Nghiên cứu lưu giữ và nhân nhanh giống thuần cà chua DT28 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro pptx

NGHIÊN CỨU LƯU GIỮ VÀ NHÂN NHANH GIỐNG THUẦN CÀ CHUA DT28 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Trịnh Thị Thanh Hương 1 , Lê Thanh Nhuận 1 , Lê Thị Liễu 1 , Nguyễn Ngọc Lan 1 , Đặng Trọng Lương 1 , Đinh Văn Luyện 1 SUMMARY Callus induction, micropropagation and in vitro conservation of tomato Lycopersicon esculentum via cotyledon culture Different growth regulators combinations were tested on the production of cotyledon callus in tomato cultivar DT28. Calli were induced on media supplemented with 1.0mgL-α- naphthaleneacetic acid (NAA), 0.5mgL-1 6-benzylaminopurine (BAP), or with 1.0mgL-1 2,4D plus 1.0mgL-1 NAA. The medium containing 0.5mgL-1 BAP and 1.0mgL-1 NAA produced the highest calli frequency, and promoted plant regeneration by indirect organogenesis, when calli were transferred to 1mgL-1 BAP and 1mgL-1 Zeatin. Plants regenerated reaches 3-4 cm in length were transferred to the rooted medium supplemented with 1mgL-1IBA,, after two weeks in culture, plants rooted with rate one handred percent. In addition, the The effects of sorbitol and manitol concentrations and low temperature on in vitro conservation of tomato have been examined. Sorbitol and manitol concentrations of 20 g 1-l and 20 g 1-l and temperatures of 20°C -23 o C revealed slow growth for 12 months in 68% of tomato samples survived Keywords: DT28 tomato variety, growth regulators, α-naphthaleneacetic acid (α-NAA), 6- benzylaminopurine (BAP), Kinetin, sorbitol, manitol, cotyledon. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cà chua (Lycopersicon esculentum) là một trong những cây rau cao cấp chủ lực được trồng ở hầu hết các nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Cà chua giàu vitamin A, C và chất xơ, không chứa cholesterol (Hobson và Davies, 1971). Trung bình 148 g cà chua chỉ chứa 35 calories và trong 100 g quả khô chứa xấp xỉ 20 - 50 mg lycopene. Lycopene là chất có tác dụng chống oxi hoá bảo vệ con người tránh được các gốc tự do làm phân huỷ các tế bào của cơ thể, ngăn ngừa bệnh ung thư. Phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã phát triển rộng rãi kể từ những năm 1930, khi các nhà khoa học sử dụng kỹ thuật này để nuôi cấy các tế bào. Gần đây việc nuôi cấy mô được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh cây giống thông qua giai đoạn tạo callus, nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần, nuôi cấy lục lạp. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ hữu ích trong cải tiến cây trồng. Đã có nhiều nghiên cứu về nuôi cấy mô cây cà chua, trong đó phải kể đến là các nghiên cứu tái sinh cây cà chua từ callus có nguồn gốc từ lá thật và lá mầm hoặc nuôi cấy lát mỏng (Compton và Veilleux, 1991; Vnuchkova, 1977a, b; Hamza và Chupeau, 1993). Sự tái sinh in vitro thông qua phát sinh các cơ quan và phát sinh phôi vô tính đã được sử dụng trong nhân nhanh các dòng, giống cà chua đồng nhất về mặt di truyền. Sự tái sinh chồi từ rễ gần đây cũng đã được nghiên cứu (Koornneeff và CS, 1993). Ngoài ra Faria và CS (1996) cũng đã 1 Viện Di truyền Nông nghiệp. thành công trong việc tạo chồi từ callus có nguồn gốc từ trụ dưới lá mầm và nuôi cấy tế bào trần (Morgan và Cocking, 1982). Bảo quản, lưu giữ in vitro các nguồn gen đã có những bước tiến đáng kể từ năm 1975, CIP đã góp phần phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô để bảo quản in vitro tập đoàn khoai tây (Roca, 1975), khoai lang (Siguenas, 1987) và cây cà chua (Toledo và cộng sự, 1994). Bảo quản in vitro là phương pháp hiệu quả và hữu hiệu nhất để phân loại các vật liệu vô tính. Phương pháp này giúp các vật liệu trở nên sẵn có, tránh được sự lây nhiễm các nguồn bệnh chính và có khả năng loại trừ virus thông qua nuôi cấy in vitro (Roca và cộng sự, 1979; George, 1993). Ngoài ra, phương pháp bảo quản in vitro còn tiết kiệm hơn phương pháp bảo quản lạnh sâu các loài sinh sản vô tính sinh trưởng ngoài đồng ruộng (Florkowski và Jarret,1990). Việc nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy in vitro trong lưu giữ và nhân nhanh giống cà chua đang là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu. Vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu tái sinh cây cà chua và bảo quản in vitro, phục vụ cho công tác nhân giống và giữ giống. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu Vật liệu là giống cà chua DT28 do Trung tâm Thực nghiệm Sinh học nông nghiệp công nghệ cao, Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp. 2. ội dung nghiên cứu Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho nuôi cấy mô in vitro cây cà chua. Nghiên cứu tạo callus, tái sinh cây và tạo rễ cây. Từ đó đưa ra quy trình tái sinh cây cà chua. Cải tiến chế độ nuôi cấy để lưu giữ các mẫu giống cà chua nuôi cấy. 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Khử trùng mẫu Sử dụng các hợp chất HgCl 2 0,2% và NaClO 5%. Hạt sau khi khử trùng được gieo vào môi trường (I): MS (Murashige and Skoog) + 8 g/l agar + 30 g/l đường. Theo dõi sau 2-3 ngày nuôi cấy. 3.2. Các công thức môi trường nuôi cấy Ký hiệu công thức môi trường BAP (mg/l) 2,4D (mg/l) NAA (mg/l) Số mẫu cấy C1 0,5 0 1 1000 C2 1 0 1 1000 C3 1,5 0 1 1000 C4 2 0 1 1000 C5 0 1 1 1000 C6 0 1,5 1 1000 C7 0 2 1 1000 Công thức môi trường BAP (mg/l) Zeatin (mg/l) NAA (mg/l) Số mẫu cấy C8 0,5 0,5 1000 C9 0,5 1 1000 C10 0,5 1,5 1000 C11 0,5 2 1000 C12 0,5 2,5 1000 3.3. Môi trường tạo callus từ lá mầm cà chua Cây con sau gieo hạt từ 7-10 ngày tuổi, tách lá mầm và thân chuyển vào môi trường tạo callus. Môi trường MS có bổ sung các thành phần: 8 g/l agar + 30 g/l đường và các phytohormon 2,4-D, BAP, NAA. Sau khoảng 2-3 tuần thì bắt đầu theo dõi và đánh giá kết quả tạo callus của các môi trường khác nhau. 3.4. Môi trường tái sinh cây cà chua Những callus được tạo thành có màu xanh và xốp là những callus có khả năng tái sinh thành cây và sẽ được chuyển sang môi trường tái sinh cây. Môi trường tái sinh cây là môi trường (I) và bổ sung một số phytohormon như NAA, BAP và Zeatin. Đánh giá tỷ lệ tái sinh cây và chất lượng cây tái sinh. 3.5. Môi trường tạo rễ cà chua Những cây tái sinh mà sinh trưởng và phát triển tốt thì tiếp tục chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ cây là môi trường bổ sung các phytohormon như NAA, IBA. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo rễ cây và khả năng sinh trưởng của cây. 3.6. Phương pháp bảo quản, lưu giữ cà chua in vitro Bảo quản ngắn hạn dựa vào hàm lượng đường sorbitol và manitol, chế độ chiếu sáng 1000 lux và nhiệt độ nuôi cấy 20-23 0 C. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. ghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và các chất khử trùng đến khả năng nảy mầm của hạt cà chua Hạt cà chua được khử trùng bằng HgCl 2 0,2% và NaOCl 5% trong 3 khoảng thời gian khác nhau. Sau khi hạt gieo được 3-5 ngày, chúng tôi tiến hành theo dõi và đánh giá hiệu quả của các chất khử trùng và ảnh hưởng của chúng đến khả năng nảy mầm của hạt. Kết quả thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. ghiên cứu ảnh hưởng của các chất khử trùng và thời gian xử lý đến khả năng nảy mầm của hạt cà chua HgCl 2 0,2% NaOCl 5% Thời gian (phút) 10 12 15 15 20 25 Tỷ lệ nhiễm (%) 5 3 0 20 15 5 Tỷ lệ cây sống (%) 42 35 10 78 80 85 Tỷ lệ chết (%) 53 62 90 2 5 10 Qua bảng 1 cho thấy: Khi khử trùng bằng HgCl 2 0,2% thì tỷ lệ cây sống tỷ lệ nghịch với thời gian khử trùng, có nghĩa là thời gian khử trùng tăng thì tỷ lệ cây sống giảm. Mặc dù tỷ lệ nhiễm không cao nhưng hạt bị chết nhiều, khả năng nảy mầm kém nên tỷ lệ sống không cao. Ở nồng độ HgCl 2 0,2%, tỷ lệ cây sống đạt cao nhất là 42% ở thời gian khử trùng là 10 phút. Trong khi đó khử trùng bằng NaOCl 5% thì hiệu quả ngược lại, tỷ lệ cây sống tăng theo chiều tăng thời gian khử trùng. Ở nồng độ này tỷ lệ cây sống đạt cao nhất là 85% với thời gian khử trùng là 25 phút. Khi khử trùng bằng NaOCl 5%, hạt cà chua bị nhiễm khuNn và nm nhiu, tuy nhiên t l cây sng li cao hơn khi kh trùng bng HgCl 2 0,2%. iu ó cho thy kh trùng bng N aOCl 5% t hiu qu cao hơn so vi HgCl 2 . 2. ghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo callus từ lá mầm cà chua Các mu lá mm 7-10 ngày tui và các t thân ưc cy vào môi trưng to callus.  thí nghim này, chúng tôi tin hành nghiên cu nh hưng ca hai t hp BAP + N AA và 2,4D + N AA n kh năng to callus t mu lá mm và mu t thân. 2.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và AA đến khả năng tạo callus cà chua Các mu lá mm và t thân ưc cy vào môi trưng có b sung BAP và N AA. Sau hai tun nuôi cy, theo dõi và ánh giá kh năng to callus và s phát sinh hình thái ca mu nuôi cy. Kt qu ưc th hin  bng 2. Bảng 2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và AA đến khả năng tạo callus cà chua Công thức môi trường Mô lá Mô thân Tỷ lệ tạo callus (%) Tỷ lệ tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ tạo callus (%) Tỷ lệ tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) C1 50 2 48 75 5 20 C2 39 5 56 56 12 32 C3 21 0 79 43 27 30 C4 15 0 85 35 46 19 Theo kt qu ca bng 2, ta thy khi tăng nng  BAP t 0,5 mg/ml n 2 mg/ml thì t l to callus gim dn. i vi mu lá, khi cy vào môi trưng to callus thì mu cht nhiu, t l to callus t cao nht là 50% (Môi trưng MS b sung 0,5 mg/ml BAP và 1 mg/ml NAA. Trong khi đó, mô thân tạo callus đạt tỷ lệ cao hơn so với mô lá. Cũng ở môi trường C1, mô thân đạt tỷ lệ tạo callus cao nhất là 75%. Như vậy để tạo callus cà chua nên sử dụng lá mầm và cấy trong môi trường có bổ sung 0,5 mg/ml BAP và 1 mg/ml NAA. A B Ảnh 1A: Callus tạo thành trên môi trường có bổ sung BAP và NAA Ảnh 1B: Callus tạo thành trên môi trường có bổ sung 2,4D và NAA 2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D và AA đến khả năng tạo callus cà chua Tương tự như với tổ hợp BAP + NAA, ở thí nghiệm này chúng tôi cũng tiến hành tạo callus từ hai nguồn mẫu đó là mô lá và mô thân. Nồng độ 2,4D được bổ sung vào môi trường theo dải gradient là từ 1-1,5-2 mg/ml, còn NAA giữ nguyên ở nồng độ 1 mg/l. Bảng 3. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D và AA đến khả năng tạo callus cà chua Công thức môi trường Mô lá Mô thân Tỷ lệ tạo callus (%) Tỷ lệ tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ tạo callus (%) Tỷ lệ tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) C5 15 0 85 35 0 65 C6 21 0 79 41 0 59 C7 30 0 70 56 0 44 Kt qu thu ưc  bng 3 cho thy: T l to callus ca mu cy t l thun vi nng  2,4D. Có nghĩa là khi tăng nng  2,4D thì các mu có xu hưng to callus càng cao.  môi trưng có b sung 2 mg/ml 2,4D + 1 mg/l NAA, mẫu tạo callus đạt tỷ lệ cao nhất là: 30% (đối với mô lá) và 56% (đối với mô thân). Tuy nhiên, tỷ lệ tạo callus khi bổ sung 2,4D + NAA lại không cao bằng môi trường có bổ sung BAP + NAA. Mặt khác, các callus hình thành trên các môi trường này không tơi xốp, trắng vàng như trên môi trường có bổ sung BAP và NAA. Như vậy, môi trường tốt nhất để tạo callus cà chua là môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BAP + 1 mg/l NAA (môi trường C1). 3. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh cây cà chua từ callus Đối với thí nghiệm tái sinh cây cà chua, những callus đẹp, có màu xanh, có khả năng tái sinh tốt sẽ được chuyển sang môi trường tái sinh. Môi trường tái sinh callus cà chua có chứa thành phần cơ bản của MS và bổ sung một số phytohormon. Sau 3 tuần chuyển sang môi trường thí nghiệm, bắt đầu theo dõi và đánh giá hiệu quả tái sinh callus. Bảng 4. Ảnh hưởng các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh cây cà chua từ callus Công thức môi trường Tỷ lệ tái sinh (%) Hình thái callus C8 68 Callus có màu xanh, bắt đầu xuất hiện chồi C9 87 Callus có màu xanh, bắt đầu xuất hiện chồi C10 11 Callus lúc đầu có màu xanh, sau phát triển to hơn, xốp hơn và có màu xám C11 8 Callus lúc đầu có màu xanh, sau có màu xám C12 12 Callus có màu xanh, phát triển to hơn, chuyển màu xanh nhạt Qua kt qu bng 4 thy rng mu callus tái sinh tt nht trên môi trưng có b sung 1 mg/l Zeatin và 0,5 mg/l BAP, còn trên các môi trưng khác t l tái sinh ca callus rt kém và mu thí nghim thm chí còn b cht dn. Những đánh giá của nghiên cứu này trùng khớp với nhận xét của Koornneeff và CS (1993). Ngoài ra, chúng tôi còn nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp Zeatin và BAP đến nhân nhanh chồi, kết quả này được nêu lên trong bảng 5. Ảnh 2. Sự phân hoá và phát sinh chồi trên môi trường tái sinh Bảng 5. Ảnh hưởng của tổ hợp Zeatin và BAP đến nhân nhanh chồi sau 7 tuần nuôi cấy CT Chất ĐTST (mg/l môi trường) HSN (lần) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi (lá) Hình thái chồi Zeatin BAP 1 (Đ/C) 0 0 1 2,21 1,5 Chồi nhỏ, lá nhỏ, thân lá xanh nhạt C8 0,5 0,5 1,82 5,16 2,6 Thân nhỏ, lá nhỏ, thân lá xanh nhạt C9 1 0,5 4,93 3,84 4,3 Thân trung bình, lá nhỏ, xanh nhạt C10 1,5 0,5 4,29 4,09 3,7 Thân nhỏ, lá trung bình, xanh nhạt C11 2 0,5 3,46 4,44 3,0 Thân nhỏ, lá trung bình, xanh nhạt C12 2,5 0,5 2,59 4,97 2,1 Thân nhỏ, lá trung bình, xanh nhạt LSD (5%) 0,12 0,12 0,15 Các s liu  bng 5 cho thy: Ngoài công thức đối chứng có số chồi không tăng, các công thức còn lại đều có số chồi tăng lên rõ rệt, tuy nhiên mức độ tăng có khác nhau. Động thái đẻ chồi của công thức C9 (1 mg/l Zeatin + 0,5 mg/l BAP) luôn có sự vượt trội ngay từ những tuần đầu. Ở thời điểm 7 tuần sau nuôi cấy, số chồi ở công thức này đã lên đến 141,3 chồi và đạt hệ số nhân cao nhất (4,93 lần). Trong số các công thức thí nghiệm có bổ sung Zeatin và BAP thì công thức C12 (2,5 mg/l Zeatin + 0,5 mg/l BAP) có hệ số nhân chồi thấp nhất (1,82 lần). Chất lượng chồi ở tất cả các công thức còn lại nhìn chung không cao, thân chồi từ nhỏ đến trung bình, kích thước lá cũng nhỏ, số lá từ ít đến trung bình. Tuy nhiên, các chồi ở công thức C9 có biểu hiện sinh trưởng tốt hơn 5 công thức còn lại. Công thức có chiều cao chồi trung bình cao nhất là công thức C12 (5,16 cm), thấp nhất là công thức C9 (3,84 cm) (không kể công thức đối chứng). Số lá trung bình nhiều nhất ở công thức C9 (4,3 lá/chồi), ít nhất ở công thức C12 (2,1 lá/chồi). Mầu sắc thân lá chồi của các công thức đều kém, nhạt hơn nhiều so với giống. Tóm lại, công thức C9 với hàm lượng chất điều tiết sinh trưởng là 1 mg/l Zeatin + 0,5 mg/l BAP là công thức nhân nhanh chồi tốt nhất trong số các công thức thí nghiệm, biểu hiện là hệ số nhân cao nhất và chất lượng chồi cũng tốt nhất. 4. Ảnh hưởng của AA và IBA đến khả năng tạo rễ cây cà chua Thí nghiệm tạo rễ cây cà chua được thực hiện đối với các chồi tái sinh. Môi trường thí nghiệm ra rễ cũng có chứa các thành phần cơ bản của MS và bổ sung các phytohormon khác nhau. Kết quả thu được ở bảng 6 cho thấy: môi trường có bổ sung IBA cho khả năng ra rễ tốt hơn NAA. Các mẫu cấy trên môi trường bổ sung 1 mg/l IBA tỷ lệ ra rễ 100%, trong khi đó môi trường bổ sung 1mg/l và 2mg/ml NAA chỉ ra rễ cao nhất là 19% (đối với mẫu chồi ngọn, chồi tái sinh) và 9% (đối với mẫu chồi thân). Bảng 6. Ảnh hưởng AA và IBA đến khả năng ra rễ cây cà chua Công thức môi trường Chồi ngọn, chồi tái sinh Chồi thân Tỷ lệ ra rễ (%) Hình thái cây Hình thái rễ Tỷ lệ ra rễ (%) Hình thái cây Hình thái rễ C14 13 Không tạo chồi ngọn Có nhiều rễ, rễ ngắn 7 Tốt Nhiều rễ, rễ ngắn C15 17 Không tạo chồi ngọn Có nhiều rễ, rễ ngắn 9 Tốt Nhiều rễ, rễ ngắn C16 100 Có tạo chồi ngọn Nhiều rễ, rễ dài 100 Tốt Nhiều rễ, rễ dài C17 100 Có tạo chồi ngọn Nhiều rễ, rễ dài 100 Tốt Nhiều rễ, rễ dài Qua kt qu bng 6 thy rng, cà chua ra r tt trên môi trưng có cha IBA và thi gian bt u cm ng r nhanh hơn so vi môi trường chứa NAA. Tuy nhiên những chồi cho cảm ứng rễ trên môi trường có NAA có rất nhiều rễ, rễ ngắn nhưng khoẻ. Vì vậy môi trường tốt nhất để tạo ra cây cà chua là môi trường có bổ sung 1 mg/ml IBA. Ảnh 3. Cây cà chua trên môi trường ra rễ 5. ghiên cứu bảo quản, lưu giữ cà chua in vitro ngắn hạn ây là nhng quy trình hoàn thin  vi nhân ging và bo qun cây cà chua (Toledo và cng s, 1994). Các mu ging em vào lưu gi ưc xác nh là các mu ã tái sinh nhưng dưi dng chi. K thut bo qun in vitro ngn hn tp oàn cà chua ca nghiên cu này ưc trình bày sau ây. Các mu b sung ưc bo qun trong môi trưng b sung 1,5% và 2% sorbitol và 2% manitol  nhit  20-23 o C và cưng  ánh sáng 1000 lux. Phương pháp này giúp kéo dài thi gian bo qun cà chua 6 tháng-12 tháng mà không cn cy chuyn (bng 7). Bảng 7. Tỷ lệ mẫu sống sót sau 12 tháng lưu giữ in vitro Số tháng 2% sorbitol và 2% manitol 1,5% sorbitol và 2% manitol 2% sorbitol 3 100 100 100 6 90 85 72 8 75 72 62 10 70 65 54 12 68 56 43 18 46 41 34 T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 8 Cà chua là cây trng nhit i nên thưng mt kh năng phát trin trong iu kin nhit  thp hơn iu kin nhit  cn thit cho s phát trin ngoài ng rung. Tuy nhiên cây cà chua vn có kh năng sinh trưng  nhit  thp hơn mt vài  C vi iu kin nhit  thông thưng. Cây cà chua ưc trng  nhit  dưi 15 o C trong thi gian dài ã cho thy nhng tác ng bt li như s phenol hoá hay s cht hoi (Desamero, 1990). Nghiên cứu của các tác giả đã chỉ ra rằng nhiệt độ từ 16-18 o C kéo dài thời gian bảo quản tối đa là 1 năm trong môi trường bổ sung sorbitol 2%. Tuy nhiên các tác động bất lợi xuất hiện ở 25% mẫu giống cà chua in vitro. Nhiệt độ từ 18-21 o C cũng đã được thí nghiệm. Môi trường nuôi cấy chứa 2% sorbitol bảo quản ở nhiệt độ từ 23-25 o C, cường độ chiếu sáng 3000 lux (Lizarraga và cộng sự, 1990) đã duy trì thành công tập đoàn cà chua trong vòng 6 tháng không cần cấy chuyển. Mới đây, một môi trường mới chứa 2% sorbitol và 2% mannitol đã được kiểm tra sử dụng để lưu giữ giống cà chua DT28. Tỉ lệ sống của chúng là 90% sau 6 tháng bảo quản và số mẫu sống sót tối thiểu là 68% (bảng 7). Việc thống kê với vài trăm mẫu đưa vào của các giống khác cũng đang được tiến hành. IV. KẾT LUẬN Qua những kết quả nghiên cứu trình bày ở trên, chúng tôi rút ra những kết luận dưới đây: 1. Hiệu quả khử trùng tốt nhất là sử dụng NaOCl 5% trong thi gian 25 phút. 2. Nguồn mẫu tốt nhất để tạo callus là lá mầm và môi trường cho khả năng tạo callus tốt nhất là C1 (có bổ sung 0,5 mg/ml BAP và 1 mg/ml NAA). 3. Môi trường tái sinh cây từ callus thích hợp nhất là C9 (bổ sung 0,5 mg/l BAP và 1 mg/l zeatin). 4. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là bổ sung 1 mg/l IBA. 5. Kỹ thuật lưu giữ cà chua in vitro được xác định là môi trường nuôi cấy bổ sung 2% Sorbitol và 2% Manitol, chế độ chiếu sáng duy trì ở 1000 lux và nhiệt độ thích hợp 20- 23 0 C TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. PGS.TS. Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB. Khoa học và Kỹ thuật, 260 trang. 2. guyễn Văn Thắng, Trần Khắc Thi, 2000. Sổ tay người trồng rau, NXB. Nông nghiệp. 3. Đỗ ăng Vịnh, 2005. Công nghệ thực vật tế bào ứng dụng, NXB. Nông nghiệp, 252 trang. 4. Bhatia B., Ashwath ., Senaratna T. và Midmore D., 2004. “Tissue culture studies of tomato”, Plant cell, tissue and organ culture, 78. 5. Brasileiro A.C., Willadino L., Carvalheiro G. và Guerra M., 1999. “Callus induction and plant regeneration of tomato via anther culture”, Ciência Rural, Santa Maria, 29 (4), p919-623. 6. Jozef Gubis Z., Lajchová Z., Faragó J., Zureková Z., 2004. “Effect of growth regulators on shoot induction and plant regeneration in tomato (Lycopersicon Esculentum Mill)”, Biologia, Bratislava, p. 405-408. 7. Jose´ M. Seguı´-Simarro* and Fernando uez, 2007. “Embryogenesis induction, callogenesis, and plant regeneration by in vitro culture of tomato isolatedmicrospores and whole anthers”, Journal of Experimental Botany, P1-14. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 9 8. Rhaman M., Asaduzzaman M., ahar . và Bari M A., 2006. “Efficient plant regeneration from cotyledon and midrib dirived callus in eggplant (Solanum melongena L.)”, Bio-sci, p31-38. gười phản biện: Trần Duy Quý . mô in vitro cây cà chua. Nghiên cứu tạo callus, tái sinh cây và tạo rễ cây. Từ đó đưa ra quy trình tái sinh cây cà chua. Cải tiến chế độ nuôi cấy để lưu giữ các mẫu giống cà chua nuôi cấy. . NGHIÊN CỨU LƯU GIỮ VÀ NHÂN NHANH GIỐNG THUẦN CÀ CHUA DT28 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Trịnh Thị Thanh Hương 1 , Lê Thanh Nhuận 1 , Lê. quan tâm nghiên cứu. Vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu tái sinh cây cà chua và bảo quản in vitro, phục vụ cho công tác nhân giống và giữ giống. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.