Nghiên cứu nhân giống các dòng tràm trà a32 23 và a26 218 (melaleuca alternifolia) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Ƣ Ọ Ọ  KHÓA LUẬN TỐT NGHI P Đề tài: Ố A26.218 (MELALEUCA ALTERNIFOLIA Ậ Ấ IN VITRO Gi : TS Khuất : 1953071185 : K64-CNSH t H i Ninh L I CẢ Ơ Khóa luận tốt nghiệp đƣợc hồn thành Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, trƣờng đại học Lâm nghiệp Có đƣợc kết không nỗ lực cá nhân em mà giúp đỡ tận tình thầy Viện Cơng nghệ sinh học Nhân dịp này, em xin chân thành cám ơn quan tâm giúp đỡ quý báu Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc kính trọng tới TS Khuất Thị Hải Ninh tận tình hƣớng dẫn bảo em trình thực khóa luận Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tận tình giảng dạy, trang bị cho em kiến thức quý báu năm vừa qua Em xin chân thành cảm ơn ông bà, bố mẹ động viên ủng hộ vật chất lẫn tinh thần suốt thời gian qua Em xin cảm ơn quan tâm giúp đỡ ủng hộ anh chị, bạn bè trình thực đề tài Mặc dù cố gắng hồn thành khóa luận phạm vi khả cho phép nhƣng chắn khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đƣợc thơng cảm, góp ý tận tình bảo q thầy bạn Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2023 Sinh viên th c hi n Nguyễn Hoàng Anh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v BẢNG KÍ TỰ VIẾT TẮT vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm sinh vật học sinh thái học Tràm trà 1.1.1 Đặc điểm sinh vật học 1.1.2 Đặc điểm sinh thái học 1.2 Tác dụng giá trị kinh tế tinh dầu Tràm trà 1.2.1 Tác dụng sinh học củ tinh dầu Tràm trà 1.2.2 Giá trị kinh tế tinh dầu Tràm trà 1.3 Các nghiên cứu Tràm trà giới 1.3.1 Nghiên cứu chọn giống 1.3.2 Nghiên cứu nhân giống 1.4 Các nghiên cứu Tràm trà Việt Nam 11 1.4.1 Nghiên cứu chọn giống 11 1.4.2 Nghiên cứu nhân giống 12 1.5 Một số nhận định 13 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, Đ I TƢ NG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Đối tƣợng, vật liệu đị điểm nghiên cứu 14 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 15 2.4.2 Phƣơng pháp xử lý số liệu 19 ii CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Nghiên cứu ảnh thời gian khử trùng J vel 5% đến khả tạo mẫu 20 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hò sinh trƣởng ánh sáng đến khả nhân nh nh chồi 21 3.2.1 Ảnh hƣởng chất điều hò sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi 21 3.2.2 Ảnh hƣởng Kinetin đến khả kích thích tăng trƣởng chồi 23 3.2.3 Ảnh hƣởng củ cƣờng độ ánh sáng đến khả kích thích tăng trƣởng chồi 25 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng củ IBA đến khả tạo rễ 26 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng loại giá thể đến khả sinh trƣởng mô gi i đoạn vƣờn ƣơm 28 KẾT LUẬN TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHẦN PHỤ BIỂU 38 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu J vel 5% đến khả tạo mẫu dòng A32.23 A26.218 Tràm trà s u tuần nuôi cấy 20 Bảng 3.2 Khả tạo cụm chồi A32.23 A.26.218 môi trƣờng MS* bổ sung 0,2mg/l Kinetin + 0,1mg/l NAA + (0,2-1,5 mg/l BAP) sau tuần nuôi cấy 22 Bảng 3.3 Kết kích thích tăng trƣởng chồi A32.23 A.26.218 mơi trƣờng MS* có bổ sung mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA + (0,1-0,5 mg/l) Kinetin sau tuần nuôi cấy 24 Bảng 3.4 Kết ảnh hƣởng củ ánh sáng đến khả tăng trƣởng chồi dòng A32.23 A.26.218 (sau tuần nuôi cấy) 25 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng củ IBA đến khả r rễ chồi in vitro sau tuần nuôi cấy 27 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng giá thể đến khả sống sinh trƣởng in vitro dòng Tràm trà vƣờn ƣơm s u tháng r 28 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Tràm trà Australia Hình 1.2 Hoa Tràm trà Hình 1.3 Một số sản phẩm từ tinh dầu Tràm trà sản xuất Australia Hình 1.4 Dự báo thị trƣờng tinh dầu Tràm trà tồn cầu gi i đoạn 2019-2030 Hình 3.1 Mẫu dòng Tràm trà khử trùng Javel 5% thời gian 10 phút 21 Hình 3.2 Cụm chồi dịng A32.23 A.26.218 môi trƣờng MS* bổ sung 0,2mg/l Kinetin + 0,1mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP) sau tuần nuôi cấy 23 Hình 3.3 Chồi dịng A32.23 A26.218 mơi trƣờng kích thích tăng trƣởng chồi MS* có bổ sung 0,5mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP 25 Hình 3.4 Cụm chồi dòng A.32.23 A26.218 điều kiện chiếu sáng tối ƣu 26 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng củ IBA đến khả r rễ chồi in vitro sau tuần nuôi cấy 27 Hình 3.5 Rễ Tràm trà dịng A32.23 A26.218 28 Hình 3.6 Tràm trà trồng loại giá thể khác sau tháng trồng 30 v BẢNG KÍ TỰ VIẾT TẮT ê đầy đủ STT Ký hiệu BAP Benzyl aninopurine ĐHST Điều hoà sinh trƣởng LV Môi trƣờng Litvay, 1985 MS Murashige and Skoog (một loại môi trƣờng nuôi cấy mô) MS* Môi trƣờng Murashige and Skoog cải tiến NAA Naphthalene acetic acid IBA Indole butiric acid IAA 3-Indole acetic acid BA 6-benzyladenine 10 STT Số thứ tự 11 TB Trung bình 12 WPM Woody plant medium ( môi trƣờng nuôi cấy mô thân gỗ) vi ẶT VẤ Ề Tràm (Melaleuca) chi thực vật có đến 290 lồi, đ số lồi tràm đ tác dụng, để lấy gỗ, tinh dầu, nuôi ong, làm bảo vê đất nông nghiệp, đƣờng phố công viên Brophy J.J cs., 2013 Một giá trị lớn củ loài tràm sản xuất tinh dầu ứng dụng y học m phẩm Tinh dầu tràm tên gọi chung cho loại tinh dầu đƣợc chƣng cất từ tràm, gồm nhiều hợp chất thiên nhiên có giá trị nhƣ 1,8-cineole, terpinen-4-ol, nerolidol lin lool v.v , 1,8cineole, terpinen-4-ol loại tinh dầu đƣợc tiêu thụ nhiều nhất, tiếp đến nerolidol linalool có giá trị dƣợc liệu hƣơng liệu c o đƣợc dùng sản xuất nƣớc hoa m phẩm Khuất Thị Hải Ninh, 2016 Tràm trà (Melaleuca alternifolia Maiden & E Betche ex Cheel) chủ yếu đƣợc trồng để sản xuất tinh dầu giàu terpinen-4-ol Hiện loài đƣợc trồng phổ biến nhiều nơi có Việt Nam Bộ Nơng nghiệp Phát triển nông thôn gi o cho Viện Cải thiện giống Phát triển lâm sản chủ trì đề tài Nghiên cứu chọn giống, k thuật trồng chế biến tràm có suất tinh dầu c o đƣợc thực 10 năm, gồm gi i đoạn: gi i đoạn 2008-2012 , gi i đoạn 2013- 2017 GS.TS Lê Đình Khả làm chủ nhiệm Đề tài chọn công nhận giống đƣợc 28 giống, giống Tràm trà (A26.218 A32.23) dịng vơ tính có hàm lƣợng chất lƣợng tinh dầu cao Các giống tràm đƣợc Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn công nhận giống tiến k thuật theo định số 3229/QĐ-BNN-TCLN ngày 01 tháng năm 2017 Để phát triển giống Tràm trà vào sản xuất Bộ Nông Nghiệp & PTNT tiếp tục giao cho Viện Cải thiện giống Phát triển lâm sản chủ trì dự án ả Tràm trà (A36.217, A32.23, A26.218) mớ công nhận số tỉnh miền Bắc miề ” thực gi i đoạn 2019 -2023 Vì vậy, tiếp tục nghiên cứu hồn thiện k thuật nhân giống in vitro cho giống Tràm trà có triển vọng cần thiết Trong giới hạn củ đề tài tốt nghiệp đại học, lựa chọn dòng Tràm trà A32.23 A26.218 để thực ê u (Melaleuca alternifolia r t u t u tr in vitro” v ƢƠ Ề NGHIÊN C U TỔNG QUAN VẤ 1.1 ặ đ ểm sinh v t học sinh thái học Tràm trà 1.1.1 Đặ đ ểm sinh vật h c Tràm trà (tên khoa học: Melaleuca alternifolia) lồi thực vật có hoa Họ Đào kim nƣơng Myrt ce e , đƣợc miêu tả khoa học lần năm 1924 Cheel., 1924 Trong tự nhiên, gặp Tràm trà mọc ho ng nơi thấp vùng duyên hải từ D rling Downs Queensl nd tới Hunter River vùng đầm lầy New South W les thuộc Austr li Nguyễn Văn Minh , 2004) Tràm trà gỗ nhỏ c o tới 7m Thân th ng, vỏ trắng bóc thành nhiều lớp mỏng Tán rậm rạp Cành thƣờng r Wilson, 2018) Hình 1.1 Cây Tràm trà Australia (Nguồn: Photo S Goodwin Nov 1999 ©The Royal Botanic Gardens & Domain Trust) Lá đơn mọc sole, hình giáo dài, đầu nhọn dần, dài 1035mm, rộng 1mm; phiến mềm, nh n, màu lục sẫm, nhiều tinh dầu thơm Hàm lƣợng tinh dầu c o tháng có nhiệt độ ấm (Orwa cs., 2009) Horticulture, 27(2), pp 238–246 Available at: https://doi.org/10.1590/2447-536x.v27i2.2253 25 Minami M., Kita M., Nakaya T., Yamamoto T., Kuriyama H., Imanishi J 2003 ‘The inhibitory effect of essenti l oils on herpes simplex virus type-1 replication in vitro’, Microbiology nd Immunology, 47(9), pp 681–684 Available at: https://doi.org/10.1111/j.1348- 0421.2003.tb03431.x 26 Murvyn S., Terry R., Carolyn R 2013 ‘Ejuveni tion of m ture n tive tee tree Mel leuc lternifoli ’, 13 , pp 103–111 27 Nadia, M.T., Alina, W and Zaidah, R 2012 ‘Improvement of Shoot Regeneration of Potentially Medicinal Plant Melaleuca alternifolia Via Axill ry Shoot’, Jurn l Teknologi, 59 Av il ble t: https://doi.org/10.11113/jt.v59.1577 28 Orwa C., Mutua A., Kindt R., Jamnadass R., Anthony S (2009) ‘Mel leuc lternifoli ’, pp 1–5 29 Schnitzler P., Schön K., Reichling J 2001 ‘Antivir l ctivity of Australian tea tree oil and eucalyptus oil against herpes simplex virus in cell culture’, Die Ph rm zie, 56 , pp 343–347 30 Tong M.M., Altman P.M., Barnetson R.S 1992 ‘Te tree oil in the tre tment of tine pedis’, The Austr l si n Journ l of Derm tology, 33 , pp 145–149 Available at: https://doi.org/10.1111/j.1440- 0960.1992.tb00103.x 31 Williams L.R 1997 ‘The selection of superior trees of Mel leuca species to Provide Te Tree Oil for Thr peutic Use Abstr ct’, in IFEAT conference, Sevile 32 Williams L.R., Home V.N 1989 ‘Pl nt tion of Mel leuc lternifoli - A revit lized Austr li n Te Tree Oil industry’, in Proceedings of 11th International Congress of Essential Oils, Fragrances and Flavourcs New Delhi, India, pp 49–53 36 33 Wilson Peter.G (2018) NSW Flora Online, PlantNET Available at: https://plantnet.rbgsyd.nsw.gov.au/cgibin/NSWfl.pl?page=nswfl&lvl=sp&name=Melaleuca~alternifolia 34 Xiao Yufei, Chen Bowen, Liu Hailong, Qui Chihai, Zhang Ye, Zhang Xiaoning, Liu Xiongsheng 2017 ‘Mel leuc lternifoli cutting prop g tion method’ 35 Yohana de Oliveira, Fernanda Pinto, André Luís Lopes da Silva, Ivan Guedes, Luiz Antonio Biasi, Marguerite Quoirin 2010 ‘An efficient protocol for microprop g tion of Mel leuc lternifoli Cheel’, In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 46(2), pp 192–197 Available at: https://doi.org/10.1007/s11627-010-9287-6 37 PHẦN PHỤ BIỂU 38 Phụ biểu 01 Tỉ lệ m u nảy ch i dòng A32-23 x lý Javel 5% n đ khác cttn * sach Crosstabulation sach sach nhieem cttn 5phut Count Total 32 58 90 35.6% 64.4% 100.0% 67 23 90 % within cttn 74.4% 25.6% 100.0% 15phut Count % within cttn 28 31.1% 62 68.9% 90 100.0% 20phut Count 21 69 90 23.3% 148 41.1% 76.7% 212 58.9% 100.0% 360 100.0% % within cttn 10phut Count % within cttn Count % within cttn Total Phụ biểu 02 Kết kiểm tra tỉ lệ m u nảy ch i dòng A32-23 x lý Javel 5% n đ khác Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 57.919a 000 Likelihood Ratio 58.789 000 Linear-by-Linear Association 11.863 001 N of Valid Cases 360 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 37.00 39 Phụ biểu 03 Tỉ lệ m u nảy ch i dòng A26-218 x lý Javel 5% n đ khác cttn * sach Crosstabulation sach sach nhieem cttn 5phut Count Total 31 59 90 34.4% 65.6% 100.0% 70 20 90 % within cttn 77.8% 22.2% 100.0% 15phut Count % within cttn 27 30.0% 63 70.0% 90 100.0% 20phut Count 21 69 90 23.3% 149 41.4% 76.7% 211 58.6% 100.0% 360 100.0% % within cttn 10phut Count % within cttn Count % within cttn Total Phụ biểu 04 Kết kiểm tra tỉ lệ m u nảy ch i dòng A26-218 x lý Javel 5% n đ khác Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 67.823a 000 Likelihood Ratio 69.334 000 Linear-by-Linear Association 12.170 000 N of Valid Cases 360 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 37.25 40 Phụ biểu 05 Kiểm tra tỉ lệ m u tạo cụm ch i dòng tro trƣờng MS* bổ sung 0,2mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA + (0,2-1,5 mg/l BAP) Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 62.998a 000 Likelihood Ratio 72.548 000 Linear-by-Linear Association 55.116 000 N of Valid Cases 630 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 6.71 Phụ biểu 06 Kiểm tra Hệ s nhân ch i chiều cao ch i dòng A32.23 trƣờng MS* bổ sung 0,2mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA + (0,2-1,5 mg/l BAP) ANOVA HSNc Between Groups Within Groups Total Hchoi Between Groups Within Groups Total Sum of Squares df Mean Square F Sig 16.338 2.723 49.945 000 763 14 055 17.101 20 1.431 238 4.924 007 678 2.109 14 20 048 41 Phụ biểu 07 Kiểm tra tỉ lệ m u tạo cụm ch i dịng A.26.218 mơi trƣờng MS* bổ sung 0,2mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA + (0,2-1,5 mg/l BAP) Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 80.720a 000 Likelihood Ratio 83.882 000 Linear-by-Linear Association 68.066 000 N of Valid Cases 630 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 7.86 Phụ biểu 08 Kiểm tra Hệ s nhân ch i chiều cao ch i dòng A.26.218 trƣờng MS* bổ sung 0,2mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA + (0,2-1,5 mg/l BAP) ANOVA HSNc Between Groups Within Groups Total Hchoi Between Groups Within Groups Total Sum of Squares df Mean Square F Sig 19.634 3.272 66.058 000 694 20.328 14 20 050 1.532 255 3.565 023 1.002 2.534 14 20 072 42 Phụ biểu 09 Kết kiểm tra tỉ lệ ch i hữu hiệu dòng A32-23 mơi trƣờng MS* có bổ sung mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA + (0,1-0,5 mg/l) Kinetin Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 11.429a 022 Likelihood Ratio 13.115 011 Linear-by-Linear Association 11.136 001 N of Valid Cases 450 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 6.00 Phụ biểu 10 Kết kiểm tra hệ s nhân ch i chiều cao ch i dòng A.32tro trƣờng MS* có bổ sung mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA + (0,1-0,5 mg/l) Kinetin ANOVA Sum of Mean Squares df Square F Sig 4.425 1.106 19.298 000 Within Groups 573 10 057 Total 4.998 14 916 229 3.529 048 Within Groups 649 10 065 Total 1.564 14 HSNc Between Groups Hchoi Between Groups 43 Phụ biểu 11 Kết kiểm tra tỉ lệ ch i hữu hiệu dịng A.26.218 mơi trƣờng MS* có bổ sung mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA + (0,1-0,5 mg/l) Kinetin Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 15.467a 004 Likelihood Ratio 16.915 002 Linear-by-Linear Association 15.395 000 N of Valid Cases 450 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 8.80 Phụ biểu 12 Kết kiểm tra hệ s nhân ch i chiều cao ch i dịng tro trƣờng MS* có bổ sung mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA + (0,1-0,5 mg/l) Kinetin ANOVA Sum of Mean Squares df Square F Sig 2.288 572 9.193 002 Within Groups 622 10 062 Total 2.911 14 1.935 484 11.337 001 Within Groups 427 10 043 Total 2.361 14 HSNc Between Groups Hchoi Between Groups 44 Phụ biểu 13 Kết kiểm tra tỉ lệ ch i hữu hiệu dòng A.32-23 chế đ ánh sáng khác Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 16.428a 000 Likelihood Ratio 18.898 000 Linear-by-Linear Association 16.282 000 N of Valid Cases 270 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 8.67 Phụ biểu 14 Kết kiểm tra chiều cao ch i dòng A.32-23 chế đ ánh sáng khác ANOVA Hchoi Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 649 324 14.354 005 Within Groups 136 023 Total 784 45 Phụ biểu 15 Kết kiểm tra tỉ lệ ch i hữu hiệu dòng A26-218 chế đ ánh sáng khác Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 13.968a 001 Likelihood Ratio 16.302 000 Linear-by-Linear Association 13.526 000 N of Valid Cases 270 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 12.33 Phụ biểu 16 Kết kiểm tra chiều cao ch i dòng A A26-218 chế đ ánh sáng khác ANOVA Hchoi Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 554 277 26.515 001 Within Groups 063 010 Total 617 46 Phụ biểu 17 Kết kiểm tra tỉ lệ rễ dòng A32-23 s dụng IBA n đ khác Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 12.392a 006 Likelihood Ratio 14.327 002 Linear-by-Linear Association 494 482 N of Valid Cases 360 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 7.00 Phụ biểu 18 Kết kiểm tra tỉ lệ rễ dòng A26-218 s dụng IBA n đ khác Chi-Square Tests Asymp Sig (2Value df sided) Pearson Chi-Square 9.422a 024 Likelihood Ratio 11.736 008 Linear-by-Linear Association 248 618 N of Valid Cases 360 a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 11.25 47 Phụ biểu 19 Kết s lƣợng rễ chiều dài rễ dòng A32-23 s dụng IBA n đ khác ANOVA Sum of slre Squares df Square F Sig 2.393 798 17.681 001 Within Groups 361 045 Total 2.754 11 217 072 4.635 037 Within Groups 125 016 Total 341 11 Between Groups Lre Mean Between Groups Phụ biểu 20 Kết s lƣợng rễ chiều dài rễ dòng A26-218 s dụng IBA n đ khác ANOVA Sum of slre Squares df Square F Sig 4.532 1.511 36.514 000 Within Groups 331 041 Total 4.863 11 151 050 7.309 011 Within Groups 055 007 Total 206 11 Between Groups Lre Mean Between Groups 48 Phụ biểu 21 Tỷ lệ s ng (%) in vitro dòng A32.23 tr ng giá thể khác vƣờ ƣơ sau t Phụ biểu 22 Kết kiểm tra tỷ lệ s ng (%) in vitro dòng A32.23 tr ng giá thể khác vƣờ ƣơ sau t Phụ biểu 23 Chiều cao dòng A32.23 tr ng giá thể khác vƣờ ƣơ sau 49 t Phụ biểu 24 Kết kiểm tra chiều cao dòng A32.23 tr ng giá thể khác vƣờ ƣơ sau t Phụ biểu 25 Kết kiểm tra tỷ lệ s ng (%) in vitro dòng A26.218 tr ng giá thể khác vƣờ ƣơ sau t Phụ biểu 26 Kết kiểm tra chiều cao dòng A26.218 tr ng giá thể khác vƣờ ƣơ 50 sau t