(Lonicera japonica Thunb.) giai đoạn sau in vitro
Giai đoạn chuyển cây in vitro từ trong bình nuôi ra trồng ở vườn ươm là giai đoạn có ý nghĩa quan trọng, quyết định khả nng ứng dụng của toàn bộ quy trình nhân giống cây in vitro vào trong thực tiễn sản xuất. Giai đoạn này thường gặp nhiều khó khăn do cây in vitro đang trong điều kiện ổn định về mặt dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng khi tiến hành chuyển cây ra ngoài sẽ làm cây dễ bị sốc về điều kiện sống dẫn tới cây có thể bị chết. Một trong
những yêu cầu của giai đoạn này là xác định được giá thể trồng cây phù hợp để cây Kim ngân in vitro sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Để xác định ảnh hưởng của thành phần giá thể trồng cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây Kim ngân in vitro khi đưa ra trồng thử nghiệm ở vườn ươm, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 3 loại giá thể như sau:
CT1: 100% Đất tầng A
CT2: 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục CT3: 50% Đất tầng A + 50% Phân chuồng hoai mục
Kết quả theo dõi sau 60 ngày thể hiện ở bảng 4.5 dưới đây:
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của giá thể đến giai đoạn vườn ươm cây Kim ngân sau
in vitro Công thức Số cây thí nghiệm Số cây sống Tỷ lệ cây sống (%) Hình thái cây
CT1 45 34 75,55 Thân vừa, lá xanh đậm
CT2 45 43 95,55 Thân cây mập, lá màu
xanh đậm
CT3 45 23 51,11 Thân nhỏ, lá xanh nhạt
Từ kết quả bảng 4.5 ta thấy: cây Kim ngân sau in vitro trồng trên các loại giá thể khác nhau thì cho kết quả về tỉ lệ sống và hình thái cây khác nhau. Cây trồng trên CT1 giá thể 100% Đất tầng A cho tỉ lệ sống là 75,55%, cây thân vừa lá xanh đậm. Tiếp đến lần lượt là các công thức giá thể: CT2 80% Đất tầng A + 20% phân chuồng hoai mục cho tỉ lệ sống là 95,55%, cây thân mập, lá xanh đậm; CT3 Giá thể 50% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục cho tỉ lệ sống 51,11%, thân cây nhỏ, lá màu xanh nhạt.
Như vậy có thể kết luận loại giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng của cây con Kim ngân trong giai đoạn sau in vitro là giá thể 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục.
Hình 4.5. Hình thái Kim ngân sau in vitro sử dụng giá thể: 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục sau 10 tuần
PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, chất khử trùng đến tỷ lệ vô
trùng mẫu cấy Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.). Khử trùng mẫu đỉnh sinh trưởng cây Kim ngân có mắt chồi sinh trưởng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút cho kết quả vào mẫu tốt nhất: tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 73,33%; tỷ lệ mẫu bị nhiễm 13,33% và tỷ lệ mẫu chết là 13,33%.
2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh
trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.). Tổ hợp BAP 2mg/l với NAA nồng độ 0,2mg/l cho kết quả hệ số nhân chồi lớn nhất là 6,67 ± 0,12 lần; chồi khỏe, mập và xanh.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra
rễ của Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.). Khi bổ sung NAA 1,5mg/l vào môi trường cho kết quả ra rễ tốt nhất với tỷ lệ ra rễ đạt 93,33% ± 3,33, số rễ/chồi là 3,44 ± 0,13 rễ và chiều dài trung bình rễ là 1,59 ± 0,05cm.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống cây Kim
ngân (Lonicera japonica Thunb.) giai đoạn sau in vitro. Giai đoạn trồng cây Kim ngân sau in vitro ngoài vườn ươm trên giá thể 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục cho kết quả sống cao nhất đạt 95,55%.
5. Xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
Hình 4.6. Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro cây Kim ngân
5.2. Kiến nghị
Cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố khác đến nuôi cấy
in vitro để tạo môi trường cấy tối ưu nhất cho cây Kim ngân.
Khử trùng: HgCl2 0,1%, 5 phút -> Mẫu sống chiếm 73,33%,mẫu nhiễm 13,33%, mẫu chết 13,33 %.
Môi trường nhân nhanh chồi MS + saccarose 20g/l +agar (6g/l) BA 2mg/l + NAA 0,2mg/l -> chồi khỏe mập,xanh, chiều cao 2,51 cm.
Môi trường tạo rễ: MS + saccarose 30g/l + 6g/l agar +NAA 1,5 mg/l + IBA 2.0 mg/l -> Tỷ lệ ra rễ đạt 93,33% số rễ/chồi 3,44 rễ chiều dài trung bình 1,59 cm.
Giá thể 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục. 4 – 5 tu ần 3 – 4 tu ần 10 tu ần
Bước 1: Khử trùng mẫu cây tạo vật liệu khởi đầu
Bước 2: Nhân nhanh chồi
Bước 3: Tạo rễ
Bước 4: Cảm ứng cây
Cây mẹ có hàm lượng dược học cao, sạch bệnh, sinh trưởng phát triển tốt
Bước 5: Cấy cây vào bầu đất
Cây con cao ≥ 30 cm, số lá từ 4 – 6, số rễ ≥ 3 rễ, thân cây mập,lá màu xanh
đậm 3 -4 tháng 2 tu ần 15 ngày
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1.Lê Trần Bình (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến của cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
2.Bộ Khoa Học và Công Nghệ (2007). Sách đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội.
3.Võ Văn Chi (1997). Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 937 - 938. 4.Hoàng Thị Thùy Dương (2015). Nghiên cứu đặc điểm sinh thái và kỹ thuật
nhân giống loài cây Kim ngân rừng (Lonicera bournei Hemsl. ex Forb & Hemsl.)
5.Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học (công nghệ di truyền), tập 4, Nxb giáo dục.
6.Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 7.Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB y học. 8.Phạm Xuân Phong “Khai thác và phát triển các nguồn gen dược liệu kim
ngân hoa, huyền sâm” Viện Y học cổ truyền Quân đội 2011 – 2015. 9.Ngô Thị Trang, Nguyễn Thanh Luận, Phạm Thị Lương Hằng, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội “ Nghiên cứu nhân nhanh cây Kim ngân Nhật (Lonicera japonica Thumb.) bằng phương pháp tạo mô sẹo), 2016, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia hà Nội. Vol. 32, No. 1S (2016) 384-390.
10.Mai Quang Trường và Lương Thị Anh (2007), Giáo trình trồng rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
11.Trần Danh Việt (2006). Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống vô tính cây Kim ngân (Lonicera japonica thunb.), Kỷ yếu công trình nghiên cứu Khoa học và Công nghệ 2001 – 2005, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 119 – 120.
12.Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN, ngày 05/12/2005 của Bộ trưởng bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
Tiếng Anh
13.Bhojwani S.S., Razdan, M.K (1983), Plant tissue culture – Theory and practice, Elsevier Academic Publ., Amsterdam.
14.Brickell, C. and J. D. Zuk. 1997. The American Horticultural Society A-Z Encyclopedia of Garden Plants. DK Publishing, Inc., NY.
15. Jiang Xiang Hui, She Chao Wen, Zhu Yong Hua1, Liu Xuan Ming (2012). “Comparative study on different methods for Lonicera japonica
Thunb. micropropagation and acclimatization”, Journal of Medicinal Plants Research, 6(27), pp. 4389-4393.
16.GUO Yun-wen, SU De-rong, LIU Ze-liang, MA Jie, ZHAO Hui-juan, CHEN Li-li (2007). Effects of ABT1 and NAA on the Rooting of Soft Stem Cutting Propagation of Japanese Honeysuckle with Zero Illumination, China Forestry Science and Technology, 2007-04.
17.LAN A-feng, LIANG Zong-suo, WANG Jun-ru (2006). Study on Cuttage and Propagation for Lonicera japonica, Journal of Northwest Forestry University, 2006-02.
18.Lin LM, Zhang XG, Zhu JJ, Gao HM, Wang ZM, Wang WH (2008). “ Two new triterpenoid saponins from the flowers and buds of Lonicera japonica. J”, Asian Nat Prod Res, 10, pp. 925–929.
19. Wagner, W. L., Herbst, D. R. and Sohmer, S. H., 1999, Manual of the Flowering Plants of Hawaii. Revised ed.,University of Hawaii Press, Honolulu, HI.
Phụ lục
Phụ lục 1: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi của mẫu Kim ngân
Anova: Single Factor
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
3 6 2 1 CT1 3 5.2 1.733333 0.023333 CT2 3 13.6 4.533333 0.023333 CT3 3 15.1 5.033333 0.013333 CT4 3 12.5 4.166667 0.023333 CT5 3 10.5 3.5 0.03 CT6 3 7 2.333333 0.023333 ANOVA Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 31.16952 6 5.194921 31.99218
2.14E-
07 2.847726
Within Groups 2.273333 14 0.162381
Phụ lục 2: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân
Anova: Single Factor SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
3 6 2 1 CT1 3 15.2 5.066667 0.023333 CT2 3 17.2 5.733333 0.013333 CT3 3 20 6.666667 0.043333 CT4 3 18.3 6.1 0.04 CT5 3 16.6 5.533333 0.013333 CT6 3 15.7 5.233333 0.023333 ANOVA Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 40.84476 6 6.80746 41.19789
4.16E-
08 2.847726
Within Groups 2.313333 14 0.165238
Phụ lục 3: ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng ra rễ của cây Kim ngân
in vitro
Anova: Single Factor SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
3 6 2 1 CT1 3 100 33.33333 33.33333 CT2 3 180 60 100 CT3 3 210 70 100 CT4 3 250 83.33333 33.33333 CT5 3 190 63.33333 33.33333 ANOVA Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 13040 5 2608 51.98671 1.02E- 07 3.105875 Within Groups 602 12 50.16667 Total 13642 17
Anova: Single Factor SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
3 6 2 1
CT1 3 3.58 1.193333 0.029633
CT2 3 7.07 2.356667 0.053433
CT3 3 11.07 3.69 0.0733
CT5 3 10.21 3.403333 0.076933
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 18.71218 5 3.742436 17.72406
3.59E-
05 3.105875
Within Groups 2.5338 12 0.21115
Total 21.24598 17
Anova: Single Factor SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
3 6 2 1 CT1 3 5.08 1.693333 0.007233 CT2 3 4.67 1.556667 0.002633 CT3 3 4.78 1.593333 0.000233 CT4 3 4.05 1.35 0.0007 CT5 3 4.22 1.406667 0.000233 ANOVA Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 0.811533 5 0.162307 0.963213 0.477326 3.105875
Within Groups 2.022067 12 0.168506
Anova: Single Factor SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
3 6 2 1 CT1 3 120 40 100 CT2 3 160 53.33333 33.33333 CT3 3 280 93.33333 33.33333 CT4 3 220 73.33333 133.3333 CT5 3 140 46.66667 233.3333 ANOVA Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 14507.78 5 2901.556 32.58141 1.4E-06 3.105875
Within Groups 1068.667 12 89.05556
Total 15576.44 17
Anova: Single Factor SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
3 6 2 1 CT1 3 9.2 3.066667 0.013333 CT2 3 9.366667 3.122222 0.011481 CT3 3 10.325 3.441667 0.047708 CT4 3 9.291667 3.097222 0.007523 CT5 3 7.566667 2.522222 0.018148
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 4.075278 5 0.815056 4.453067 0.015859 3.105875
Within Groups 2.196389 12 0.183032
Total 6.271667 17
Anova: Single Factor SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
3 6 2 1 CT1 3 1.9 0.633333 0.013233 CT2 3 3.45 1.15 0.0004 CT3 3 4.78 1.593333 0.007233 CT4 3 4.32 1.44 0.0016 CT5 3 3.73 1.243333 0.001233 ANOVA Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 3.1636 5 0.63272 3.70843 0.029193 3.105875
Within Groups 2.0474 12 0.170617