Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh giống xuân châu hương

Để tạo được những giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu cao với điều kiện môi trường, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

SẦM THỊ THANH HUYỀN

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LÖA

CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU LẠNH

GIỐNG XUÂN CHÂU HƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

SẦM THỊ THANH HUYỀN

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LÖA

CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU LẠNH

GIỐNG XUÂN CHÂU HƯƠNG

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Tâm

Thái Nguyên – Năm 2013

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào

và vi sinh), KTV Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Di truyền - Sinh học hiện đại, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên), KTV Lê Đức Huấn (phòng thí nghiệm Sinh học - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên) đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa Học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Tác giả

Sầm Thị Thanh Huyền

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4D – Axit dichlorphenoxyacetic

ADN Axit deoxyribonucleic

cs Cộng sự

cADN Complementary ADN

ĐC Đối chứng

TN Thí nghiệm

XCH Xuân Châu Hương

EDTA Ethylen diamin tetra acetic acid

kb Kilobase

MS Môi trường Murashige và Skoog

mARN Messenger ARN

PCR Polymerase Chain Reaction

RAPD Random Amplified Polimorphic ADN

R3 Thế hệ thứ ba của cây tái sinh

R4 Thế hệ thứ tư của cây tái sinh

TAE Tris acetate EDTA

TTC 2,3,5, Trichloterazolium- chlorid

FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

IRRI Viện Nghiên cứu lúa gạo quốc tế

MỤC LỤC

Trang

Danh mục các chữ viết tắt i

Mục lục ii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các hình v

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây lúa 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây lúa 3

1.1.2 Vị trí và tầm quan trọng của cây lúa 4

1.1.3 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam 5

1.1.4 Đặc điểm nông sinh học của cây lúa 7

1.2 Lạnh và cơ chế chịu lạnh ở thực vật 8

1.2.1 Tác động của lạnh lên thực vật 8

1.2.2 Cơ chế chịu lạnh của thực vật và khả năng khắc phục 10

1.2.3 Tác động của lạnh và tính chịu lạnh của cây lúa 11

1.3 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích hệ gen thực vật 12

1.3.1 Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) 12

1.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic ADN) 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu nghiên cứu 16

2.1.1 Vật liệu thực vật 16

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 16

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp trồng và theo dõi ngoài đồng ruộng 17

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 17

2.2.3 Phương pháp phân tích hóa sinh 18

2.2.4 Phương pháp phân tích sinh lý 20

2.2.5 Phương pháp sinh học phân tử 22

2.2.6 Xử lí kết quả và tính toán số liệu 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Đặc điểm nông học của các dòng lúa chọn lọc thế hệ R3 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh 25

3.2 Đánh giá khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc thế hệ R4 30

3.2.1 Đánh giá khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc thế hệ R4 ở giai đoạn cây mạ 30

3.2.2 Đánh giá khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc thế hệ R4 ở mức độ mô sẹo 34

3.3 Đánh giá chất lượng hạt của các dòng chọn lọc thế hệ R4 thông qua một số chỉ tiêu hóa sinh 36

3.4 Kết quả phân tích đa hình ADN của các dòng và giống gốc bằng kỹ thuật RAPD 38

3.4.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá lúa của các dòng và giống gốc 38

3.4.2 Phân tích đa hình bằng kỹ thuật RAPD 39

3.4.3 Mối quan hệ di truyền giữa các dòng và giống gốc 47

3.4.4 Nhận xét tính đa hình ADN hệ gen của 6 dòng thế hệ R4 có nguồn gốc từ giống XCH bằng kỹ thuật RAPD 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lúa gạo so với 3 loại hạt ngũ cốc 5 Bảng 2.1 Đặc điểm của giống Xuân Châu Hương 16 Bảng 2.2 Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 24 Bảng 3.1 Đặc điểm nông học và mức độ biến dị của các dòng chọn lọc thế hệ R3.

28

Bảng 3.2 Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh ở 40

C± 0,50C trong 32 giờ ở giai đoạn cây mạ 3 lá của các dòng chọn lọc thế hệ R4 31

Bảng 3.3 Hàm lượng diệp lục trong lá lúa sau khi xử lý lạnh ở 120

C ± 0,50C ở giai đoạn mạ 3 lá của các dòng chọn lọc thế hệ R4 32

Bảng 3.4 Khả năng tạo mô sẹo và tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý lạnh ở

50C ± 0,50C và nuôi phục hồi 3 tuần 35

Bảng 3.5 Giá trị OD 485 nm của mô sẹo các dòng lúa nghiên cứu 36 Bảng 3.6 Hàm lượng protein, lipit và đường khử trong hạt của các dòng chọn lọc

và giống gốc 37

Bảng 3.7 Tổng số băng ADN được nhân bản của 7 mẫu lúa khi phân tích với 10

mồi ngẫu nhiên 39

Bảng 3.8 Phân tích đa hình về băng ADN được nhân bản 40 Bảng 3.9 Thống kê các băng ADN được nhân bản trong phản ứng RAPD với 6 mồi

ngẫu nhiên 47

Bảng 3.10 Hệ số đồng dạng di truyền của các dòng lúa thế hệ R4 và giống gốc

XCH 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Các dòng chọn lọc R3 có nguồn gốc từ giống XCH 25

Hình 3.2 Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh 40C± 0,50C ở giai đoạn cây mạ 3 lá của các dòng nghiên cứu 31

Hình 3.3 Hàm lượng diệp lục của các dòng sau khi xử lý lạnh ở 120C±0,50C 33

Hình 3.4 Ảnh điện di ADN tổng số tách từ 7 mẫu lúa 38

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M1 41

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M2 42

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M4 43

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M7 44

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M14 45

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M18 46

Hình 3.11 Sơ đồ so sánh các dòng thế hệ R4 và giống gốc XCH ở mức độ phân tử 49

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế giới Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước Châu Á Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam là một trong những cái nôi của nền văn minh lúa nước Đã

từ lâu, cây lúa trở thành cây lương thực chủ yếu có ý nghĩa quan trọng trong nền kinh tế và xã hội nước ta Theo thống kê năm 2010, xuất khẩu gạo được đánh giá đạt kỷ lục cả về khối lượng và giá trị [36] Lượng gạo xuất khẩu cả năm 2010 ước đạt 6,88 triệu tấn, kim ngạch là 3,23 tỷ USD, so cùng kỳ năm trước tăng 15,4% về lượng và tăng tới 21,2% về giá trị Bình quân giá gạo xuất khẩu đạt 468 USD/tấn, tăng 5,02% so với năm trước Tuy nhiên, việc mở rộng các khu đô thị, khu công nghiệp, xây dựng giao thông… làm cho diện tích đất nông nghiệp, đặc biệt là đất trồng lúa ngày càng bị thu hẹp Năm 2007 diện tích trồng lúa ở nước ta là 7201,0 nghìn ha giảm so với năm 2000 là 7666,3 nghìn ha (theo niên giám thống kê 2007),

từ đó dẫn đến giảm sản lượng lúa Đến năm 2008 diện tích trồng lúa của cả nước là khoảng 8542,0 ha với diện tích này năng suất lúa có tăng lên và đến năm 2009 sản lượng lúa đạt 38,7 triệu tấn [36]

Để tạo được những giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu cao với điều kiện môi trường, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó có phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong những năm gần đây, khí hậu thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng đang có những biến đổi bất thường Theo dự báo, Việt Nam là một trong 5 nước chịu ảnh hưởng nặng nề nhất của biến đổi khí hậu, các hiện tượng thời tiết bất thường xảy

ra liên tục (nóng, lạnh, hạn hán, bão lụt ) Ở nước ta, đặc biệt khu vực miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ, về mùa đông do ảnh hưởng của những đợt gió mùa đông bắc, nhiệt độ xuống thấp và có những đợt rét đậm, rét hại kéo dài

đã gây ra tác hại rất lớn cho cây lúa, đặc biệt là giai đoạn cây mạ và lúa mới cấy của

vụ Đông xuân Đây chính là nguyên nhân làm giảm năng suất lúa của vùng [1][4]

Để mở rộng diện tích và nâng cao năng suất lúa, đặc biệt lúa vụ Đông xuân cần có những giống có khả năng chịu lạnh cao Việc chọn tạo các dòng lúa có khả năng chịu lạnh phù hợp với các tỉnh thuộc khu vực miền núi phía Bắc là một đòi hỏi của thực tiễn Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh giống Xuân Châu Hương”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tuyển chọn được dòng lúa ưu việt về đặc điểm nông học, chất lượng hạt và khả năng chịu lạnh

- Xác định sự sai khác hệ gen của các dòng chọn lọc so với giống gốc

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích đặc điểm nông học của các dòng thế hệ R3 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh giống Xuân Châu Hương

- Đánh giá khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc ở mức độ mô sẹo và cây

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây lúa

Tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại cách đây ít nhất 130 triệu

năm và phát tán rộng khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa Hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa được đã thuần hoá là lúa

châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza glaberrima) [8]

Lúa châu Phi đã được gieo trồng trong khoảng 3500 năm Trong khoảng thời

gian từ 1500 trước Công Nguyên đến 800 trước Công Nguyên thì Oryza glaberrima

đã lan rộng từ trung tâm xuất phát của nó là lưu vực châu thổ sông Niger Tuy nhiên, nó không được mở rộng thậm chí còn suy giảm do các giống châu Á [8]

Tổ tiên của lúa châu Á (Oryza sativa) là các dạng lúa hoang dại Oryza fatua,

Oryza off Cinalis, Oryza minuta phổ biến có nguồn gốc tại khu vực xung quanh

vùng Đông Nam Á Hiện nay đây là giống lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới Vùng Đông Nam Á là quê hương của loại cây lương thực này, là nơi khai sinh nền nông nghiệp đa dạng rất sớm của thế giới [8]

Lúa là cây họ Hòa thảo hay họ Lúa (Poaceae hay dưới danh pháp khác là

Gramineae), chi Oryza Có nhiều ý kiến khác nhau về phân loại lúa, có tác giả chia

làm 23 loài, có tác giả chia làm 18 – 19 loài phân bố ở nhiều nơi trên thế giới

Hiện nay, các giống lúa trồng phổ biến trên thế giới là 2 loài phụ: Loài Oryza

sativa được thuần dưỡng ở Châu Á, nên được gọi là lúa trồng Châu Á Cây lúa Oryza glaberrima được thuần dưỡng ở Châu Phi nên được gọi là lúa trồng Châu Phi

Dựa trên cơ sở phân bố địa lý, hình thái cây và hạt, đặc điểm sinh học, loài

lúa Oryza sativa được chia làm ba loài phụ: Loài phụ Indica bao gồm các giống lúa

từ SriLanka, Trung Quốc, Ấn Độ, Philippin, Việt Nam và nhiều nước khác ở vùng

nhiệt đới Loài phụ Japonica bao gồm các giống lúa từ miền Bắc Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên, tập trung ở vùng á nhiệt đới và ôn đới Loài phụ Javanica được

trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia [8]

Dựa vào điều kiện môi trường canh tác, đặc biệt là nước có thường xuyên ngập ruộng hay không, người ta phân biệt nhóm lúa rẫy (upland rice) hoặc lúa nước (lowland rice) Tùy theo đặc tính thích nghi với môi trường, người ta có lúa chịu phèn, lúa chịu úng, lúa chịu hạn, lúa chịu mặn Tuỳ theo chế độ nhiệt khác nhau,

người ta cũng phân biệt lúa chịu lạnh (các giống japonica), lúa chịu nhiệt (các giống

indica) [8]

1.1.2 Vị trí và tầm quan trọng của cây lúa

Gạo chứa rất nhiều dinh dưỡng, so với lúa mì, gạo có thành phần tinh bột và protein hơi thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chất béo hơn Ngoài ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo hơn lúa mì do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì

Về mặt dinh dưỡng, lúa gạo là loại cây lương thực giàu tinh bột, các axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế như Lyzin, Triptophan, Threonine , nhiều loại vitamin như B1, B6, B12 [8]

Về mặt sử dụng, lúa gạo là cây cung cấp lương thực chính cho các bữa ăn hàng ngày của người Việt Nam Ngoài ra gạo còn dùng để chế biến nhiều loại bánh, làm môi trường để nuôi cấy niêm khuẩn, men, cơm mẻ,…

Cám gạo do chứa nhiều protein, chất béo, chất khoáng, vitamin, nhất là vitamin nhóm B, nên được dùng làm bột dinh dưỡng trẻ em và điều trị người bị bệnh phù nề Cám là thành phần cơ bản trong thức ăn gia súc, gia cầm…

Trấu ngoài công dụng làm chất đốt, chất độn chuồng còn dùng làm ván ép, vật liệu cách nhiệt, cách âm, chế tạo carbon và silic….[8]

Nước ta đang trú trọng vào trồng lúa nước vì không những đảm bảo lương thực mà còn là sản phẩm xuất khẩu mang lại hiệu quả kinh tế cao (đứng thứ hai trên thế giới về xuất khẩu gạo) sản xuất được 5,6 triệu tấn gạo mang lại 2 tỷ 266 triệu USD Sản xuất lúa gạo mang lại hiệu quả cao cho nông dân, tăng thu nhập, tăng GDP…[8]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lúa gạo so với 3 loại hạt ngũ cốc [8]

Chỉ tiêu (Tính trên trọng lượng khô)

1.1.3 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam

1.1.3.1 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới

Trên thế giới, lúa chiếm một vị trí quan trọng, đặc biệt ở vùng Châu Á Thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO, 2008) cho thấy, có 114 nước trồng lúa, trong đó 18 nước có diện tích trồng lúa trên 1.000.000 ha tập trung ở Châu Á, 31 nước có diện tích trồng lúa trong khoảng 100.000 ha - 1.000.000 ha Trong đó có 27 nước có năng suất trên 5 tấn/ha, đứng đầu là Ai Cập (9.7 tấn/ha), Úc (9.5 tấn/ha), El Salvador (7.9 tấn/ha) [37]

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), năm 2011 sản lượng lúa đạt đến 721 triệu tấn hay 481 triệu tấn gạo, tăng 3% hay 24 triệu tấn so

với 2010 Trong đó, châu Á sản xuất 651 triệu tấn lúa (435

mức độ thấp hơn từ Bangladesh, Hàn Quốc, Nhật Bản, Pakistan và Việt Nam

(17 triệu tấn gạo), cao hơn 3% năm 2010 Theo tổ chức FAO, sản xuất lúa gạo thế giới năm 2012 tăng khoảng 2,4% đạt đến

738 triệu tấn lúa, nhưng giao dịch gạo thế giới sẽ giảm bớt 1% ở mức 33,8 triệu tấn gạo, do Thái Lan giảm số lượng xuất khẩu 20% và một số nước khác cùng có khuynh hướng này [35]

1.1.3.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây lúa là cây lương thực chủ yếu, có ý nghĩa quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Cây lúa là cây lương thực có diện tích, năng suất và sản lượng lớn nhất so với các cây lương thực khác

Theo thống kê của FAO năm 2008, Việt Nam có diện tích lúa khoảng 7,4 triệu ha, đứng thứ 7 sau các nước có diện tích lúa trồng nhiều ở Châu Á theo thứ tự

Ấn Độ (xấp xỉ 44,0 triệu ha), Trung Quốc (xấp xỉ 29,5 triệu ha), Indonesia (xấp xỉ 12,3 triệu ha), Bangladesh (xấp xỉ 11,7 triệu ha), Thái Lan (xấp xỉ 10,2 triệu ha), Myanmar (xấp xỉ 8,2 triệu ha) Việt Nam có năng suất 5,2 tấn/ha đứng thứ 24 trên thế giới sau Ai Cập (9,7 tấn/ha) Úc (9,5 tấn/ha) El Salvador (7,9 tấn/ha), đứng đầu khu vực Đông Nam Á và đứng thứ 4 trong khu vực châu Á sau Hàn Quốc (7,4 tấn/ha), Trung Quốc (6,6 tấn/ha), Nhật (6,5 tấn/ha) [37]

Sản lượng gạo Việt Nam xuất khẩu khá ổn định trên 4,5 triệu tấn từ năm 2005-2008 và có bước đột phá vào năm 2009 Cụ thể, mùa vụ 2010-2011, Việt Nam xuất khẩu 7 triệu tấn gạo trong tổng sản lượng 26,37 triệu tấn so với 6,73 triệu tấn trong mùa vụ 2009-2010 và vươn lên đứng thứ 2 thế giới về xuất khẩu gạo, sau Thái Lan Theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA), mùa vụ 2011-2012 Việt Nam vẫn duy trì mức xuất khẩu gạo khoảng 7 triệu tấn Nếu như mùa vụ 2009-2010 xuất khẩu gạo Việt Nam đạt mức kỷ lục thì đến mùa vụ 2011-2012 sản lượng xuất khẩu đã vượt mức kỷ lục này và đạt trên 7 triệu tấn và nâng kim ngạch xuất khẩu gạo lên hơn 3,5 tỷ USD, tăng 20% so với cùng kỳ vụ 2009-2010 [38]

Thị trường xuất khẩu chính của Việt Nam mùa vụ 2010-2011 chủ yếu là các quốc gia châu Á chiếm khoảng 67,6% như Trung Quốc, Philippines, Malaysia, Indonesia, Đứng thứ 2 là thị trường châu Phi với 22,6% Theo Hiệp hội lương thực Việt Nam (VFA), năm 2012, châu Á vẫn là thị trường xuất khẩu chính của Việt Nam chiếm trên 67,5% tổng lượng gạo xuất khẩu, tiếp đến là châu Phi (24,7%), châu Mỹ (4,7%), Nếu gạo của Việt Nam có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu của những quốc gia đòi hỏi chất lượng cao thì có thể chinh phục các thị trường như Nhật Bản, Hàn Quốc Tuy nhiên, năm 2013, xuất khẩu gạo sẽ gặp nhiều khó khăn hơn Vì vậy, theo VFA xuất khẩu gạo của Việt Nam sẽ đẩy mạnh sang một số quốc gia đặc biệt là các quốc gia châu Phi, Trung Quốc, là những quốc gia nhập khẩu hàng đầu của Việt Nam trong năm 2012 [38]

1.1.4 Đặc điểm nông sinh học của cây lúa

Cây lúa thuộc họ Hòa thảo, chi Oryza, họ một lá mầm Lúa là cây thân thảo

sinh sống hàng năm Cây lúa nước có bộ nhiễm sắc thể là 2n = 24 Cây lúa bao gồm các bộ phận chính là: rễ, thân, lá, bông và hạt Thời gian sinh trưởng của các giống dài ngắn khác nhau khoảng 60-250 ngày tùy theo giống ngắn ngày hay dài ngày, vụ lúa chiêm hay lúa mùa, cấy sớm hay cấy muộn Chu kỳ sinh trưởng, phát triển của lúa bắt đầu từ hạt lúa và kết thúc một chu kỳ của nó khi tạo ra hạt mới Đời sống cây lúa bắt đầu từ lúc hạt nảy mầm cho đến khi lúa chín Có thể chia làm 3 giai đoạn chính: giai đoạn tăng trưởng (sinh trưởng sinh dưỡng), giai đoạn sinh sản (sinh dục) và giai đoạn chín [8]

Cây lúa thích nghi rất rộng với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau từ vĩ độ

350 Nam – 530 Bắc Điều kiện sinh thái có ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống cây lúa,

nó quyết định loại hình cây lúa, giống lúa, thời vụ …

Nhiệt độ có tác dụng quyết định đến tốc độ sinh trưởng của cây lúa nhanh hay chậm, tốt hay xấu Trong phạm vi giới hạn (20 – 300

C), nhiệt độ càng tăng cây lúa phát triển càng mạnh Nhiệt độ thích hợp nhất cho cây lúa là 26 – 280

C Nhiệt

độ trên 400 C hoặc dưới 170

C cây lúa tăng trưởng chậm lại Dưới 130C cây lúa ngừng sinh trưởng, nếu kéo dài 1 tuần lễ cây lúa sẽ chết Nhiệt độ thấp làm giảm

hoặc ngưng hẳn sự nảy mầm của hạt, làm mạ chậm phát triển, cây mạ ốm yếu, lá bị mất màu, trổ trễ, bông bị nghẹn, phần chót bông bị thoái hóa, sự thụ phấn bị đình trệ, khả năng bất thụ cao, hạt lép nhiều và chín kéo dài bất thường Ở nhiệt độ cao chót lá bị khô trắng, trên lá có những dãy và đốm bị mất màu, nở bụi kém, chiều cao giảm, số hạt trên bông giảm, bông lúa bị trắng, hạt thoái hóa nhiều, hạt bất thụ cao, hạt chắc giảm [8]

Ánh sáng ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng, phát triển và phát dục của cây lúa thông qua 2 phương diện: cường độ ánh sáng và độ dài chiếu sáng trong ngày Cường độ ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến sự quang hợp của cây lúa, thể hiện chủ yếu bằng năng lượng ánh sáng mặt trời chiếu trên đơn vị diện tích đất (lượng bức xạ) Lượng bức xạ trung bình từ 250 – 300 cal/cm2/ngày thì cây lúa sinh trưởng tốt

và quá trình quang hợp diễn ra mạnh

Nước có vai trò cực kỳ quan trọng đối với đời sống của cây lúa Nước là điều kiện để thực hiện các quá trình sinh lý trong cây lúa, vận chuyển dưỡng chất đến các bộ phận khác nhau của cây lúa Nếu thiếu nước thì cây lúa bị khô, lá lúa bị cuộn lại không phát triển Lượng mưa cần thiết cho cây lúa trung bình là 6 – 7 mm/ngày

và 8 – 9 mm/ngày trong mùa khô [8]

1.2 Lạnh và cơ chế chịu lạnh ở thực vật

Thực vật chỉ có thể sống được trong một ranh giới xác định của các điều kiện sinh thái như: nóng, lạnh, khô hạn, phèn mặn ở ngoài ranh giới này các yếu tố đó trở thành bất lợi và có khả năng gây ra tác hại cho thực vật Tuỳ theo loài và giống

mà mức độ thiệt hại có khác nhau: một số bị chết, một số khác bị tổn thương, nhưng một số hoàn toàn không bị ảnh hưởng gì Khả năng của thực vật ngăn ngừa thương tổn khi bị thương tổn gọi là tính chống chịu [1][26]

- Thực vật chịu lạnh là những thực vật có khả năng chống chịu nhiệt độ dương thấp

- Thực vật nhạy cảm với lạnh là những thực vật bị tổn thương, thậm chí bị chết ở nhiệt độ dương thấp

Cơ chế chịu băng giá tìm thấy ở nhiều loài thực vật bao gồm giống cây trồng

ôn đới và hàn đới, chủ yếu là tăng cường áp suất thẩm thấu và hạn chế khả năng sinh tinh thể nước đá khi gặp lạnh, đồng thời tăng cường sức bền của nguyên sinh chất kể cả khi nguyên sinh chất bị đóng băng

Những thực vật không có khả năng chống chịu lạnh (nhiệt độ dưới 100

C) khi nhiệt độ thấp lá cây bị héo mặc dù môi trường vẫn đủ nước do nhiệt độ thấp ức chế

sự hút nước của rễ và sự vận chuyển nước của hệ mạch Nhiệt độ thấp cũng gây ức chế quang hợp của lá làm giảm hô hấp, ức chế các quá trình tổng hợp nhất là tổng hợp protein do các enzyme hoạt động yếu Ở nhiệt độ thấp màng nguyên sinh chất

bị tổn hại làm tăng tính ngoại thấm nên thất thoát chất dinh dưỡng của tế bào Ngoài

ra, nhiệt độ thấp còn ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của bộ rễ Sự hút nước

và chất khoáng bị giảm mạnh làm cho cây thiếu nước và chất dinh dưỡng [2]

Khi gặp lạnh độ nhớt chất nguyên sinh tăng mạnh làm cản trở các hoạt động sống trong tế bào Hệ thống màng sinh học trong chất nguyên sinh bị thương tổn Đây có thể xem là biến đổi quan trọng nhất có thể gây ra sự chết cho cây Đối với thực vật kém chịu lạnh thì nhiệt độ hạ thấp làm thay đổi trạng thái của màng từ trạng thái lỏng, rất linh động, hoạt động sống mạnh, chuyển sang trạng thái đông đặc lại kém linh động và không duy trì hoạt động bình thường Màng các bào quan như lục lạp, ty thể từ đó ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sinh lý của cây như quang hợp, hô hấp Ở các cây không chịu lạnh các lipit của màng có tỷ lệ chuỗi axit béo bão hòa cao hơn cây chịu lạnh, do đó gặp lạnh màng có khuynh hướng đổi thành trạng thái bán tinh thể Khi tính lỏng của màng kém, các protein của màng không hoạt động bình thường dẫn đến hậu quả xấu cho sự vận chuyển các chất, sự biến đổi năng lượng và hoạt động enzyme [1] [4]

Vì vậy, yếu tố nhiệt độ bất lợi có tác động không nhỏ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng gạo, đặc biệt là ảnh hưởng của lạnh

1.2.2 Cơ chế chịu lạnh của thực vật và khả năng khắc phục

Các nghiên cứu trước đây đều cho rằng bất cứ một sự giảm nào về độ nhớt chất nguyên sinh cũng làm tăng tính chống chịu của tế bào với nhiệt độ thấp Khi gặp nhiệt độ thấp tế bào phải tạo ra và phân bố lại bên trong nguyên sinh chất, các chất có khả năng bảo vệ các vị trí nhạy cảm với lạnh và chống lại sự mất nước Trong mô của các giống cây chịu lạnh tích tụ nhiều đường hơn các giống kém chịu lạnh Khuynh hướng của tế bào trong quá trình thích nghi với lạnh là tích luỹ các chất làm tăng áp suất thẩm thấu của tế bào và các chất kém linh hoạt làm giảm quá trình sinh trưởng [2]

Hiện nay có nhiều công trình đi sâu vào nghiên cứu cơ chế chịu lạnh ở mức

độ gen Nhiệt độ thấp trước hết làm thay đổi hoạt động của một số gen, một số loại protein nhanh chóng được sinh tổng hợp [30][31] Lê Trần Bình và cs (1989) đã phân tích thành phần protein ở các giống lúa khi bị lạnh tác động và thấy rằng: ở các giống lúa chịu lạnh có một số protein mới xuất hiện, một số khác hàm lượng giảm xuống, hiện tượng này không thấy ở các giống lúa nhạy cảm với lạnh Ở mức

độ phân tử, khi gặp lạnh hoạt động của các enzyme cung cấp năng lượng như ATPase của tonoplas tỏ ra bền vững ở những giống lúa chống chịu [1] Tính chất của hệ thống màng nguyên sinh nói chung bị biến đổi dưới tác động của lạnh, những giống cây trồng chịu lạnh thì những biến động đó không làm cho các hoạt động trao đổi chất ngưng trệ hoàn toàn

Nghiên cứu gần đây của Refer và cs, thuộc Trung Tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc gia Nhật tại khu vực Hokkaido Region đã hình thành được bản đồ di truyền xác định vị trí gen liên quan đến tính chịu lạnh Đó là gen Ctb mã hóa F-box protein và ser/thr protein kinase F-box protein này đã thể hiện trong gié lúa non, trong khi gen ser/thr protein kinase được tìm thấy trong lá lúa và ở những gié lúa chưa trưởng thành Hai gen này được dòng hóa từ giống lúa chịu lạnh lai với giống

nhạy cảm với lạnh Tính chống chịu lạnh của những clones như vậy thể hiện trong điều kiện nhiệt độ thấp được đo bằng tỉ lệ thụ tinh của hoa lúa [39] Yun Tian thuộc Viện Hàn Lâm nông nghiệp Trung Quốc và nhóm nghiêm cứu đã kiểm tra sự thể hiện của protein TERF2, một thành viên của họ protein ERF, về tính chịu lạnh của cây lúa Kết quả cho thấy sự thể hiện TERF2 sẽ có nhiều thuận lợi cho cây lúa Chính protein này làm tăng hàm lượng diệp lục và giảm các loại oxid hóa (ROS: reactive oxygen species) cũng như làm giảm mức độ của MDA (malondialdehyde) Đây là những chỉ thị của stress thuộc về oxidative gây ra thiệt hại cho cấu trúc tế bào [40]

Như vậy thực vật thích nghi với lạnh là nhờ một số cơ chế như: giảm độ nhớt chất nguyên sinh khi gặp lạnh, tích luỹ các hợp chất có khả năng bảo vệ tế bào, giảm sinh trưởng, thay đổi hoạt tính enzyme và thành phần protein Các biểu hiện này là kết quả hoạt động của các gen liên quan tới tính chịu lạnh

1.2.3 Tác động của lạnh và tính chịu lạnh của cây lúa

Nhiệt độ có tác dụng quyết định đến tốc độ sinh trưởng của cây lúa nhanh hay chậm, tốt hay xấu Cây lúa thuộc nhóm cây nhạy cảm với lạnh, nhất là đối với những giống có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới Những tổn thương do lạnh gây ra có thể thấy được ở nhiều giai đoạn tăng trưởng khác nhau của lúa: làm giảm hoặc ngưng hẳn sự nảy mầm của hạt, làm mạ chậm phát triển, cây mạ ốm yếu, lùn lại, lá bị mất màu, trổ trễ, bông bị nghẹn, phần chót bông bị thoái hóa, sự thụ phấn

bị đình trệ, khả năng bất thụ cao, hạt lép nhiều và chín kéo dài bất thường [8]

Hiện tượng bất thụ do lạnh được xem như vấn đề nghiêm trọng nhất làm năng suất lúa giảm rất nhiều Đối với kiểu gen cây lúa mẫn cảm với tính trạng bất thụ do lạnh thì giai đoạn tăng trưởng nhạy cảm nhất là giai đoạn làm đòng Hiện tượng phình to của tế bào hạt phấn được xem như phản ứng của kiểu gen bất thụ đối với sự tổn thương do lạnh Những giống lúa chống chịu lạnh thường sản sinh ra số lượng hạt phấn nhiều hơn giống nhiễm lạnh Số lượng hạt phấn là một yếu tố quan trọng trong cơ chế chống chịu lạnh Người ta còn ghi nhận số lượng hạt phấn tương quan thuận với chiều dài túi phấn, và chiều dài túi phấn có tương quan với hiện tượng chống chịu lạnh [1][4]

Phạm vi nhiệt độ mà cây lúa có thể chịu đựng được tùy theo giống lúa, giai đoạn sinh trưởng, thời gian bị ảnh hưởng là tình trạng sinh lý của cây lúa Nhiệt độ dưới 130C cây lúa ngừng sinh trưởng, nếu kéo dài 1 tuần lễ cây lúa sẽ chết Ở giai đoạn trổ bông, nếu gặp nhiệt độ dưới 200C thì kết quả thụ phấn sẽ giảm và tỷ lệ hạt lép sẽ tăng đáng kể Nhiệt độ dưới 150C ức chế tổng hợp chlorophyll, phân hủy lục lạp, sinh trưởng kém Nhiệt độ giảm xuống 100C thì rễ bị tổn thương, cả thân bị héo [2]

Nhìn chung tác động của nhiệt độ thấp lên cây lúa có thể chia theo các mức sau [4]:

Nhiệt độ từ 15 - 200C: thụ phấn kém, tăng tỷ lệ lép; và mẩy kém, giảm năng suất

Nhiệt độ từ 10 - 150C: ức chế khả năng tổng hợp diệp lục, phân hủy lục lạp, sinh trưởng kém

Nhiệt độ dưới 100C: chức năng rễ bị tổn thương, lá và cả thân bị héo, cây chết, mạ nhìn mũi chông, có thể ngừng sinh trưởng hoàn toàn

1.3 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích chống chịu lạnh

1.3.1 Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR)

Kỹ thuật PCR, hay còn gọi là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase hoặc phản ứng chuỗi tổng hợp ADN, do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm

1985 Kỹ thuật PCR đã cho phép khuếch đại in vitro có chọn lọc bằng tạo dòng in

vitro mà không cần sự hiện diện của tế bào, khắc phục được nhược điểm thao tác

phức tạp và cần thời gian dài của kỹ thuật tạo dòng in vivo Nhờ phản ứng PCR,

một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong bộ gen được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn đó đã biết

Với độ nhạy rất cao, thao tác đơn giản, PCR được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực quan trọng trong các nghiên cứu phục vụ nhiều mục đích khác nhau [10]

Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR giúp ích hữu hiệu cho việc xác định trình tự nucleotid của các đoạn ADN được nhân; có thể sử dụng PCR để tách dòng những đoạn ADN đặc hiệu; PCR giúp phát hiện đột biến, nghiên cứu mARN

hoặc tạo các đột biến gen, cho phép phân tích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ; giúp nghiên cứu quá trình tiến hóa ở mức phân tử

Trong y học, PCR có thể chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ virut đến vi khuẩn và các bệnh do nấm, kể cả HIV-AIDS, chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị ung thư …

Trong khoa học hình sự, kỹ thuật PCR là không thể thiếu, nó giúp chẩn đoán nhanh, chính xác thủ phạm chỉ từ một vết máu khô, một sợi tóc hoặc một sinh phẩm nào đó mà thủ phạm để lại trên hiện trường Ngoài ra kỹ thuật này còn cho phép xác định chính xác quan hệ huyết thống cha-con, ông-cháu v.v… cũng chỉ trong vài giờ

Trong bảo vệ môi trường, việc xác định mức độ ô nhiễm sinh học có thể thực hiện rất hiệu quả và nhanh chóng bằng kỹ thuật PCR

Những ứng dụng thực tiễn đa dạng của phản ứng chuỗi tổng hợp ADN thật

vô tận Phản ứng chuỗi tổng hợp ADN thật sự đã đưa lại một cuộc cách mạng trong lĩnh vực ứng dụng thực tế của sinh học phân tử Ngày nay có thể nói mọi lĩnh vực nghiên cứu sinh học đều sử dụng kỹ thuật PCR

Honghong Hu và cs (2004) thông qua điện di kiểm tra sản phẩm PCR đã biểu

hiện thành công gen NAM, ATAF và CUC (viết tắt là NAC) giúp làm tăng tính

chống hạn ở cây lúa Zhonghan số 5 [32] Benze Xiao và cs (2007) đã nghiên cứu

chuyển gen LEA 3-1 vào giống lúa Zhonghua 11 Kết quả điện di sản phẩm của

phản ứng PCR cho thấy, các dòng lúa chuyển gen có khả năng chịu mặn cao hơn so với đối chứng [27]

Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Tâm (2004) đã phát hiện trực tiếp gen dehydrin

bằng cách tiến hành phản ứng PCR trên khuôn mẫu ADN được tách chiết từ dòng chọn lọc HR128 chịu nóng và giống gốc CS4, sử dụng cặp mồi TP1 và TP2 [20] Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), thông qua kiểm tra ảnh điện di sản phẩm PCR từ

khuôn cADN tổng hợp từ ARN tổng số, đã phân lập được gen P5CS của 2 giống đậu tương DT84 và SL5, tạo đột biến ở bộ ba có vị trí thứ 125 của gen P5CS của

giống SL5 loại bỏ ức chế ngược đồng thời chuyển thành công vào cây đậu tương Việt Nam [11]

Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật PCR đòi hỏi phải biết rõ trình tự ADN khuôn mẫu để từ đó tổng hợp các đoạn mồi Hiện nay các nhà sinh học phân tử đã cải tiến

kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên mà không cần biết trước trình tự ADN [34] Đó là kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic ADN)

1.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic ADN)

Kỹ thuật RAPD được Welsh, Mc Clelland và Williams được phát hiện năm

1990 Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn ADN có trình tự bổ sung với trình tự của các mồi Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện như nhau

sẽ tạo ra số lượng các đoạn ADN bằng nhau và chiều dài các đoạn ADN tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên

sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn ADN khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử (marker) trội [5]

Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước:

- Tách chiết ADN tổng số, nhân ADN bằng máy PCR

- Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid

- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu [5]

Từ khi ra đời, kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền cũng như lập các chỉ thị phân tử cho nhiều đối tượng khác nhau như: đậu tương [15], lúa nước [7], [9], [20], [24], lúa cạn [23]… Ở Việt Nam, nghiên cứu

đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa Ngoài ra kỹ thuật RAPD còn được áp dụng xây dựng bản đồ gen [13] Nguyễn Thị Tâm và cs (2008) đã tiến hành phản ứng RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên thì có 6/10 mồi biểu hiện tính đa hình Qua phân tích các phân đoạn ADN được nhân bản so với giống gốc, các dòng lạc chọn lọc từ mô sẹo

mất nước đã có những thay đổi trong bộ gen và dòng D18 có sự sai khác nhiều nhất (0,2055) [21] Năm 2010, Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cs cũng tiến hành phản ứng RAPD với 10 mồi trên 14 giống ngô nếp địa phương Hệ số tương đồng di truyền của 14 giống ngô trên dao động từ 0,68 - 0,90 và chia làm hai nhóm: nhóm I gồm các giống: TL, ÔL, TQ, ĐP, VN, CB, Slo, SL, T26, SLV; nhóm II gồm: LC, SLT,

YB, T4 [22]

Hiện nay, trong chọn giống người ta không chỉ quan tâm đến những tính trạng hình thái, năng suất và chất lượng, mà còn quan tâm đến bản chất sinh học phân tử của sự thay đổi các tính trạng Một số kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng để phân tích hệ gen, trong đó có kỹ thuật RAPD

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Bảng 2.1 Đặc điểm của giống Xuân Châu Hương

Giống Thời gian sinh

trưởng (ngày)

Chiều cao cây (cm)

Số hạt chắc/bông

Khối lượng

1000 hạt (g)

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng gồm có: 2,4 axit dichlorphenoxyacetic

(2,4D), K3Fe(Cn)6, Fe2(SO4)3, H2SO4, tinh bột chuẩn, gelatin 10%, axit sunfosalysilic 20%, agar, cồn, các hoá chất tách chiết ADN, hoá chất chạy RAPD, mồi,

- Thiết bị: Cân điện tử santorius, tủ sấy carbolite, máy quang phổ Uvis Cintra

40, máy li tâm lạnh Hettich, nồi hấp cao áp, box cấy, máy PCR, máy điện di (Biorad), máy ổn định nhiệt… có nguồn gốc từ Anh, Đức

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Các thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành ở vụ mùa năm 2012 tại xã Linh Sơn, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên

- Các thí nghiệm nuôi cấy mô - tế bào và phân tích sinh lý, sinh hóa được tiến hành tại phòng Công nghệ tế bào – Khoa Sinh - KTNN – Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên

- Phân tích sinh học phân tử được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp trồng và theo dõi ngoài đồng ruộng

Các dòng ở thế hệ R3 và giống gốc được trồng riêng và chăm sóc trong cùng một điều kiện Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc và giống gốc qua các giai đoạn phát triển trong một vụ gieo trồng thông qua các chỉ tiêu nông học: chiều cao cây, số bông/khóm, chiều dài bông, số hạt chắc/bông, kích thước hạt, khối lượng 1000 hạt, thời gian sinh trưởng Các chỉ tiêu được đánh giá theo tiêu chuẩn IRRI [12]

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật

2.2.2.1 Tạo mô sẹo từ hạt lúa

- Khử trùng hạt: Hạt lúa chín được bóc vỏ trấu và khử trùng bằng cồn 70%

trong 1 phút, lắc nhẹ trong nước Javen 60% trong 20 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng

- Tạo mô sẹo: Hạt gạo sau khi khử trùng được cấy vào bình tam giác có môi

trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [28], bổ sung sucrose 3%, agar 0,8%, 2,4D 2mg/l, pH = 5,8 Mỗi bình cấy 30 hạt Nuôi 1 tuần tối, 2 tuần sáng dưới ánh sáng đèn trong phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux Sau 3 tuần tiến hành đánh giá khả năng tạo mô sẹo theo công thức:

Trong đó: Ci: Tỷ lệ tạo mô sẹo

NCF: Số hạt tạo mô sẹo

Nt: Tổng số hạt nuôi cấy

2.2.2.2 Xác định ảnh hưởng của lạnh đến mô sẹo của các dòng chọn lọc

- Xử lý mô sẹo: Mô sẹo tạo thành được chuyển sang môi trường MS có

sucrose 3%, 2,4D 1mg/l, 0,8% agar, pH = 5,8 và được đặt trong tủ lạnh có nhiệt độ

50C ± 0,50C xử lý trong thời gian 9 ngày Đối chứng không xử lý lạnh

- Xác định tỷ lệ sống sót của mô sẹo: Mô sẹo sau khi được xử lý trong tủ

lạnh 50

C ± 0,50C được nuôi phục hồi trong điều kiện 220

C, ánh sáng 2000 lux và đánh giá tỷ lệ sống sót sau 3 tuần

Tỉ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá theo công thức:

Trong đó: Sv: Tỷ lệ mô sống sót (%)

Nsv: Số mô sống sót

Nt: Tổng số mô xử lý

- Xác định sức sống của tế bào và mô bằng phương pháp nhuộm TTC

(2,3,5, Trichlo tetrazolium chlorit): Hạt của các dòng chọn lọc và giống gốc được

bóc vỏ trấu và tiến hành nuôi cấy tạo mô sẹo như mục 2.2.2.1 Mô sẹo thu được tiến hành xử lý lạnh ở nhiệt độ 50

C ± 0,50C trong thời gian 9 ngày Sau khi nuôi phục hồi 3 tuần, tiến hành xác định sức sống của tế bào mô sẹo

Xác định sức sống của tế bào mô sẹo bằng phương pháp nhuộm TTC theo Towill và CS (1975) [33], bao gồm các bước sau :

- Bước 1: Cân 0,6g TTC pha loãng trong 25 ml nước cất, dung dịch MS pha

loãng 10 lần

- Bước 2: Cân 10 - 15g mô sẹo cho vào ống nghiệm, thêm 0,5ml dung dịch

MS pha loãng và 0,25 ml dung dịch TTC, để 12 giờ trong tối ở 250

C

- Bước 3: Dùng pipet gạn bỏ phần dung dịch trong ống nghiệm, rửa mô sẹo

đã nhuộm 2 lần bằng nước cất rồi cho 5ml cồn 90%, thuỷ phân ở nhiệt độ 600

C trong thời gian 1 - 2 giờ

- Bước 4: Dung dịch thu được đem đo ở bước sóng 485nm Đối chứng là cồn

(1) Cân 0,05g bột mẫu khô tuyệt đối cho vào ống eppendort (2ml), cho vào

1,5ml dung dịch đệm chiết photphat citrat (pH=10), lắc đều trong 10 phút, để ống

nghiệm ở 4oC trong vòng 24 giờ

(2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 4oC trong thời gian 30 phút, rồi thu dịch để

làm thí nghiệm Thí nghiệm lặp lại 3 lần

Dịch chiết được định mức lên 5ml bằng dung dịch đệm photphat citrat

(pH=10) và đo hấp thụ trên máy UV vis Cintra ở bước sóng 750nm với thuốc thử

foling

Hàm lượng protein được tính theo công thức:

%100(%)

m

HSPL A

X

Trong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô)

A: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng m: Khối lượng mẫu (mg)

2.2.3.2 Xác định hàm lƣợng lipit

Lipit tổng số được chiết bằng ete dầu hỏa (petroleum ether) Hàm lượng lipit

được xác định theo tài liệu của Nguyễn Văn Mùi (2001) [18]

Các bước tiến hành như sau:

(1) Cân 0,3g mẫu cho vào ống eppendort, cho 1,5ml Petroleum ether

(2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 4oC trong thời gian 30 phút

(3) Loại bỏ dịch trong, lặp lại quá trình 3 lần

(4) Sấy khô tuyệt đối và cân khối lượng mẫu còn lại sau khi chiết lipit

Hàm lượng lipit được tính bằng hiệu số của khối lượng mẫu trước và sau khi

chiết và được tính bằng % khối lượng khô

Hàm lượng lipit % =

A

B A

x 100%

Trong đó: A: Khối lượng mẫu ban đầu (mg)

B: Khối lượng mẫu sau khi loại lipit (mg)

2.2.3.3 Xác định hàm lượng đường khử

Hàm lượng đường được xác định theo phương pháp vi phân tích, mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [6]

Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, đường khử ferixianua kali thành kali

feroxianua với sự có mặt của gelatin, kali feroxianua kết hợp với sắt sunfat tạo thành phức chất màu xanh bền

Các bước tiến hành như sau:

(1) Đường khử được chiết bằng nước cất từ bột gạo khô (tuyệt đối) Sau đó

ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút ở 40C trong thời gian 30 phút, loại bỏ cặn, dịch trong giữ lại để nghiên cứu

(2) Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết đường và 2ml dung dịch kaliferixianua Lắc đều, đun cách thủy sôi trong 15 phút Sau đó để nguội

(3) Thêm vào ống nghiệm 4ml dung dịch hỗn hợp Fe2(SO4)3 0,1%: gelatin 10% theo tỉ lệ 20:1 Lắc đều và dẫn bằng nước cất đến mức 20ml

Hàm lượng đường trong dung dịch trên được xác định bằng đo quang phổ ở bước sóng 585nm theo đồ thị đường chuẩn glucoza

Hàm lượng đường khử được tính theo công thức:

%100(%)

m

HSPL b

a X

Trong đó: X: Hàm lượng đường khử (%)

a: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) b: Số ml dịch chiết

HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg)

2.2.4 Phương pháp phân tích sinh lý

2.2.4.1 Đánh giá khả năng chịu lạnh ở giai đoạn cây mạ 3 lá bằng phương pháp gây lạnh nhân tạo

- Chuẩn bị mẫu: Hạt lúa của một số dòng thế hệ R4 và giống gốc ngâm, ủ

cho nảy mầm dài 1cm thì chuyển vào hộp trồng cây đựng cát vàng rửa sạch Mỗi

hộp 45 - 50 mầm, 3 hộp cho mỗi giống Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với chế độ chăm sóc và điều kiện như nhau Hai ngày đầu tưới nước cho đủ ẩm, từ ngày thứ ba trở đi tưới dung dịch Knop, khi cây mạ được ba lá (9 - 10 ngày) thì tiến hành xử lý lạnh ở nhiệt độ 40

C ± 0,50C trong 32 giờ Chuyển cây ra ngoài sáng bình thường ở nhiệt độ 25 - 300

C Sau hai, ba ngày xác định mức độ bị hại

- Đánh giá mức độ bị hại do lạnh theo thang điểm từ 0 đến 5: 0: Không bị

hại, 1: đầu lá bị khô chết, 2: 1/3 đầu lá bị khô chết, 3: 1/2 đầu lá bị khô chết, 4: 3/4 lá bị

khô chết, 5: chết cả cây Tính giá trị trung bình của 50 cây mỗi dòng nhắc lại 3 lần

- Tỷ lệ thiệt hại do lạnh của cây mạ được xác định theo công thức:

%

a =

c n

b

( 0

Trong đó: a: Tỷ lệ thiệt hại do lạnh gây ra (%)

b: Trị số bị hại của mỗi cấp c: Trị số bị hại của cấp cao nhất

n0: Số cây của mỗi cấp bị hại n: Tổng số cây xử lý

Xác định khả năng chịu lạnh ở giai đoạn cây mạ theo phương pháp được mô

tả trong tài liệu của Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995) [2]

2.2.4.2 Ảnh hưởng của lạnh đến hàm lượng diệp lục a, b ở giai đoạn mạ

- Chuẩn bị mẫu: Hạt của các một số dòng thế hệ R4 và giống gốc được

ngâm, ủ và trồng giống như mục 2.2.4.1 Khi cây mạ được ba lá (9 – 10 ngày) thì tiến hành xử lý lạnh ở nhiệt độ 120

C ± 0,50C với ngưỡng thời gian 3 và 5 ngày rồi thu hoạch lá, tiến hành xác định hàm lượng diệp lục

- Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục được xác

định theo phương pháp Wintermans, De Mots mô tả trong sổ tay phân tích đất, nước, phân bón cây trồng (1998) [25]

Các bước tiến hành như sau:

+ Cân 0,1 g lá nghiền trong cồn ethanol 96%

+ Li tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi

+ Dịch thu được đem pha loãng 10ml rồi đo quang phổ hấp thụ trên máy quang phổ UV Visible ở bước sóng 665 nm và 649 nm

+ Hàm lượng diệp lục (mg/g lá tươi) được tính theo công thức:

1000

P

n V C A

Trong đó: C: nồng độ diệp lục tính ra (mg/l) (gồm có Ca, Cb, Ca+b)

Ca (mg/l) = 13,70 E665 – 5,76 E649

Cb (mg/l) = 25,80 E649 – 7,60 E665

Ca+b (mg/l) = 6,10 E665 + 20,04 E649P: Khối lượng mẫu (g)

V: Thể tích sắc tố rút được (ml) A: hàm lượng diệp lục (mg/g lá tươi)

2.2.5 Phương pháp sinh học phân tử

2.2.5.1 Tách chiết ADN tổng số từ lá lúa

Quy trình tách chiết và làm sạch ADN tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [29]

- Tiến hành: Hạt lúa R4 của 6 dòng từ thế hệ R3 và hạt lúa của giống gốc

được bóc vỏ và khử trùng, cấy hạt trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, mật độ cấy 20 hạt/ bình Sau 10 ngày thu lá, bảo quản ở tủ lạnh sâu -850C ADN tách từ lá non của lúa được thực hiện theo các bước sau:

(1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn

(2) Bổ sung 800 μl đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi (làm 2 lần)

(3) Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%,

H2O), trộn nhẹ Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng

(7) Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng

(8) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô

(9) Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ

(10) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần)

(11) Làm khô ADN bằng máy speed vac

(12) Hoà tan ADN trong H2O khử ion

Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của ADN

Phương pháp điện di ADN tổng số trên gel agarose

Điện di kiểm tra ADN tổng số của mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8% (0,8g agarose trong 100 ml dung dịch TAE 1X) Sản phẩm điện di được nhuộm bằng dung dịch ethydium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím

Dựa vào hình ảnh điện di có thể đánh giá độ tinh sạch của ADN trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết

Mỗi phản ứng PCR - RAPD được thực hiện trong 25 l dung dịch chứa: 10mM buffer PCR 1X; 2,5 mM MgCl2; 25 M mỗi loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP;

200 nM mồi; 0,125 đơn vị Taq polymerase và 10 ng ADN khuôn Phản ứng

PCR-RAPD thực hiện trong máy PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu trình nhiệt: Bước 1: 940C trong 3 phút; Bước 2: 920C trong 1 phút; Bước 3: 350

C trong 1 phút; Bước 4: 720

C trong 1 phút, từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 45 chu kì; Bước 5: 720C trong 10 phút; Bước 6: giữ ở 40C Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8%, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel