 có tỷ lệ băng đa hình thấp nhất [2]

Lê Xuân Đắc và CS (1999) sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích đa hình và chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước [11]

Nghiên cứu đa dạng tập đoàn giống lúa có tính khác nhau với bệnh bạc lá bằng kĩ thuật RAPD, tác giả Đinh Thị Phòng đã sử dụng 21 mồi ngẫu nhiên với 36 giống lúa thu được tổng số 392 phân đoạn ADN được nhân lên Tất cả 21 mồi RAPD đều cho tính đa hình Sự sai khác về hệ số tương đồng di truyền giữa các giống khoảng 22% - 64 % Có tổng số 36 giống lúa có tính kháng bệnh bạc lá khác nhau có thể sử sử dụng như là những nguyên liệu để xác định nhóm gen

kháng của từng giống lúa làm cơ sở trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá có năng xuất chất lượng cao [41]

Với 10 mồi ngẫu nhiên, Nguyễn Thị Tâm (2004) đã cho thấy các dòng lúa chọn lọc tạo ra từ mô sẹo lúa chịu nhiệt giống CR203, CS4, ML107 đã có những thay đổi ở mức độ phân tử [44]

Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động từ 0,41- 0,80 [45]

Bùi Thị Thu Thủy (2006) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của các dòng lúa chọn lọc R1 với giống gốc U17 cho thấy cả 5 mồi đều thể hiện tính đa hình, các dòng chọn lọc có mức độ khác biệt di truyền so với giống gốc từ 0,18 - 0,40 [50]

Hà Thị Phúc và CS (2005), khi nghiên cứu sự đa hình di truyền một số loài thực vật thu thập từ Mã Đà và Cát Tiên (tỉnh Đồng Nai) đã phát hiện thấy có những sai khác về hoạt độ một vài enzym bảo vệ oxy hoá cũng như phổ băng

ADN giữa các mẫu ốc Bradybaena similaris thu thập được từ khu vực này so

với mẫu ốc cùng loài thu thập được từ Vườn Quốc gia Cát Tiên (Tỉnh Đồng Nai) là nơi có điều kiện sinh thái tương tự Mã Đà nhưng ít bị tác động của chiến tranh hoá học [42]

Quách Thị Liên và CS (2004) khi Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv thu được kết quả: Trong tổng số 428 phân đoạn ADN được nhân ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD sử dụng 6 mồi với 9 xuất xứ cây Lim xanh cho 100% phân đoạn đa hình Điều này cho thấy các mồi RAPD được nghiên cứu cho sự đa hình cao ở các xuất xứ Lim xanh [28]

Nguyễn Hoàng Nghĩa và CS (2007) khi phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) bằng chỉ thị phân tử RAPD cho kết quả Các sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Gõ đỏ với các mồi RAPD cho thấy tất cả các mồi đều cho đa hình Trong 6 mồi sử dụng có các mồi OPC9 và OPB10 cho nhiều băng đa hình hơn Các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền

cao Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100% Trong tổng số 50 mẫu thu được từ 7 vùng của 4 tỉnh thì các mẫu L1, L3 và L4 (từ huyện Lắc, Đắc Lắc), K9 và K4 (từ Kon Hà Nừng, Gia Lai) có mức độ khác biệt di truyền cao hơn so với các mẫu còn lại, Mẫu K4 có mức độ khác biệt đến 53% so với các mẫu khác [38]

Nguyễn Đức Thành và CS (2005) khi nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu(Dipterocarpaceae) ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp nhận thấy Các loài cây họ Dầu được nghiên cứu có mức độ đa dạng về mặt di truyền cao, hệ số di truyền diao động từ 0,18 đến 0,58 [46]

Ở lạc, Moretzohn và cs đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với dạng dại của chúng trên cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [68]

Đánh giá sự đa dạng của một số dòng lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt, sử dụng với 11 mồi ngẫu nhiên, tác giả Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng đã thu được 66/109 phân đoạn ADN đa hình [47]

Raina và CS (2002) đã sử dụng chỉ thị RADP – SSR phân tử để xác định sự đa dạng hệ gen và mối quan hệ hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc dại [70]

Nguyễn Thị Hoa Lan (2004) khi sử dụng 5 đoạn mồi ngẫu nhiên để phân tích ADN hệ gen của 12 giống lạc, có 4 mồi cho kết quả đa hình với 15 phân đoạn đa hình chiếm 46,9% và các giống lạc được chia thành 2 nhóm chính, có sự sai khác về hệ số tương đồng di truyền từ 7% - 33 % [26]

Khi nghiên cứu sự đa dạng di truyền tác giả Ngô Thị Liêm (2006) đã nhận được 168 phân đoạn ADN Năm mồi được sử dụng trong nghiên cứu đều biểu hiện đa hình Mồi RA159 cho tỉ lệ đa hình cao nhất (81,82%), thấp nhất là mồi RA40 (9,09%) Năm giống Lạc nghiên cứu có sự khác nhau về mặt di truyền giữa 2 nhóm là 31% [25]

Nguyễn Thu Giang (2008), sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của một số dòng thế hệ R1 có nguồn gốc từ giống LCB cho thấy có 6/10 cho tính đa hình, hệ số sai khác di truyền giữa các dòng chịu mất nước so với giống gốc LCB từ 0,0318 - 0,2055 Điều đó khẳng định các

dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước có sự thay đổi trong ADN genome [21], [22]

Thân Mỹ Ngọc (2009) sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên đã thu được 344 phân đoạn ADN được nhân bản từ hệ gen 7 dòng lạc Trong 10 mồi có 5 mồi cho tính đa hình, mồi M6 cho tính đa hình cao nhất, mồi M1 tính đa hình thấp nhất Trong 6 dòng lạc nghiên cứu thì hệ gen dòng RM1.1 có hệ số sai khác so với giống gốc là 12%, hệ gen của dòng RD1.5 có hệ số sai khác so giống gốc là 23% [37]

Tiến hành sử dụng kĩ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh học cây lạc dựa trên phân tích cấu trúc ADN nhằm xác dịnh mức độ sai khác ADN của các dòng lạc nhằm chọn ra dòng lạc có năng suất chất lượng cao Đây là phương pháp mang tính ứng dụng cao

Bảng 2.1 Các dòng chọn lọc ở thế hệ R2 và giống gốc

Giống gốc

Năng suất (tấn/ha)

Khả năng chống chịu

Thời gian sinh trưởng

chống đổ tốt

120 - 130

R2.01, R2.02, R2.03, R2.04, R2.05, R2.06, R2.07, R2.08, R2.09, R2.01, R2.11, R2.12,

R2.13

13

L18 5,5 – 7

Chống đổ tốt, kháng bệnh lá và

kháng héo xanh vi khuẩn lá

120 - 130

R2.14, R2.15, R2.16, R2.17, R2.18, R2.19,

R2.20, R2.21

8

MD7 2,8 – 3,2

Kháng bệnh héo xanh vi khuẩn

Hóa chất: Dùng cho các thí nghiệm phân tích hóa sinh và sinh học phân

tử gồm các loại hóa chất mua của các hãng Anh, Đức, Mỹ, Trung Quốc: EDTA (Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid), CTAB, TAE, agarose,…

Các hóa chất thông dụng khác: axit citric, NaOH, NaCl, ethanol (70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl cacohol, isopropanol, nước khử ion,…

Thiết bị: Các thiết bị được sử dụng để phân tích hóa sinh và sinh học

phân tử gồm: máy quang phổ UV – Vis Cintra 40 (Austraila), máy điện di + bộ nguồn PowerPar 300 (Bio – Rad, Mỹ), máy phân tích axit amin tự động – HP amino Quan Series II (Hewlett Parkard, Mỹ), máy PCR (Anh), Pipetman các loại (Gilson, Pháp), tủ sấy (Anh), cân điện tử (Thụy Sỹ), Tủ lạnh sâu – 85o

C (Sanyo, Nhật), nồi khử trùng (Tomy – Nhật), máy li tâm lạnh (Đức), máy khuấy trộn Voltex (Đức), máy đo PH (Metter Toledo, Thụy Sỹ) và một số các thiết bị phụ trợ khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông học các chọn lọc

- Bố trí: Các dòng được trồng theo hàng, có chia ô, có đóng cọc, căng dây, gắn nhãn để tiện cho việc theo dõi và lấy số liệu

- Chế độ chăm sóc: Đối với các dòng chọn lọc và giống gốc là hoàn toàn giống nhau

- Thời vụ: Thế hệ R2 được trồng vào vụ xuân hè 2009 (từ 2/ 2009 – 6/ 2009), thế hệ R3 được trồng vào vụ thu đông 2009 (từ 8/ 2009 – 12/ 2009)

- Làm đất và lên luống: Làm tơi xốp, sạch cỏ dại, lên luống rộng 1 - 1,5m, cao 25 - 30cm, có rãnh thoát nước tốt trước khi trồng

- Lượng giống: Chọn các hạt mẩy, chắc Gieo 10hạt/luống Các hạt cách nhau 10cm/hàng Hàng nọ cách hàng kia 40cm Mỗi dòng gieo10 hàng Trung bình mỗi ô thí nghiệm 4 m2

- Bón phân: Phân hữu cơ bón trước khi trồng 10 ngày Vôi bón lót 50% trước khi rạch hàng Sau khi bón phân, lấp một lớp đất dày 2 - 3cm để hạt giống không bị tiếp xúc trực tiếp với phân Bón thúc phân NPK khi cây có 2 - 3 lá thật Sau khi cây lạc ra hoa rộ 7 - 10 ngày, bón phân thúc lần nữa để cây phát triển củ

- Gieo hạt: Trước khi gieo, ngâm hạt 2h trong nước Gieo lúc đất ẩm (mưa nhỏ hoặc tưới) vào chiều tối, gieo hạt cách xa phân bón lót 3 - 4cm, sau đó lấp đất nhỏ dày 1- 2cm phủ kín hạt Sau trồng 4 - 5 ngày, kiểm tra và trồng dặm những chỗ hạt không nở

- Xới lần 1: Khi cây có 2 - 3 lá thật (sau mọc 10 - 12 ngày), xới phá váng, không

vun để tạo độ thoáng dưới gốc, giúp cành cấp 1 phát triển

- Xới lần 2: Khi cây có 7 - 8 lá thật (sau mọc 30 - 35 ngày), trước khi ra hoa và

nên xới sâu 5-6 cm giữa hàng, giúp đất tơi xốp, thoáng khí, không vun gốc

- Xới lần 3: Xới vun gốc sau khi lạc ra hoa rộ 7 - 10 ngày

- Tưới nước giữ ẩm thường xuyên để lạc phát triển, đặc biệt trong thời kỳ trước ra hoa và làm quả bằng cách tưới phun

- Phòng trừ sâu bệnh: Đề phòng dế, kiến, mối hại quả và bệnh héo xanh do vi khuẩn Kiểm tra thường xuyên phát hiện sâu bệnh để có biện pháp phòng trừ - Theo dõi các chỉ tiêu chính sau:

+ Chiều cao thân chính

+ Hình dạng, kích thước của nhánh (bò, đứng) + Số nhánh/ cây

+ Số lượng quả chắc/ cây + Khối lượng 100 quả + Khối lượng 100 hạt + Tỷ lệ khối lượng hạt

+ Theo dõi các đặc điểm quả (3 hạt, eo thắt quả, mỏ quả, )

Thí nghiệm nghiên cứu ngoài đồng ruộng được thực hiện tại Phường Quang Vinh – Thành phố Thái Nguyên từ tháng 2/2009 đến tháng 1/2010

2.2.2 Phương pháp đánh giá chất lượng hạt (1) Xác định hàm lượng lipit

Nguyên tắc: Dựa vào tính chất tan trong dung môi hữu cơ của lipit để

chiết lipit, dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether Hàm lượng lipit

được xác định theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [34]

Tiến hành: Hạt lạc sấy khô đến khối lượng không đổi, nghiền nhỏ Cân

0,20g mẫu cho vào tube, thêm 1,5ml petroleum ether, lắc nhẹ, để qua đêm ở 40

C, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, chắt bỏ dịch Giữ lại mẫu và tiếp tục cho petroleum ether Lặp lại 3 lần Sau đó sấy khô lại mẫu đến khối lượng không đổi, cân mẫu

Hàm lượng lipit thu được tính bằng công thức sau:

Hàm lượng lipit ( % khối lượng khô ) =  100(%)

ABA

Trong đó: A: Khối lượng mẫu trước khi chiết (g) B: Khối lượng mẫu sau khi chiết (g)

(2) Xác định hàm lượng đường tan

Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, đường khử ferixianua kali thành

feroxianua kali Với sự có mặt của galetin hóa feroxianua kali kết hợp với sắt sunfat tạo thành phức chất màu xanh bền K3Fe(CN)6 → K2Fe(CN)6 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp vi phân tích được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [6]

Tiến hành: Hạt lạc đã sấy khô, bóc bỏ vỏ lụa, cân 0,2g mẫu nghiền trong

2ml nước cất Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút Dịch chiết thu được chuyển sang ống nghiệm khác Lấy 1ml dịch chiết, thêm vào đó 1ml K3Fe(CN)6, đun cách thủy trong 15 phút Dung dịch sau đun để nguội, thêm 2ml hỗn hợp Fe2(SO4)3 và gelatin (đã trộn theo tỷ lệ 20:1) Hỗn hợp dung dịch thu được đo trên máy ở bước sóng 585 nm, dựa trên đồ thị đường chuẩn glucose

Hàm lượng đường khử được tính theo công thức:

X (%) =   100(%)

Trong đó: X: Hàm lượng đường khử (%)

a: Hàm lượng đường khi đo trên máy (mg/ml) b: Số ml dịch chiết

HSPL: Hệ số pha loãng m: Khối lượng mẫu ban đầu

(3) Xác định hàm lượng protein

Nguyên tắc: Phương pháp này có sự phối hợp giữa phản ứng biure và phản

ứng thuốc thử Folin của dung dịch protein Thuốc thử Folin tác dụng với các gốc Tyr, Trp, His trong phân tử protein để tạo nên phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm Hàm lượng proteintheo phương pháp Lowry dựa vào mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [6]

Tiến hành: Hạt lạc được bóc vỏ, nghiền mịn, sấy đến khô tuyệt đối ở

C Cân 0,05g mẫu cho vào eppendorf, thêm 1,5 ml đệm chiết phostphat

citrat PH=10, lắc đều bằng voltex 10 phút, để qua đêm ở nhiệt độ 40C, đem ly tâm 12000 vòng/phút ở 40

C trong 30 phút, rồi thu lấy dịch để làm thí nghiệm Thí nghiệm lặp lại 3 lần

Dịch chiết được định mức lên 5ml bằng dung dịch đệm phosphat citrat (pH=10) và đo phổ hấp thụ trên máy UVvis Cintra ở bước sóng 750nm với thuốc thử foling

Hàm lượng protein được tính theo công thức :

X (%) = A HSPLm

100 % Trong đó: X: hàm lượng protein (% khối lượng khô)

A: nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) HSPL: hệ số pha loãng

m: khối lượng mẫu (mg)

(4) Phân tích thành phần hàm lƣợng amino acid hạt tiềm sinh

Hàm lượng amino acid được xác định trên máy HP-Amino Quant sử dụng ortho-phtalandehyt tạo dẫn xuất đối với các axi t amin bậc 1 và 9; fluoreryl-metyl-clorofomat đối với các axit amin bậc 2 Mẫu được xử lý theo phương pháp thủy phân pha lỏng theo hướng dẫn sử dụng máy phân tích axit amin tự động

2.2.3 Đánh giá khả năng chịu hạn các dòng chọn lọc thế hệ R42.2.3.1 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm

(1) Chuẩn bị mẫu: Hạt của các dòng chọn lọc sau khi bóc vỏ gỗ được ngâm

trong nước 2h, sau đó ủ bằng dung dịch MS pha loãng 10 lần chứa sorbitol 10% Hạt nảy mầm sau các thời gian ủ 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày được lấy để xác định hoạt độ α-amylase, hàm lượng đường tan Đối chứng là các hạt lạc được ủ bằng dung dịch MS 10% không chứa sorbitol

Nguyên tắc : Dựa vào tính chất hòa tan của -amylase trong dung dị ch đệm phosphat 0,2M, PH = 6,8 Hoạt độ -amylase được xác định dựa vào mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch iốt Giá trị mật độ quang được đo ở bước sóng 560nm trên máy quang phổ UVvis Cintra 40 Hoạt

độ - amylase được xác định theo phương pháp của Heilken được mô tả trong tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (1979) [8]

Tiến hành: Hạt lạc nẩy mầm bóc vỏ lụa, cân 0,25g khối lượng , nghiền

trong đệm phosphat 0,2M pH = 6,8, ly tâm 12000 vòng/phút tro ng 15 phút ở 40C, thu dịch để xác định hoạt độ của enzym e Thí nghiệm phân tích hoạt độ - amylase được tiến hành với ống thí nghiệm và ống kiểm tra, cơ chất là tinh bột 1%

+) 0,25ml tinh bột 1% +) 0,25ml NaCl 0,1% +) 0,5ml đệm photphat +) 0,25ml dịch chiết enzyme

+) 0,25ml tinh bột 1% +) 0,25ml NaCl 0,1% +) 0,5ml đệm photphat +) 0,25ml dịch chiết enzyme +) 1,25ml axit sunfosalysilic 20% Lắc đều, ủ trong 30 phút ở 30o

C +) 1,25ml axit sunfosalysilic 20%

Lắc đều Để nhiệt độ phòng 5 phút Lấy 0,5 ml dung dịch trên + 4,5ml dd iốt loãng 150 lần Đo trên máy quang phổ ở bước sóng 560nm

Hoạt độ -amylase được tính theo công thức:

Trong đó: A: hoạt độ -amylase (ĐVHĐ/mg)

C2: lượng tinh bột còn lại của mẫu thí nghiệm (mg/ml) C1: lượng tinh bột còn lại của mẫu kiểm tra (mg/ml) h: khối lượng mẫu (mg)

HSPL: hệ số pha loãng

(3) Xác định hàm lượng đường tan

Hàm lượng đường tan giai đoạn hạt nảy mầm được xác định theo phương pháp vi phân tích được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [6] tương tự mục 2.2.2 (2)

Xác định mối tương quan giữa hoạt độ amylase và hàm lượng đường tan giai đoạn nảy mầm của các dòng lạc thế hệ R3 bằng toán thống kê sinh học [52]

2.2.3.2 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phương

Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non được tiến hành theo Lê Trần Bình và cs (1998) [1]

(1) Chuẩn bị mẫu

Hạt lạc nảy mầm gieo vào các bát nhựa nhỏ có kích t hước bằng nhau, mỗi hộp 30 hạt Cát vàng đãi sạch , phơi khô cho vào cá c hộp với lượng như nhau Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi chỉ tiêu nghiên cứu trong điều kiện chăm sóc như nhau Thời gian đầu tưới nước cho đủ ẩm, khi cây được 3 lá thật thì tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lạc

(2) Xác định các chỉ số liên quan đến khả năng chịu hạn trước và sau khi gây hạn

- Khối lượng tươi của rễ, thân lá

- Khối lượng khô của rễ, thân lá các mẫu được sấy khô tuyệt đối ở 1050C đến khi khối lượng không đổi

- Chiều dài rễ ở mỗi giai đoạn hạn

- Xác định tỷ lệ sống sót của các dòng ở mỗi giai đoạn hạn

(3) Xác định khả năng phục hồi của các dòng ở mỗi giai đoạn hạn

Trong đó: H: khả năng phục hồi của cây sau khi xử lý hạn (%) Hph : số cây phục hồi (cây)

Hts: tổng số cây gây hạn (cây)

(4) Xác định khả năng giữ nước q ua các giai đoạn xử lý hạn

Trong đó: W: khả năng giữ nước của cây sau khi xử lý hạn (%) Wxl : khối lượng tươi của cây sau khi xử lý hạn (g) Wkxl : khối lượng tươi của cây không xử lý hạn (g)

Trong đó: S : chỉ số chịu hạn tương đối

: là góc tạo bởi hai trục mang trị số liền nhau  = 3600/6 a, b, c, d, … k là các chỉ tiêu theo dõi

n : kí hiệu các giống nghiên cứu

(6) Xác định hàm lượng prolin e

Xác định hàm lượng proline theo phương pháp của Bates L.S và cs (1973) [57] Rễ, thân lá của các giống ở các thời điểm 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày gây hạn , cân khối lượng 0,3 gram mẫu Thêm 10ml dịch chiết axit sunfosalisilic 3%, ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 20 phút và lọc qua giấy lọc Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, bổ sung 2ml axit axetic và 2ml dung dịch ninhidrin, sau đó ủ trong nước nóng 1000C trong 1 giờ, ủ trong tủ đá 5 phút Bổ sung vào bình 4ml toluene, lắc đều và lấy phần dịch có màu hồng ở trên Đo phổ hấp thụ ở bước sóng 520 nm Hàm lượng proline được xác định trên máy theo đồ thị chuẩn

Hàm lượng proline được tính theo công thức: (%)  100

Trong đó: X: hàm lượng proline (%)

A: nồng độ thu được khi đo trên máy quang phổ HSPL: hệ số pha loãng

m: khối lượng mẫu (mg)

Các thí nghiệm phân tích sinh lý, hóa sinh được tiến hành tại Phòng Công ngệ Tế bào, Phòng Di truyền và Công nghệ gen, Phòng Hóa Sinh – Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên

2.2.4 Phương pháp đánh giá sự thay đổi ADN genome (1) Tách chiết ADN tổng số

Quy trình tách chiết ADN từ lá lạc Quy trình tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ lá lạc theo phương pháp của Doyle J.J và J.L Doyle có cải biến cho phù hợp [61]

Bước 1: Cân 200mg mẫu lá Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ vô

trùng, nghiền thành bột mịn và chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml

Bước 2: Bổ sung 600µl đệm tách chiết (1,5M NaCl + 100 mM Tris HCl + 20mM

EDTA (Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid) + 2% CTAB), đảo nhẹ tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ 1 giờ ở 65oC (thỉnh thoảng đảo đều)

Bước 3: Để nguội 5 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 4: Bổ sung 600µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều để tạo thành

dịch Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, hút dịch nổi cho vào ống eppendorf

1,5ml mới (lặp lại bước này 2 lần)

Bước 5: Bổ sung 800µl isopropanol đảo nhẹ để ở tủ -20oC trong 1 giờ Ly tâm

12.000 v/p trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi, thu tủa

Bước 6: Bổ sung 800µl cồn 70% Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o

C,

loại cồn thu tủa

Bước 7: Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng Bước 8: Hoà tan ADN trong 100µl TE

(2) Phương pháp xác định hàm lượng và độ sạch của ADN

Điện di trên gel agarose Kiểm tra chất lượng ADN thu được thông qua

điện di trên gel agarose 0,8%

Đo bằng máy quang phổ hấp phụ Xác định hàm lượng ADN trên máy

quang phổ model 825-2A của hãng Hewlett Packarrd

Dung dịch ADN được đo trên máy quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm Hàm lượng và độ sạch của ADN được tính theo công thức:

Hàm lượng ADN (ng/µl) = 50 x HSPL x OD260

Độ sạch ADN = OD260 /OD280

Trong đó: HSPL: Hệ số pha loãng

OD260 : Chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm OD280 : Chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm Nếu tỉ lệ OD260 /OD280 = 1,8 – 2,0 thì mẫu được coi là sạch

polimerase và 5 – 10ng ADN khuôn

Tiến hành nhân bản trong máy PCR – Themarmal Cycler PTC 100 theo chu trình: Bước 1: 94 0C trong 1 phút; Bước 2: 92 0C trong 1 phút; Bước 3: 36

C trong 1 phút; Bước 4: 72 0C trong 1 phút; Bước 5: 72 0C trong 10 phút; Bước 6: Giữ ở 40C; Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 45 chu kì

(4) Điện di và phân tích sản phẩm RAPD

Điện di sản phẩm RAPD được thực hiện trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X Nhuộm gel bằng ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước, soi gel trên đèn UV và chụp ảnh

(5) Phân tích số liệu RAPD

Thống kê các băng ADN xuất hiện và không xuất hiện trên kết quả điện di theo quy ước: 1: xuất hiện băng; 0: không xuất hiện băng ADN Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism information contect = PIC) của mỗi mồi xác định theo công thức:

2.2.5 Xử lý số liệu và tính toán kết quả

Mỗi mẫu nghiên cứu được lặp lại 3 lần Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê, như trung bình mẫu (X), phương sai (2), độ lệch chuẩn ( ) và sai số trung bình mẫu (SX), hệ số tương quan R, Cv %: hệ số biến dị, Các số liệu được xử lý bằng toán thống kê sinh học [30], [52]

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đặc điểm nông học của một số dòng lạc chọn lọc

3.1.1 Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc thế hệ R2

Đối với lạc, sinh trưởng là một đặc điểm chịu ảnh hưởng rất lớn của mùa vụ và môi trường [20] Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng của các dòng lạc thế hệ R2 thông qua các chỉ tiêu về chiều cao cây, số nhánh/cây và số quả/cây được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 cho thấy, mức độ biến động của các dòng lạc chọn lọc về tính trạng chiều cao cây còn khá lớn trong đó thấp nhất là dòng R2.3 (3,45%) cao nhất là dòng R2.21 (34,48%) Trong số 31 dòng nghiên cứu thì có 10/31 dòng (chiếm 32,25%) có hệ số biến động nhỏ hơn so với giống gốc Chiều cao cây là tính trạng phụ thuộc đặc điểm di truyền của giống và điều kiện ngoại cảnh của môi trường Ở một mức độ nào đó, chiều cao cây phản ánh khả năng sinh trưởng và năng suất cây lạc [20] Giống L23 có chiều cao thân chính dao động 27,77cm đến 41,00 cm; từ 34,25 đến 61,57cm (các dòng có nguồn gốc từ giống L18); từ 18,84 đến 65,87cm (các dòng có nguồn gốc từ giống MD7); từ 27,75 đến 38,44cm (các dòng có nguồn gốc từ giống MD9) Có 5/13 dòng chọn lọc có nguồn gốc từ giống L23 có chiều cao thân chính của cây cao hơn giống gốc (cao hơn 33,87cm); có 1 dòng của giống gốc MD9 cao hơn giống gốc Như vậy, chiều cao thân chính của các dòng chọn lọc của giống L23 và MD9 có xu hướng thấp hơn giống gốc, mức độ ổn định của nhiều dòng lại cao hơn so với giống gốc Tất cả các dòng chọn lọc từ mô sẹo chịu mất nước của giống L18 đều cao hơn so với giống gốc, nhiều dòng có chiều cao hơn nhiều như R2.16 cao hơn 1,8 lần và R2.18 cao hơn 1,87 lần Giống MD7 có 1 dòng cao hơn giống gốc 2,11 lần là R2.26, còn lại các dòng đều thấp hơn so với giống gốc

Sự sai khác về chiều cao cây của các dòng chọn lọc so với giống gốc được kiểm tra bằng hàm t-Test Two sample For Mean trong chương trình Exel (α = 0,05) (Bảng 3.3) Kết quả cho thấy, sự sai khác về chiều cao cây của 87,5% số dòng của giống L18, 69,23% số dòng của giống L23, 60% số dòng của giống