Tiến hành đánh giá mức độ thay đổi di truyền của các dòng chọn lọc với 10 mồi ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotide. Sản phẩm của phản ứng RAPD được điện di trên gel agarose. Kết quả phân tích sản phẩm điện di phản ứng RAPD của các dòng chọn lọc và giống gốc với các mồi trên được trình bày ở bảng 3.7.
Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, với 10 mồi ngẫu nhiên, chúng tôi đã thu được 261 băng ADN. Trong tổng số 10 mồi phân tích, số băng ADN được nhân bản của 7 mẫu lúa với mồi M4 là nhiều nhất (46 băng ADN) và ít nhất là mồi M10 (14 băng). Tổng số băng được nhân bản của các mẫu lúa dao động từ 35 - 40 băng ADN. Trong đó, dòng R4.13 và R4.38 nhân bản được nhiều băng nhất (40 băng), tiếp đến là dòng R4.06 với 38 băng. Dòng R4.20, R4.24 và giống gốc nhân bản được 36 băng và thấp nhất là dòng R4.44 được 35 băng ADN.
Bảng 3.7. Tổng số băng ADN được nhân bản của 7 mẫu lúa khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên
Mồi XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 Tổng số băng ADN M1 2 3 3 3 3 2 3 19 M2 5 5 6 3 4 6 3 32 M3 3 3 3 3 3 3 3 21 M4 8 5 6 7 6 8 6 46 M7 2 4 4 2 3 3 3 21 M10 2 2 2 2 2 2 2 14 M14 3 4 4 4 3 4 4 26 M15 3 3 3 3 3 3 3 21 M17 6 6 6 6 6 6 6 42 M18 2 3 3 3 3 3 2 19 Tổng 36 38 40 36 36 40 35 261
Tính đa hình các băng ADN thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng khi so sánh giữa các dòng với nhau và với giống gốc trong cùng 1 mồi.
Trong 10 mồi phân tích, chúng tôi nhận được 6/10 mồi có sự biểu hiện đa hình, đó là các mồi M1, M2, M4, M7, M14, M18. Kết quả phân tích tính đa hình được trình bày ở bảng 3.8.
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, tổng số băng ADN của 7 mẫu lúa khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên là 46 băng, số băng đa hình là 21, chiếm 45,65% và số băng không đa hình là 25, chiếm 54,35%. Số băng ADN được nhân bản ở mỗi mồi dao động từ 2 - 10. Kích thước ước tính của các băng được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên là từ 0,5 - 2,6 kb. Trong số 6 mồi cho tính đa hình, mồi M4 có tỷ lệ băng đa hình cao nhất (8/10 băng chiếm 80%), thấp nhất là mồi M18 (chỉ 1/3 băng chiếm tỷ lệ 33,33%). Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây khi chọn dòng ở lúa.
Bảng 3.8. Phân tích đa hình về băng ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên của 7 mẫu lúa nghiên cứu
STT Mồi Băng ADN được nhân bản Kích thước (kb) Băng ADN đa hình % băng ADN đa hình 1 M1 4 0,5 - 1,45 3 75 2 M2 7 0,5 - 1,45 5 71,43 3 M3 3 0,6 - 1,1 0 0 4 M4 10 0,55 - 2,6 8 80 5 M7 4 0,6 - 1,2 2 50 6 M10 2 0,65 - 1,05 0 0 7 M14 4 0,75 - 1,4 2 50 8 M15 3 0,6 - 1,4 0 0 9 M17 6 0,5 - 2,6 0 0 10 M18 3 0,55 -1,35 1 33,33 Tổng số 46 0,5 - 2,6 21 45,65
Dưới đây là kết quả phân tích sản phẩm PCR - RAPD của 6 mồi M1, M2, M4, M7, M14 và M18 khi điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,5%.
* Mồi M1
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M1 được thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.5.
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M1
M: Thang ADN chuẩn Băng ADN mất đi so với giống gốc Băng ADN mới xuất hiện so với giống gốc
Điện di sản phẩm phản ứng RAPD với mồi M1, chúng tôi thu được 4 băng ADN. Số băng ADN được nhân bản ngẫu nhiên của các dòng từ 2 - 3 băng và có kích thước dao động từ 0,5 - 1,45 kb. Dòng R4.06, R4.13, R4.20, R4.24, R4.44 đều có 3 băng, dòng R4.38 và giống gốc có ít băng được nhân bản nhất với 2 băng. Trong tổng số 4 băng ADN được nhân bản có 3 băng biểu hiện tính đa hình chiếm 75%. Dòng R4.20 và R4.38 mất đi 1 băng so với giống gốc có kích thước 0,55 kb, các dòng R4.06, R4.13, R4.20, R4.24 và R4.38 xuất hiện 1 băng mới có kích thước là 1,45kb. Dòng R4.20 và R4.44 còn xuất hiện thêm 1 băng điện di mới so với giống gốc có kích thước là 0,5kb. Kết quả phân tích trên cho thấy, các dòng lúa nghiên cứu của thế hệ R4 có sự sai khác trong ADN hệ gen so với giống gốc.
M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 10 kb 6,0 kb 3,0 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb
* Mồi M2
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M2 được thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M2
M: Thang ADN chuẩn Băng ADN mất đi so với giống gốc Băng ADN mới xuất hiện so với giống gốc
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, khi nhân bản ngẫu nhiên ADN của 7 mẫu lúa nghiên cứu với mồi M2 đã có 7 băng ADN được nhân bản. Các băng ADN có kích thước dao động từ 0,5 - 1,45kb. Dòng R4.13 và R4.38 xuất hiện nhiều băng nhất với 6 băng ADN. Dòng R4.06 và giống gốc xuất hiện 5 băng, còn dòng R4.24 có 4 băng ADN. Hai dòng còn lại là R4.20 và R4.44 chỉ có 2 băng ADN được nhân bản. Trong tổng số 7 băng được nhân bản có 5 băng biểu hiện tính đa hình chiếm 71,43%. Các dòng R4.13, R4.20, R4.24, R4.38 và R4.44 đều có sự sai khác so với giống gốc, trong đó dòng R4.38 còn xuất hiện thêm 1 băng điện di mới so với các dòng khác và giống gốc có kích thước là 0,5kb. Các dòng R4.20, R4.44 mất đi 3 băng so với giống gốc có kích thước 0,8kb, 1,05kb và 1,45kb. Dòng R4.24 mất đi 2
10 kb 6,0 kb 3,0 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44
băng ADN so với giống gốc có kích thước 1,05kb và 1,45kb. Còn dòng R4.38 chỉ mất đi 1 băng so với giống gốc ở kích thước 1,05kb. Như vậy, với kết quả nhận được trên đây, một lần nữa khẳng định có sự sai khác về mặt di truyền của các dòng lúa thế hệ R4 so với giống gốc.
* Mồi M4
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M4 được thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M4
M: Thang ADN chuẩn Băng ADN mất đi so với giống gốc Băng ADN mới xuất hiện so với giống gốc
Hình 3.7 cho thấy, khi sử dụng mồi M4 để thực hiện phản ứng RAPD của 7 mẫu lúa, chúng tôi đã thu được 10 băng ADN trong đó có 8 băng biểu hiện tính đa hình chiếm 80%. Tất cả các dòng lúa đều có sự sai khác so với giống gốc, dòng R4.24 xuất hiện 1 băng ADN mới so với giống gốc và các dòng khác có kích thước 1,1kb, các dòng R4.24, R4.38 và R4.44 cũng xuất hiện 1 băng ADN mới so với
M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb 3,0 kb 10 kb 6,0 kb (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
giống gốc có kích thước 0,55kb. Hai dòng R4.24 và R4.44 đều mất đi 3 băng có kích thước 1,25kb, 1,5kb và 2,25kb, trong đó dòng R4.24 còn mất thêm 1 băng ở kích thước 1,05kb. Dòng R4.06 mất đi 3 băng ADN so với giống gốc có kích thước 1,05kb, 1,5kb và 1,8kb, dòng R4.13 mất đi 2 băng ADN có kích thước 0,8kb và 1,25kb, còn dòng R4.20 chỉ mất 1 băng so với giống gốc ở kích thước 0,8kb. Như vậy, đây là đoạn mồi thể hiện tính đa hình nhiều nhất trong tổng số 10 đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng RAPD.
* Mồi M7
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M7 được thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.8.
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M7
M: Thang ADN chuẩn Băng ADN mất đi so với giống gốc Băng ADN mới xuất hiện so với giống gốc
Hình 3.8 cho thấy, khi nhân bản ngẫu nhiên ADN của 7 mẫu lúa với mồi M7 thu được 4 băng ADN, trong đó có 2 băng thể hiện tính đa hình chiếm 50%. Dòng R4.20 xuất hiện 2 băng ADN và kích thước các băng giống với ĐC. Dòng R4.06 và R4.13 xuất hiện nhiều băng nhất với 4 băng được nhân bản và các băng có trình tự giống nhau, trong đó xuất hiện thêm 2 băng mới so với ĐC có trình tự 0,6kb và
M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 10 kb 6,0 kb 3,0 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb
1,2kb. Dòng R4.24, R4.38 và R4.44 đều xuất hiện 3 băng ADN trong đó đều có 1 băng mới xuất hiện so với ĐC có kích thước là 1,2kb.
* Mồi M14
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M14 được thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M14
M: Thang ADN chuẩn Băng ADN mất đi so với giống gốc Băng ADN mới xuất hiện so với giống gốc
Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 ở hình 3.9 cho thấy, có 4 băng ADN được nhân bản, trong đó có 2 băng đa hình chiếm 50%. Tất cả các dòng chọn lọc đều xuất hiện 1 băng ADN mới so với giống gốc có kích thước khoảng 1,15kb. Riêng dòng R4.24 mất đi 1 băng ADN so với các dòng khác và với giống gốc có kích thước 1,4kb. Như vậy, dòng R4.24 có sai khác về genome nhiều nhất so với giống gốc trong 5 dòng nghiên cứu.
* Mồi M18
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M18 được thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.10. M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb 10 kb 6,0 kb 3,0 kb
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 7 mẫu lúa với mồi M18
M: Thang ADN chuẩn Băng ADN mất đi so với giống gốc Băng ADN mới xuất hiện so với giống gốc
Điện di sản phẩm phản ứng RAPD với mồi M18 (hình 3.10), chúng tôi thu được 3 băng ADN, trong đó có 1 băng thể hiện tính đa hình chiếm 33,33%. Các dòng R4.06, R4.13, R4.20, R4.24 và R4.38 đều có 3 băng ADN trong đó xuất hiện thêm 1 băng ADN mới so với giống gốc có trình tự 1,3kb, còn dòng R4.44 có các băng ADN giống so với giống gốc. Như vậy, sự xuất hiện các băng ADN với mồi M18 một lần nữa đã chứng tỏ các dòng lúa R4 đã có có sự thay đổi ở mức độ genome so với giống gốc.
Qua kết quả phân tích sản phẩm RAPD của 6 mồi ngẫu nhiên với 7 mẫu lúa nghiên cứu cho thấy, giữa 6 mẫu lúa đã có sự khác nhau về mặt di truyền.
Để thiết lập mối quan hệ tương đồng di truyền, chúng tôi tiến hành mã hoá số liệu các băng ADN thu được ra ký tự 1 và 0 theo qui ước 1= xuất hiện băng ADN, 0= không xuất hiện băng ADN. Kết quả thống kê các băng ADN của các mẫu lúa nghiên cứu khi tiến hành phản ứng RAPD với 6 mồi đa hình được trình bày ở bảng 3.9. M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 10 kb 6,0 kb 3,0 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb
Bảng 3.9. Thống kê các băng ADN được nhân bản trong phản ứng RAPD với 6 mồi ngẫu nhiên
Mồi Kb Dòng Mồi Kb Dòng Gốc 06 13 20 24 38 44 Gốc 06 13 20 24 38 44 M1 1,45 0 1 1 1 1 1 0 M7 1,2 0 1 1 0 1 1 1 1,0 1 1 1 1 1 1 1 1,15 1 1 1 1 1 1 1 0,55 1 1 1 0 1 0 1 0,85 1 1 1 1 1 1 1 0,5 0 0 0 1 0 0 1 0,6 0 1 1 0 0 0 0 M2 1,45 1 1 1 0 0 1 0 M4 2,6 1 1 1 1 1 1 1 1,25 1 1 1 1 1 1 1 2,25 1 1 1 1 0 1 0 1,05 1 1 1 0 0 0 0 1,8 1 0 1 1 1 1 1 0,85 1 1 1 1 1 1 1 1,5 1 0 1 1 0 1 0 0,8 1 1 1 0 1 1 0 1,25 1 1 0 1 0 0 0 0,7 0 0 1 1 1 1 1 1,1 0 0 0 0 1 0 0 0,5 0 0 0 0 0 1 0 1,05 1 0 1 1 0 1 1 M14 1,4 1 1 1 1 0 1 1 0,85 1 1 1 1 1 1 1 1,15 0 1 1 1 1 1 1 0,8 1 1 0 0 1 1 1 0,85 1 1 1 1 1 1 1 0,55 0 0 0 0 1 1 1 0,75 1 1 1 1 1 1 1 M18 1,35 1 1 1 1 1 1 1 1,3 0 1 1 1 1 1 0 0,55 1 1 1 1 1 1 1
Với tổng số 163 băng ADN thu được của cả 7 mẫu lúa nghiên cứu, chúng tôi tiến hành xử lý số liệu trên phần mềm NTSYS 2.0 để thiết lập mối quan hệ di truyền và sơ đồ hình cây.