ADN của 4 dòng chọn lọc và 2 giống gốc được phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên có độ dài 10 bp (ký hiệu là M1, M2, M3, M4, M5). Kết quả thống kê các phân đoạn ADN được nhân bản từ ADN hệ gen của các dòng lạc và giống gốc được trình bày ở bảng 3.22.
Bảng 3.22. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng
RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên
Dòng/giống L18 R4.14 L23 R4.9 R4.11 R4.13 Tổng M1 4 4 4 4 4 2 22 M2 4 3 4 4 4 4 23 M3 8 7 8 8 8 8 47 M4 9 8 9 9 9 9 53 M5 5 9 7 7 9 8 45 Tổng 30 31 32 32 34 30 189
Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 0,8% để phân tích tính đa hình ADN của 6 mẫu cây nghiên cứu. Số lượng các phân đoạn AND nhân bản với mỗi cặp mồi dao động từ 22 đến 53 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn ADN được nhân bản trong khoảng từ 0,25 – 2,5kb. Tổng số phân đoạn ADN nhân bản của 5 đoạn mồi là 189 phân đoạn.
Bảng 3.22 cho thấy, trong số 5 mồi phân tích, số phân đoạn của 6 mẫu lạc với mồi M4 là nhiều nhất (53 phân đoạn) và ít nhất là mồi M1 (22 phân đoạn).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 71
Tổng số phân đoạn được nhân bản của các mẫu lạc dao động từ 30 đến 34 phân đoạn. Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các dòng với nhau và với giống gốc trong cùng 1 mồi. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC. Giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao.
Bảng 3.23. Tỷ lệ phần trăm phân đoạn đa hình khi sử dụng 5 mồi RAPD
Mồi Số phân đoạn nhân bản Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình Tỷ lệ % số phân đoạn
đa hình Giá trị PIC
M1 4 2 2 50,00 0,15 M2 4 1 3 25,00 0,08 M3 8 1 7 12,50 0,04 M4 9 2 7 22,22 0,07 M5 9 4 5 44,44 0,25 Tổng 34 10 24 29,41
Kết quả ở bảng 3.23 cho thấy, tổng số phân đoạn ADN của 6 mẫu lạc khi phân tích với 5 mồi ngẫu nhiên là 34 phân đoạn. Trong đó số phân đoạn đa hình là 10 (chiếm 29,41%), số phân đoạn không đa hình là 23 (chiếm 70,59%). Mồi M1 có tỷ lệ % số phân đoạn đa hình cao nhất (50%), mồi M3 có tỷ lệ % số phân đoạn đa hình thấp nhất (12,50%). Khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình (giá trị PIC) nhận thấy các mồi có cho tính đa hình thấp (PIC < 0,5), nhưng cả 5 mồi đều cho tính đa hình. Giá trị PIC cao nhất là ở mồi M5 (0,25) và thấp nhất là ở mồi M3 (0,04). Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-RAPD trên gen 0,8% của 5 mồi được thể hiện dưới đây:
Mồi M1. Mồi M1 cho tổng số 4 phân đoạn ADN của 6 mẫu lạc thu được
là 22. Kích thước các phân đoạn dao động trong khoảng từ 0,6 – 1,3kb. Trong đó có 2 phân đoạn thể hiện tính đa hình. Đó là ở kích thước 0,6 và 0,75kb ở mẫu R4.13 không xuất hiện phân đoạn ADN được nhân bản, trong khi đó ở các mẫu còn lại đều xuất hiện.
Mồi M2. Mồi M2 cho 4 phân đoạn ADN nhân bản. Kích thước các phân
đoạn dao động trong khoảng từ 0,35 – 1,0kb. Trong đó có 1 phân đoạn thể hiện tính đa hình: Ở kích thước 0,35 ở mẫu R4.14 không xuất hiện phân đoạn ADN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 72
được nhân bản, trong khi đó ở các dòng khác và giống gốc xuất hiện phân đoạn ADN nhân bản. M L18 L23 R4.14 R4.9 R4.11 R4.13 M L18 L23 R4.14 R4.9 R4.11 R4.13 2,0 1,5 1,0 0,75 0,5 0,25 2,0 1,5 1,0 0,75 0,5 0,25
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới mồi M1
và M2 (←: xuất hiện, →: không xuất hiện)
Mồi M3. Mồi M3 cho 8 phân đoạn ADN nhân bản. Kích thước các phân
đoạn dao động trong khoảng từ 0,3 – 2,7kb. Trong đó có 1 phân đoạn thể hiện tính đa hình: Ở kích thước 0,75 ở mẫu R4.14 không xuất hiện phân đoạn ADN được nhân bản, trong khi đó ở các mẫu khác xuất hiện phân đoạn ADN nhân bản. M L18 L23 R4.14 R4.9 R4.11 R4.13 M L18 L23 R4.14 R4.9 R4.11 R4.13 3,0 2,0 1,5 1,0 0,75 0,5 0,25 2,0 1,5 1,0 0,75 0,5 0,25
Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới mồi M3
và M4 (←: xuất hiện, →: không xuất hiện)
Mồi M4. Trên phạm vi vùng phân tích thu được tổng số 55 phân đoạn ADN với kích thước trong khoảng 0,5 – 1,6kb. Trong số 9 phân đoạn có 2 phân đoạn thể hiện tính đa hình: Ở kích thước 0,8 và 0,85 ở mẫu R4.14 không xuất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 73
hiện phân đoạn ADN được nhân bản, trong khi đó ở các mẫu khác đều xuất hiện phân đoạn.
Mồi M5. Mồi M5 cho 7 phân đoạn ADN nhân bản. Kích thước các phân
đoạn dao động trong khoảng từ 0,3 – 2,0kb. Ở kích thước 2,0kb, giống L18 gốc và dòng R4.9 của giống L23 không xuất hiện các phân đoạn ADN trong khi đó các dòng và giống gốc còn lại xuất hiện. Ở kích thước 1,0kb, dòng R4.9 và R4.13 của giống L23 không xuất hiện các phân đoạn ADN trong khi đó các dòng và giống gốc còn lại xuất hiện. Ở kích thước 0,4kb, giống L23 gốc và L18 gốc không xuất hiện các phân đoạn ADN trong khi đó các dòng và giống gốc còn lại xuất hiện. Sự xuất hiện và biến mất các phân đoạn chứng tỏ các dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước đã có sự thay đổi kiểu gen.
M L18 L23 R4.14 R4.9 R4.11 R4.13 2,0 1,5 1,0 0,75 0,5 0,25
Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới
mồi M5 (←: xuất hiện, →: không xuất hiện)
3.4.3. So sánh sự khác nhau của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân tử
Các số liệu số phân tích PCR-RAPD được xử lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc version 2.1 nhằm tìm ra khoảng cách di truyền giữa các mẫu lạc nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ hình cây. Hệ số khác nhau phản ánh quan hệ di truyền giữa các dòng lạc và giống gốc. Các dòng càng giống nhau về mặt di truyền thì hệ số khác nhau càng gần 0 và ngược lại. Kết quả bảng phân tích cho thấy, hệ số sai khác di truyền của dòng R4.14 tạo được so với giống gốc là 0,205883. Như vậy, dòng R4.14 mới tạo được đã
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 74
thể hiện mức độ sai khác. Qua nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy dòng R4.14 có nhiều đặc điểm khác biệt so với giống gốc như: vỏ trơn còn giống gốc vỏ nhăn, kích thước lá, chiều cao cây, khả năng chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm và cây non cao hơn so với giống gốc. Như vậy, dòng R4.14 tạo được cũng có sự khác biệt nhất định
Bảng 3.24. Hệ số sai khác di truyền của 3 dòng (giống L23) và giống gốc
Dòng/ giống L23 gốc R4.9 R4.11 R4.13 L23 gốc 0,000000
R4.9 0,117647 0,000000
R4.11 0,058824 0,058824 0,000000
R4.13 0,147059 0,088235 0,088235 0,000000
Bảng 3.24 cho thấy mức độ sai khác của hệ gen giữa 3 dòng thuộc giống L23 và giống gốc dao động từ 0,058824 đến 0,147059. Như vậy, hệ số đồng dạng di truyền của 4 dòng lạc và giống gốc dao động trong khoảng từ 0,8529412 đến 0,9411765. Trong đó, dòng R4.9 có độ sai khác thấp nhất so với giống gốc (0,058824), dòng R4.13 có sự sai khác lớn nhất so với giống gốc (0,147059). Như vậy, cả 3 dòng cây mới tạo được đã thể hiện mức độ sai khác so với giống gốc tuy nhiên là sai khác không lớn.
So sánh hệ số sai khác di truyền giữa các dòng cho thấy, sự khác biệt lớn nhất tìm thấy ở dòng R4.9 và R4.13, R4.13 và R4.11 (đều là 0,88235), hai dòng R4.9 và R4.11 có sự sai khác thấp hơn (0,058824).
Như vậy, trong 6 mẫu lạc nghiên cứu đã có sự phân tách giữa các dòng mới tạo được và giống gốc đồng thời giữa các dòng mới tạo được cũng có sự khác biệt nhất định.
Hình 3.15 cho thấy mức độ sai khác giữa các dòng và giống gốc. Các dòng và giống gốc có hệ số tương đồng được xếp vào 1 nhóm, các nhóm có sự liên hệ với nhau.
- Nhánh 1: Gồm giống L23 gốc và dòng R4.11 có hệ số tương đồng 0,9411765 - Nhánh 2: Gồm 2 dòng R4.9 và R4.13 có hệ số tương đồng 0,9117647
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 75
Hình 3.15. Sơ đồ mô tả quan hệ di truyền của 3 dòng lạc và giống L23 gốc
Như vậy, khi sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để phân tích đã chỉ ra sự đa dạng di truyền của cả 4 dòng lạc và 2 giống gốc. Sự đa hình của sản phẩm RAPD là kết quả của sự thay đổi các điểm gắn mồi (ví dụ: đột biến điểm) hoặc do sự thay đổi NST trong các vùng được nhân bản sẽ gây ra sự thay đổi về kích thước hay ngăn cản sự nhân bản của AND mẫu. Do đó, các đa hình được ghi nhận do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản từ một locus. Kĩ thuật RAPD là một phương pháp hiệu quả trong việc phân tích nguồn gốc các loài, xác định các đặc tính của cây có nguồn gốc từ nuôi cấy tế bào [41].
3.4.4. Nhận xét về đa hình RAPD
(1) Phân tích tính đa hình của 6 mẫu lạc với 5 mồi ngẫu nhiên thì cả 5/5 mồi có tính đa hình nhưng có tính đa hình thấp PIC < 0,5. Hệ số sai khác di truyền giữa các dòng chịu mất nước so với giống gốc L23 dao động từ 0,058824 đến 0,147059. So sánh hệ số sai khác di truyền giữa các dòng cho thấy, sự khác biệt lớn nhất tìm thấy ở dòng L23 gốc và dòng R4.13. Hệ số sai khác di truyền giữa dòng R4.14 so với giống gốc L18 là 0,7941176.
(2) Biểu đồ hình cây và hệ số tương đồng di truyền của 4 mẫu lạc nghiên cứu của giống L23 được xếp thành 2 nhánh chính: Nhánh 1: Gồm giống L23 gốc và dòng R4.11. Nhánh 2: Gồm 2 dòng R4.9 và R4.13. Những kết quả này chứng tỏ các dòng tạo ra từ mô sẹo chịu mất nước của giống lạc địa phương L18 và L23 đã có những thay đổi ở mức phân tử trong bộ gen.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 76
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
1. Nghiên cứu các tính trạng nông học của các dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước thế hệ R2, R3, chúng tôi đã lựa chọn được một số dòng lạc có triển vọng: Giống L23: R3.9, R3.11, R3.13; Giống L18: R3.14; Giống MD7: R3.23, R3.26. Giống MD9: R3.30.
2. Hàm lượng protein, lipit, đường tan của nhiều dòng chọn lọc có xu hướng tăng so với giống gốc. Hàm lượng a mino acid không thay thế trong protein của các dòng chọn lọc cao hơn so với giống gốc và tiêu chuẩn FAO như dòng R3.26 của giống MD7. Một số dòng chọn lọc có chất lượng hạt cao hơn so với giống gốc như dòng R3.26 của giống MD7, dòng R3.16 của giống L18 và kém nhất là dòng R3.28 của giống MD9.
3. Hàm lượng đường tan và hoạt độ của α-amylase ở giai đoạn nảy mầm của các giống lúa có mối tương quan thuận chặt chẽ , liên quan đến khả n ăng chịu hạn của từng dòng. Ở giai đoạn cây non, sự biến động h àm lượng proline và đường tan ở có tương quan th uận với khả năng chịu hạn của các dòng lạc. Dòng R4.11 của giống L23 có chỉ số c hịu hạn tương đối cao nhất (13383,63) và thấp nhất là dòng L23 gốc (3758,82). Một số dòng lạc chịu hạn cao bao gồm dòng R4.9, R4.11, R4.13 của giống L23, R4.25 của giống MD7, R4.14, R4.15 của giống L18.
4. Sử dụng kỹ thuật RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của một số dòng R4 có nguồn gốc từ giống L23 và L18 cho thấy:
- Có 5/5 mồi cho tính đa hình
- Hệ số sai khác di truyền giữa các dòng chịu mất nước so với giống gốc L23 dao động từ 0,058824 đến 0,147059. Hệ số sai khác di truyền giữa dòng R4.14 so với giống gốc L18 là 0,7941176. Điều đó khẳng định các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước có sự thay đổi trong ADN genome.
5. Một số dòng ưu việt, được đánh giá cao:
- Về năng suất: dòng R4.4, R4.13 của giống L23; giống MD7: R4.26; dòng R3.30 của giống MD9.
- Về chất lượng hạt: dòng R4.26 của giống MD7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 77
Đề nghị
1. Dòng R4.11 của giống L23, R4.14 của giống L18 có khả năng chịu hạn tốt nhất trong số các dòng chọn lọc, dòng R3.23 của giống MD7 có chất lượng hạt tốt, dòng R4.26 của giống MD7 mang một số biến dị tốt như quả 3 hạt nhiều, nên cần có những nghiên cứu đánh giá tiếp theo.
2. Tiếp tục trồng và theo dõi sự ổn định các tính trạng nông học của các dòng lạc thu được qua các thế hệ để có các nghiên cứu đánh giá tiếp theo đặc biệt là các nghiên cứu về chỉ thị phân tử .
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Vũ Thị Thu Thủy, Đinh Tiến Dũng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2009), Đặc điểm nông học và hóa sinh hạt của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên - Tập 59, số 11, 2009.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở lúa, NXB Đại học quốc gia HN.
2. Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn Hải(2004), “Ngiên cứu đa hình một số giống dâu tằm bằng kĩ thuật RAPD”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng.
3. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), “Mối tương quan giữa hàm lượng prolin và tính chống chịu ở lúa”, Tạp chí công nghệ sinh học, 1(1), tr.85-93.
4. Nguyễn Khoa Chi (1987), Cây đậu phộng, NXB Thành phố Hồ Chí Minh, tr 4 - 59.
5. Phan Văn Chi và CS (1997), “Sử dụng một số primers ngẫu nhiên để xác định RAPDs ở lúa DT-33 và Tám thơm”, Tạp chí di truyền học và ứng dụng, 4, trang 15 - 18.
6. Phạm Thị Trân Châu và CS (1977), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
7. Ngô Thế Dân, Nguyễn Xuân Hồng, Đỗ Thị Dung, Nguyễn Thị Chinh, Trần Đình Long, Nguyễn Thị Đào, Phạm Văn Toản, Gowda C. L. (2000), Kỹ thuật đạt năng xuất lạc cao ở Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 2 -138. 8. Nguyễn Lân Dũng (1979), Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học,
tập 3, NXB Hà Nội, trang 116 – 120.
9. Ngô Văn Dương (2009), “Đánh giá chất lượng và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn Hà Giang”, luận văn thạc sỹ sinh học, trường ĐHSP – Đại học Thái Nguyên.
10.Lê Song Dự, Nguyễn Thế Côn (1979), Giáo trình cây lạc, NXB Nông nghiệp. 11.Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (1999), “Sử dụng
kỹ thuật RAPD để đánh giá tính đa hình AND của một số dòng chọn lọc từ mô sẹo của giống lúa C71”, Hội nghị công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 1341-1347.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 79
12.Trần Văn Điền, (1990), Giáo trình cây lạc, Trường Đại học Nông nghiệp I, NXB Nông ngiệp Hà Nội.
13.Nguyễn Danh Đông, Ngô Ngọc Đăng, Nguyễn Thế Côn, Dương Văn Nghĩa,