- Các thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành ở vụ mùa năm 2012 tại xã Linh Sơn, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên.
- Các thí nghiệm nuôi cấy mô - tế bào và phân tích sinh lý, sinh hóa được tiến hành tại phòng Công nghệ tế bào – Khoa Sinh - KTNN – Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên.
- Phân tích sinh học phân tử được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp trồng và theo dõi ngoài đồng ruộng
Các dòng ở thế hệ R3 và giống gốc được trồng riêng và chăm sóc trong cùng một điều kiện. Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc và giống gốc qua các giai đoạn phát triển trong một vụ gieo trồng thông qua các chỉ tiêu nông học: chiều cao cây, số bông/khóm, chiều dài bông, số hạt chắc/bông, kích thước hạt, khối lượng 1000 hạt, thời gian sinh trưởng. Các chỉ tiêu được đánh giá theo tiêu chuẩn IRRI [12].
2.2.2. Phƣơng pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 2.2.2.1. Tạo mô sẹo từ hạt lúa
- Khử trùng hạt: Hạt lúa chín được bóc vỏ trấu và khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, lắc nhẹ trong nước Javen 60% trong 20 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
- Tạo mô sẹo: Hạt gạo sau khi khử trùng được cấy vào bình tam giác có môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [28], bổ sung sucrose 3%, agar 0,8%, 2,4D 2mg/l, pH = 5,8. Mỗi bình cấy 30 hạt. Nuôi 1 tuần tối, 2 tuần sáng dưới ánh sáng đèn trong phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux. Sau 3 tuần tiến hành đánh giá khả năng tạo mô sẹo theo công thức:
Ci (%) = t CF N N 100% Trong đó: Ci: Tỷ lệ tạo mô sẹo
NCF: Số hạt tạo mô sẹo Nt: Tổng số hạt nuôi cấy
2.2.2.2. Xác định ảnh hƣởng của lạnh đến mô sẹo của các dòng chọn lọc
- Xử lý mô sẹo: Mô sẹo tạo thành được chuyển sang môi trường MS có sucrose 3%, 2,4D 1mg/l, 0,8% agar, pH = 5,8 và được đặt trong tủ lạnh có nhiệt độ 50C ± 0,50C xử lý trong thời gian 9 ngày. Đối chứng không xử lý lạnh.
- Xác định tỷ lệ sống sót của mô sẹo: Mô sẹo sau khi được xử lý trong tủ lạnh 50
C ± 0,50C được nuôi phục hồi trong điều kiện 220
C, ánh sáng 2000 lux và đánh giá tỷ lệ sống sót sau 3 tuần.
Tỉ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá theo công thức: (%) 100% t sv N N Sv Trong đó: Sv: Tỷ lệ mô sống sót (%) Nsv: Số mô sống sót Nt:Tổng số mô xử lý
- Xác định sức sống của tế bào và mô bằng phƣơng pháp nhuộm TTC
(2,3,5, Trichlo tetrazolium chlorit): Hạt của các dòng chọn lọc và giống gốc được
bóc vỏ trấu và tiến hành nuôi cấy tạo mô sẹo như mục 2.2.2.1. Mô sẹo thu được tiến hành xử lý lạnh ở nhiệt độ 50
C ± 0,50C trong thời gian 9 ngày. Sau khi nuôi phục hồi 3 tuần, tiến hành xác định sức sống của tế bào mô sẹo.
Xác định sức sống của tế bào mô sẹo bằng phương pháp nhuộm TTC theo Towill và CS (1975) [33], bao gồm các bước sau :
- Bước 1: Cân 0,6g TTC pha loãng trong 25 ml nước cất, dung dịch MS pha loãng 10 lần.
- Bước 2: Cân 10 - 15g mô sẹo cho vào ống nghiệm, thêm 0,5ml dung dịch MS pha loãng và 0,25 ml dung dịch TTC, để 12 giờ trong tối ở 250
C.
- Bước 3: Dùng pipet gạn bỏ phần dung dịch trong ống nghiệm, rửa mô sẹo đã nhuộm 2 lần bằng nước cất rồi cho 5ml cồn 90%, thuỷ phân ở nhiệt độ 600
C trong thời gian 1 - 2 giờ.
- Bước 4: Dung dịch thu được đem đo ở bước sóng 485nm. Đối chứng là cồn 90%.
2.2.3. Phƣơng pháp phân tích hóa sinh 2.2.3.1. Xác định hàm lƣợng protein
Định lượng protein theo phương pháp Lowry được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [6]. Dịch chiết chứa protein hòa tan được sử dụng để xác định hàm lượng protein. Dùng albumin huyết thanh bò để xây dựng đồ thị đường chuẩn, đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 750nm với thuốc thử foling.
(1) Cân 0,05g bột mẫu khô tuyệt đối cho vào ống eppendort (2ml), cho vào 1,5ml dung dịch đệm chiết photphat citrat (pH=10), lắc đều trong 10 phút, để ống nghiệm ở 4oC trong vòng 24 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 4oC trong thời gian 30 phút, rồi thu dịch để làm thí nghiệm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Dịch chiết được định mức lên 5ml bằng dung dịch đệm photphat citrat (pH=10) và đo hấp thụ trên máy UV vis Cintra ở bước sóng 750nm với thuốc thử foling.
Hàm lượng protein được tính theo công thức: % 100 (%) m HSPL A X
Trong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô) A: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml)
HSPL: Hệ số pha loãng m: Khối lượng mẫu (mg)
2.2.3.2. Xác định hàm lƣợng lipit
Lipit tổng số được chiết bằng ete dầu hỏa (petroleum ether). Hàm lượng lipit được xác định theo tài liệu của Nguyễn Văn Mùi (2001) [18].
Các bước tiến hành như sau:
(1) Cân 0,3g mẫu cho vào ống eppendort, cho 1,5ml Petroleum ether. (2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 4oC trong thời gian 30 phút. (3) Loại bỏ dịch trong, lặp lại quá trình 3 lần.
(4) Sấy khô tuyệt đối và cân khối lượng mẫu còn lại sau khi chiết lipit.
Hàm lượng lipit được tính bằng hiệu số của khối lượng mẫu trước và sau khi chiết và được tính bằng % khối lượng khô
Hàm lượng lipit % =
A B A
x 100% Trong đó: A: Khối lượng mẫu ban đầu (mg)
2.2.3.3. Xác định hàm lƣợng đƣờng khử
Hàm lượng đường được xác định theo phương pháp vi phân tích, mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [6].
Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, đường khử ferixianua kali thành kali
feroxianua với sự có mặt của gelatin, kali feroxianua kết hợp với sắt sunfat tạo thành phức chất màu xanh bền.
Các bước tiến hành như sau:
(1) Đường khử được chiết bằng nước cất từ bột gạo khô (tuyệt đối). Sau đó ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút ở 40C trong thời gian 30 phút, loại bỏ cặn, dịch trong giữ lại để nghiên cứu.
(2) Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết đường và 2ml dung dịch kaliferixianua. Lắc đều, đun cách thủy sôi trong 15 phút. Sau đó để nguội.
(3) Thêm vào ống nghiệm 4ml dung dịch hỗn hợp Fe2(SO4)3 0,1%: gelatin 10% theo tỉ lệ 20:1. Lắc đều và dẫn bằng nước cất đến mức 20ml.
Hàm lượng đường trong dung dịch trên được xác định bằng đo quang phổ ở bước sóng 585nm theo đồ thị đường chuẩn glucoza.
Hàm lượng đường khử được tính theo công thức: % 100 (%) m HSPL b a X
Trong đó: X: Hàm lượng đường khử (%)
a: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) b: Số ml dịch chiết
HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg)
2.2.4. Phƣơng pháp phân tích sinh lý
2.2.4.1. Đánh giá khả năng chịu lạnh ở giai đoạn cây mạ 3 lá bằng phƣơng pháp gây lạnh nhân tạo
- Chuẩn bị mẫu: Hạt lúa của một số dòng thế hệ R4 và giống gốc ngâm, ủ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hộp 45 - 50 mầm, 3 hộp cho mỗi giống. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với chế độ chăm sóc và điều kiện như nhau. Hai ngày đầu tưới nước cho đủ ẩm, từ ngày thứ ba trở đi tưới dung dịch Knop, khi cây mạ được ba lá (9 - 10 ngày) thì tiến hành xử lý lạnh ở nhiệt độ 40
C ± 0,50C trong 32 giờ. Chuyển cây ra ngoài sáng bình thường ở nhiệt độ 25 - 300
C. Sau hai, ba ngày xác định mức độ bị hại.
- Đánh giá mức độ bị hại do lạnh theo thang điểm từ 0 đến 5: 0: Không bị
hại, 1: đầu lá bị khô chết, 2: 1/3 đầu lá bị khô chết, 3: 1/2 đầu lá bị khô chết, 4: 3/4 lá bị khô chết, 5: chết cả cây. Tính giá trị trung bình của 50 cây mỗi dòng nhắc lại 3 lần.
- Tỷ lệ thiệt hại do lạnhcủa cây mạ được xác định theo công thức:
% a = c n b n ) 100 ( 0
Trong đó: a: Tỷ lệ thiệt hại do lạnh gây ra (%) b: Trị số bị hại của mỗi cấp
c: Trị số bị hại của cấp cao nhất n0: Số cây của mỗi cấp bị hại n: Tổng số cây xử lý
Xác định khả năng chịu lạnh ở giai đoạn cây mạ theo phương pháp được mô tả trong tài liệu của Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995) [2].
2.2.4.2. Ảnh hƣởng của lạnh đến hàm lƣợng diệp lục a, b ở giai đoạn mạ
- Chuẩn bị mẫu: Hạt của các một số dòng thế hệ R4 và giống gốc được
ngâm, ủ và trồng giống như mục 2.2.4.1. Khi cây mạ được ba lá (9 – 10 ngày) thì tiến hành xử lý lạnh ở nhiệt độ 120
C ± 0,50C với ngưỡng thời gian 3 và 5 ngày rồi thu hoạch lá, tiến hành xác định hàm lượng diệp lục.
- Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục được xác
định theo phương pháp Wintermans, De Mots mô tả trong sổ tay phân tích đất, nước, phân bón cây trồng (1998) [25].
Các bước tiến hành như sau:
+ Cân 0,1 g lá nghiền trong cồn ethanol 96%.
+ Dịch thu được đem pha loãng 10ml rồi đo quang phổ hấp thụ trên máy quang phổ UV Visible ở bước sóng 665 nm và 649 nm.
+ Hàm lượng diệp lục (mg/g lá tươi) được tính theo công thức:
1000 P n V C A
Trong đó: C: nồng độ diệp lục tính ra (mg/l) (gồm có Ca, Cb, Ca+b) Ca (mg/l) = 13,70. E665 – 5,76. E649
Cb (mg/l) = 25,80. E649 – 7,60. E665 Ca+b (mg/l) = 6,10. E665 + 20,04. E649 P: Khối lượng mẫu (g)
V: Thể tích sắc tố rút được (ml) A: hàm lượng diệp lục (mg/g lá tươi)
2.2.5. Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.5.1. Tách chiết ADN tổng số từ lá lúa
Quy trình tách chiết và làm sạch ADN tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [29].
- Tiến hành: Hạt lúa R4 của 6 dòng từ thế hệ R3 và hạt lúa của giống gốc
được bóc vỏ và khử trùng, cấy hạt trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, mật độ cấy 20 hạt/ bình. Sau 10 ngày thu lá, bảo quản ở tủ lạnh sâu -850C. ADN tách từ lá non của lúa được thực hiện theo các bước sau:
(1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
(2) Bổ sung 800 μl đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi (làm 2 lần). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(3) Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
(4) Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. (5) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
(7) Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng.
(8) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. (9) Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ.
(10) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần). (11) Làm khô ADN bằng máy speed vac.
(12) Hoà tan ADN trong H2O khử ion.
Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của ADN
Phương pháp điện di ADN tổng số trên gel agarose
Điện di kiểm tra ADN tổng số của mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8% (0,8g agarose trong 100 ml dung dịch TAE 1X). Sản phẩm điện di được nhuộm bằng dung dịch ethydium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Dựa vào hình ảnh điện di có thể đánh giá độ tinh sạch của ADN trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.2.5.2. Tiến hành phản ứng RAPD
Mẫu ADN thu được tiến hành phản ứng PCR – RAPD để phân tích tính đa hình ADN của các dòng R4 so với giống gốc.
Phản ứng RAPD được tiến hành với 10 mồi ngẫu nhiên, các mồi có trình tự dài 10 nucleotide (kí hiệu M1, M2, M3, M4, M7, M10, M14, M15, M17, M18). Thông tin về trình tự của các mồi được trình bày ở bảng 2.2.
Mỗi phản ứng PCR - RAPD được thực hiện trong 25 l dung dịch chứa: 10mM buffer PCR 1X; 2,5 mM MgCl2; 25 M mỗi loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 200 nM mồi; 0,125 đơn vị Taq polymerase và 10 ng ADN khuôn. Phản ứng PCR- RAPD thực hiện trong máy PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu trình nhiệt: Bước 1: 940C trong 3 phút; Bước 2: 920C trong 1 phút; Bước 3: 350
C trong 1 phút; Bước 4: 720
C trong 1 phút, từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 45 chu kì; Bước 5: 720C trong 10 phút; Bước 6: giữ ở 40C. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8%, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi
M1 5‟GGCGGACTGT3‟ M10 5‟CTATGCCGAC3‟
M2 5‟GGGGGTCGTT3‟ M14 5‟TAGGCGAACG3‟
M3 5‟TACCACCCCG3‟ M15 5‟CACGGCTGCG3‟
M4 5‟GGCGGACTGT3‟ M17 5‟GCGAACCTCG3‟
M7 5‟CAGCACCCAC3‟ M18 5‟GCCCTGATAT3‟
2.2.6. Xử lí kết quả và tính toán số liệu
Phân tích các tính trạng số lượng theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi công thức thí nghiệm và đối chứng lấy ngẫu nhiên 30 cây. Các giá trị thống kê như: trị số trung bình mẫu (X ), phương sai ( 2), độ lệch ( ), sai số trung bình mẫu (SX), hệ số biến động (Cv%), hệ số tương quan (r)… Các trị số thống kê được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình excel, ở mức ý nghĩa = 0,05 theo Chu Văn Mẫn [16].
Kết quả của phản ứng PCR - RAPD được xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.0. Dựa trên sự xuất hiện hay biến mất của các phân đoạn ADN khi điện di sản phẩm RADP của các dòng và giống gốc với mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở cho sự phân tích số liệu.
Phân tích số liệu theo qui ước: 1 = băng ADN xuất hiện và 0 = băng ADN không xuất hiện, khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên. So sánh hệ số tương quan kiểu hình theo phương pháp: Jaccard và phân nhóm UPGMA. Lập biểu đồ hình cây dựa vào giá trị tương quan kiểu gen trong chương trình NTSYSpc 2.0 để so sánh sự khác nhau giữa các dòng so với giống gốc ở mức độ phân tử [17].
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm nông học của các dòng lúa chọn lọc thế hệ R3 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh mô sẹo chịu lạnh
Các dòng chọn lọc và giống gốc sau khi gieo trên khay được cây mạ đưa ra trồng ngoài ruộng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển bình thường (Hình 3.1). Sau thời gian tiến hành theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu nông học trong vụ mùa 2012, kết quả được trình bày ở bảng 3.1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chiều cao cây:
Chiều cao cây được đo từ mặt ruộng đến đầu bông. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy mức độ biến động về tính trạng chiều cao cây của các dòng chọn lọc đang dần ổn định. Tính trạng chiều cao cây của các dòng chọn lọc và giống gốc được sắp xếp theo thứ tự: R3.20 > R3.24 > R3.06 > XCH > R3.13 > R3.38 > R3.44. Kết quả cho thấy, các dòng R3.13, R3.38, R3.44 có chiều cao giảm so với giống gốc từ 0,73cm – 1,46cm, trong đó dòng R3.44 có chiều cao cây thấp nhất (86,07cm). Các dòng R3.20, R3.24, R3.06 có chiều cao tăng hơn so với giống gốc, dòng R3.20 có chiều cao cao nhất (88.85cm). Trong số 6 dòng theo dõi thì có 3/6 dòng (chiếm 50%) có hệ số biến động (Cv%) nhỏ hơn so với giống gốc. Dòng R3.13 có hệ số biến động cao nhất là 3,60%, các dòng còn lại dao động từ 2,18% - 3,57%. Như vậy, chiều dài thân của đa số các dòng chọn lọc có xu hướng thấp hơn giống gốc, mức độ ổn định lại cao hơn so với giống gốc.
- Chiều dài bông
Chiều dài bông thay đổi tùy theo từng dòng. Từ bảng 3.1 cho thấy, chiều dài bông dao động từ 26,19cm đến 27,34cm, trong đó cả 6 dòng đều có chiều dài bông lớn hơn so với giống gốc. Dòng R3.24 có chiều dài bông thấp nhất trong các dòng