4. Ý nghĩa của đề tài
2.3.2.2.Thí nghiệm 2: Quá trình phátsinh hình thái mô sẹo ở câyĐinh lăng
từ lá non và thân cây
Sau khi xác định đƣợc công thức tạo mô sẹo tốt nhất sau 8 tuần nuôi cấy, chúng tôi chuyển mô sẹo đã hình thành sang môi trƣờng MS có bổ sung BAP, Kinetin ở các nồng độ khác nhau để theo dõi ảnh hƣởng của BAP, Kinetin đến sự phát sinh hình thái mô sẹo cây Đinh lăng. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với các công thức sau:
Bảng 2.2. Công thức xác định ảnh hƣởng của BAP, Kinetin đến quá trình phát sinh hình thái mô sẹo cây Đinh lăng
Công thức Môi trƣờng ĐC MS T1 BAP 1 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l T2 BAP 1 mg/l + Kinetin 1 mg/l T3 BAP 3 mg/l + Kinetin 1 mg/l T4 BAP 3 mg/l
Theo dõi sự phát sinh phôi của cây Đinh lăng qua 4 giai đoạn sau: - Giai đoạn phôi hình cầu.
29 - Giai đoạn phôi hình “cá đuối”. - Giai đoạn phôi trƣởng thành.
Chúng tôi tiến hành chụp ảnh hình thái phôi ở các giai đoạn sử dụng kính hiển vi soi nổi.
2.3.2.3. Thí nghiệm3: Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng)
Các chồi tái sinh sau khi thực hiện thí nghiệm 2 có chiều cao 2 – 3 cm chúng tôi tiến hành cắt đƣa vào môi trƣờng MS có bổ sung NAA với nồng độ khác nhau, để xác định hiệu quả của NAA đến khả năng tạo rễ cọc của cây Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo nhằm đạt hiệu quả kinh tế cao.Thí nghiệm đƣợc tiến hành với các công thức sau:
Bảng 2.3.Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng
Công thức Môi trƣờng
ĐC MS
T1 MS + NAA 0,3 mg/l
T2 MS + NAA 0,5 mg/l
Chỉ tiêu theo dõi:
- Công thức nào tạo rễ cọc và công thức nào tạo rễ chùm.
- Chiều dài rễ tái sinh từ mô sẹo (cm) sau 4 tuần so với rễ chồi đỉnh Đinh lăng đƣợc tạo ra bằng phƣơng phƣơng pháp tạo đa chồi.
30
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L). Harms) Harms)
Kỹ thuật tạo dòng các tế bào đơn đƣợc phân lập trong điều kiện in vitro
đã chứng minh một thực tế rằng các tế bào soma, dƣới các điều kiện thích hợp, có thể phân hóa để phát triển thành một cơ thể thực vật hoàn chỉnh. Sự phát triển của một cơ thể trƣởng thành từ tế bào đơn (hợp tử) là kết quả của sự hợp nhất sự phân chia và phân hóa tế bào. Để biểu hiện tính toàn thế, các tế bào phân hóa đầu tiên trải qua giai đoạn phản phân hóa và sau đó là giai đoạn tái phân hóa. Hiện tƣợng tế bào trƣởng thành trở lại trạng thái phân sinh và tạo ra mô callus không phân hóa đƣợc gọi là phản phân hóa, trong khi khả năng để các tế bào phản phân hóa tạo thành cây hoàn chỉnh hoặc các cơ quan thực vật đƣợc gọi là tái phân hóa.
Mô sẹo đƣợc tạo thành phụ thuộc vào việc sử dụng auxin riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin, bản chất hay nồng độ của auxin. Mặt khác auxin đặc biệt là 2,4 – D đƣợc sử dụng thƣờng xuyên trong cảm ứng tạo mô sẹo ở nhiều loài thực vật. Ngoài ra auxin cần thiết để tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi ở nhiều loài thực vật.
Thí nghiệm này là tìm ra môi trƣờng có nồng độ auxin và cytokinin tốt nhất để tạo mô sẹo cây Đinh lăng dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm sau.
3.1.1. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 2 tuần ở các công thức tuần ở các công thức
- ĐC (môi trƣờng MS):
Lá và phần thân cây vẫn giữ nguyên trạng thái ban đầu là có màu xanh.
31 Lá và cuống thân vẫn xanh.
Phần vết cắt, rìa lá và cuống thân tiếp xúc trực tiếp với môi trƣờng có dấu hiệu có khả năng tạo thành mô sẹo thấy xuất hiện màu kem trắng, những phần đó phồng ra không đáng kể.
- T2 (môi trƣờng MS + 2,4 - D 2,5 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l): Lá và cuống thân vẫn xanh.
Phần vết cắt màu vàng nhạt,phồng ra không đáng kể, và phần vết cắt phồng ra kích thƣớc nhỏ hơn môi trƣờng T1 trông thấy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- T3 (môi trƣờng MS + 2,4 - D 3 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l): Lá và cuống thân vẫn xanh.
Phần vết cắt màu vàng hơi nâu, phồng ra không đáng kể, và phần vết cắt phồng ra kích thƣớc nhỏ hơn môi trƣờng T1 trông thấy.
32
CT T2 CT T3
Hình 3.1.1. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 2 tuần
3.1.2. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 4 tuần ở các công thức tuần ở các công thức
- ĐC:
Lá và phần thân cây vẫn giữ nguyên trạng thái ban đầu là có màu xanh. - T1:
Tế bào mô sẹo xuất hiện quanh vị trí vết cắt và rìa lá tiếp tục gia tăng kích thƣớc và có màu kem trắng.
Phần lá xanh sát nơi phồng tạo mô sẹo trở nên xanh nhạt, hơi trắng, và to hơn ban đầu.
Những phần lá còn lại vẫn xanh nhƣ trƣớc. - T2:
Phần lá và cuống thân tạo mô sẹo lan rộng hơn nhƣng kích thƣớc vẫn nhỏ hơn môi trƣờng T1, có màu vàng nghệ. Một phần rìa lá nhỏ bị úa vàng và chết.
33 - T3:
Kích thƣớc phần mô sẹo đƣợc tạo thành nhỏ hơn môi trƣờng T1.
Phần mô sẹo có màu vàng nâu , một phần rìa lá bị úa vàng và chết nhiều hơn môi trƣờng T2.
34
CT T2
CT T3
35
3.1.3. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 8 tuần ở các công thức tuần ở các công thức
- Đa phần các môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu sắc mô sẹo nhƣ trƣớc, trọng lƣợng tƣơi tăng trƣởng ổn định, chỉ còn một phần nhỏ lá và cuống thân chƣa tạo mô sẹo.
- Môi trƣờng T1 có kích thƣớc mô sẹo lớn nhất, mô sẹo xốp nhất , màu sắc tƣơi nhất.
- Môi trƣờng T2, T3 có kích thƣớc nhỏ hơn, phần lá không tạo mô sẹo và bị chết nhiều nhất ở môi trƣờng T3.
36
CT T2 CT T3
37
3.1.4. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 14 tuần ở các công thức. tuần ở các công thức.
Mô sẹo đƣợc tạo thành và ổn định.
CT T1 CT T2 CT T3
Hình 3.1.4. (a) Mô sẹo Đinh lăng ở các công thức sau 14 tuần ở các công thức (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
38
CT T1
n
CT T2
CT T3
Hình 3.1.4. (b) Hiệu quả các môi trƣờng tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng
Kết quả cho thấy, mẫu sử dụng ở công thức ĐC không cho hiệu quả tạo mô sẹo, các mẫu vẫn giữ nguyên trạng thái lá ban đầu trong thời gian nuôi cấy. Các công thức từ T1 đến T3 cho thấy có khả năng tạo thành mô sẹo. Tuy nhiên có sự khác nhau về hiệu quả nhƣ sau: Hiệu quả tạo mô sẹo tốt nhất ở môi trƣờng T1, tiếp theo là T2, và T3. Kết quả này cho thấy, nồng độ 2,4 - D 2 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l là phù hợp nhất cho sự tạo mô sẹo ở lá non và thân cây Đinh lăng, sự gia tăng nồng độ 2,4 - D cũng đƣa lại hiệu quả tạo mô sẹo nhƣng không cao vì có biểu hiện mô sẹo không tƣơi, sức sống yếu và phần lá bị chết và không tạo mô sẹo nhiều.
39
Từ kết quả này, chúng tôi tìm ra môi trƣờng sử dụng tốt nhất cho sự tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng là môi trƣờng MS + 2,4 - D 2 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l.
3.2. Quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹo ở cây Đinh lăng từ lá non và thân cây thân cây
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhƣng do không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, và vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, các phôi vô tính có vật chất di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng.
Ở trƣờng hợp phôi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử. Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phôi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ và ngọn. Khi hợp tử phát triển, miền sinh trƣởng rễ và miền sinh trƣởng ngọn cùng phát triển và cuối cùng tạo thành cây hoàn chỉnh, qua các giai đoạn phôi học nhƣ sau:
- Trƣờng hợp cây hai lá mầm: Dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm
- Trƣờng hợp cây một lá mầm: Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu
Ở rất nhiều cây, ngƣời ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức đã tạo nên callus khi nuôi cấy. Có thể thay đổi hƣớng phát triển của chúng để tạo ra các phôi vô tính với các bƣớc phát sinh hình thái rất giống với trƣờng hợp phôi hữu tính. Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lƣợng và chất dinh dƣỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn không có nội nhũ. Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện vật lý, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống, dòng trong cùng một loài.
40
Quá trình tạo mô sẹo từ lá và thân cây Đinh lăng thấy có sự biến đổi về mặt hình thái sau hai tuần nhận thấy có sự phản phân hóa của tế bào nhu mô. Quan sát các dòng có khả năng phát sinh phôi thấy các tế bào này có quá trình phát triển giống nhƣ quá trình phát triển của phôi hợp tử, gồm các giai đoạn phát triển: phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình cá đuối, phôi trƣởng thành.
Sau 4 tuần chuyển mô sẹo vào các môi trƣờng kích thích sự phát sinh hình thái chúng tôi quan sát thấy phôi ở giai đoạn phôi hình cầu nhƣ hình 3.2 (a).
Hình 3.2. (a) giai đoạn phôi hình cầu
41
Hình 3.2. (b) giai đoạn phôi hình tim
Sau 6 tuần quan sát thấy phôi ở giai đoạn phôi hình “cá đuối” nhƣ hình 3.2 (c).
42
Hình 3.2. (c) giai đoạn phôi “cá đuối”
44
Hình 3.2. (d) giai đoạn phôi trƣởng thành
Từ thí nghiệm này ta thấy tác động của BAP và kinetin đến sự phát sinh hình thái là tƣơng đối chậm. Công thức T1 (BAP 1 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l) sau khi chuyển mô sẹo vào thì sau 4 tuần mô sẹo có dấu hiệu hơi vàng đen và không còn màu tƣơi nhƣ trƣớc, một phần mô sẹo chết. Các tuần tiếp theo màu sắc đen hơn, phần mô sẹo chết tăng dần về kích thƣớc và kết quả là sau 7 tuần mô sẹo ở công thức T1 chết hoàn toàn và có màu đen. Nhƣ vậy công thức T1 cho thấy BAP và kinetin ở nồng độ thấp không có khả năng phát sinh hình thái mô sẹo. Khi tăng nồng độ BAP và kinetin nên nhƣ ở công thức T2(BAP 1 mg/l + Kinetin 1 mg/l), T3(BAP 3 mg/l + Kinetin 1 mg/l) và công thức T4 (BAP 3 mg/l) thì khả năng phát sinh hình thái và cơ quan của mô sẹo càng tăng. Trong đó công thức T4 là có tác động mạnh nhất đến khả năng phát sinh hình thái mô sẹo, tốc độ phát sinh hình thái của mô sẹo là nhanh hơn, và số lƣợng chồi phát sinh là nhiều nhất sau 7 tuần nghiên cứu.
45
(e) (f)
(g) (h) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2. Sự phát sinh hình thái từ mô sẹo lá cây Đinh lăng sau 7 tuần ở các công thức: (e) CT T1, (f) CT T2, (g) CT T3, (h) CT T4
46
Nhƣ vậy từ thí nghiệm này giúp chúng tôi tìm ra công thức thích hợp nhất đối với quá trình phát sinh hình thái chồi từ mô sẹo cây Đinh lăng là môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung BAP 3 mg/l và 15 g đƣờng.
Hình 3.2. (i) hình thái chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo ở công thức CTT4 sau 14 tuần
47
3.3.Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng)
Sau thí nghiệm 2 chúng tôi sử dụng chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo đặt sang môi trƣờng có bổ sung NAA với nồng độ khác nhau để xác định ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ của chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo so với chồi Đinh lăng qua con đƣờng tạo đa chồi từ mô phân sinh đỉnh.
Rễ là một bộ phận quan trọng của cây. Nó có tác dụng hút nƣớc, muối khoáng và chất dinh dƣỡng cung cấp cho cây sinh trƣởng và phát triển. Do đó,
trong việc tạo cây in vitro hoàn chỉnh ta phải quan tâm đến bộ rễ của cây, tìm
môi trƣờng thật sự thích hợp cho sự tạo và phát triển của rễ.
Trong nuôi cấy mô, việc bổ sung các auxin vào môi trƣờng nuôi cấy cho hiệu quả kích thích cây khỏe mạnh, tạo nhiều rễ, phát triển tốt. Việc này phụ thuộc vào loại auxin sử dụng trong thí nghiệm, cũng nhƣ nồng độ sử dụng chúng.
Thông thƣờng chồi Đinh lăng không tạo rễ ở môi trƣờng có bổ sung NAA 0,3 mg/l trong vòng 4 tuần. Ở nồng độ NAA cao hơn là o,5 mg/l thì Đinh lăng bắt đầu mọc rễ chùm trắng sau 4 tuần, nhƣ vậy là tác động của
NAA đến việc tạo rễ của cây Đinh lăng in vitro là tƣơng đối chậm.
Đối với chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo lá non và thân cây thì ngay cả ở môi trƣờng có bổ sung NAA 0,3 mg/l cũng bắt đầu tạo rễ sau 1 tuần, rễ chùm có màu trắng. Còn trong môi trƣờng có bổ sung NAA 0,5 mg/l sau 1 tuần tốc độ tạo rễ nhanh hơn, và đặc biệt xuất hiện cả rễ chùm và rễ cọc.
Từ thí nghiệm này chúng tôi nhận thấy tác động của NAA đến việc tạo rễ của cây Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo là tƣơng đối cao, tốc độ và hiệu quả kinh tế cao hơn so với chồi Đinh lăng trong phƣơng pháp tạo đa chồi. Tìm ra môi trƣờng thích hợp nhất cho việc tạo rễ và đáp ứng mục tiêu sản xuất dƣợc liệu là môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung NAA 0,5 mg/l và 15 g đƣờng.
48
Hình 3.3. (a) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA 0,3 mg/l
Hình 3.3. (b) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA 0,5 mg/l
49
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Qua những thí nghiệm đã thực hiện chúng tôi đã rút ra đƣợc những kết luận sau về việc nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹocây Đinh lăng:
- Bƣớc đầu tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng (Polyscias
fruticosa (L.) Harms) trongđiều kiện nuôi cấy in vitro.
- Môi trƣờng thích hợp nhất tạo mô sẹo là: môi trƣờng MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + 2,4 D 2 mg/l + kinetin 0,2 mg/l.
- Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo với các bƣớc rất giống với trƣờng hợp phôi hữu tính trong các môi trƣờng: BAP 1 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l, BAP 1 mg/l + Kinetin 1 mg/l, BAP 3 mg/l + Kinetin 1 mg/l, BAP 3 mg/l,gồm 4 giai đoạn:
+ Giai đoạn phôi hình cầu + Giai đoạn phôi hình tim + Giai đoạn phôi hình “cá đuối” + Giai đoạn phôi trƣởng thành
- Môi trƣờng thích hợp nhất để phát sinh hình thái chồi từ mô sẹo câyĐinh lăng là: MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + BAP 3mg/l.
- Môi trƣờng tái sinh rễ chùm là: MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + NAA 0,3 mg/l. Môi trƣờng tái sinh rễ cọc là: MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + NAA 0,5 mg/l.
4.2. Kiến nghị
Nghiên cứu ở giai đoạn vƣờn ƣơm để tìm ra giá thể thích hợp cho sự (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});