4. Ý nghĩa của đề tài
3.2. Quá trình phátsinh hình thái từ mô sẹo ở câyĐinh lăng từ lá non và thân
Kinetin 0,2 mg/l.
3.2. Quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹo ở cây Đinh lăng từ lá non và thân cây thân cây
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhƣng do không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, và vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, các phôi vô tính có vật chất di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng.
Ở trƣờng hợp phôi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử. Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phôi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ và ngọn. Khi hợp tử phát triển, miền sinh trƣởng rễ và miền sinh trƣởng ngọn cùng phát triển và cuối cùng tạo thành cây hoàn chỉnh, qua các giai đoạn phôi học nhƣ sau:
- Trƣờng hợp cây hai lá mầm: Dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm
- Trƣờng hợp cây một lá mầm: Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu
Ở rất nhiều cây, ngƣời ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức đã tạo nên callus khi nuôi cấy. Có thể thay đổi hƣớng phát triển của chúng để tạo ra các phôi vô tính với các bƣớc phát sinh hình thái rất giống với trƣờng hợp phôi hữu tính. Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lƣợng và chất dinh dƣỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn không có nội nhũ. Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện vật lý, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống, dòng trong cùng một loài.
40
Quá trình tạo mô sẹo từ lá và thân cây Đinh lăng thấy có sự biến đổi về mặt hình thái sau hai tuần nhận thấy có sự phản phân hóa của tế bào nhu mô. Quan sát các dòng có khả năng phát sinh phôi thấy các tế bào này có quá trình phát triển giống nhƣ quá trình phát triển của phôi hợp tử, gồm các giai đoạn phát triển: phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình cá đuối, phôi trƣởng thành.
Sau 4 tuần chuyển mô sẹo vào các môi trƣờng kích thích sự phát sinh hình thái chúng tôi quan sát thấy phôi ở giai đoạn phôi hình cầu nhƣ hình 3.2 (a).
Hình 3.2. (a) giai đoạn phôi hình cầu
41
Hình 3.2. (b) giai đoạn phôi hình tim
Sau 6 tuần quan sát thấy phôi ở giai đoạn phôi hình “cá đuối” nhƣ hình 3.2 (c).
42
Hình 3.2. (c) giai đoạn phôi “cá đuối”
44
Hình 3.2. (d) giai đoạn phôi trƣởng thành
Từ thí nghiệm này ta thấy tác động của BAP và kinetin đến sự phát sinh hình thái là tƣơng đối chậm. Công thức T1 (BAP 1 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l) sau khi chuyển mô sẹo vào thì sau 4 tuần mô sẹo có dấu hiệu hơi vàng đen và không còn màu tƣơi nhƣ trƣớc, một phần mô sẹo chết. Các tuần tiếp theo màu sắc đen hơn, phần mô sẹo chết tăng dần về kích thƣớc và kết quả là sau 7 tuần mô sẹo ở công thức T1 chết hoàn toàn và có màu đen. Nhƣ vậy công thức T1 cho thấy BAP và kinetin ở nồng độ thấp không có khả năng phát sinh hình thái mô sẹo. Khi tăng nồng độ BAP và kinetin nên nhƣ ở công thức T2(BAP 1 mg/l + Kinetin 1 mg/l), T3(BAP 3 mg/l + Kinetin 1 mg/l) và công thức T4 (BAP 3 mg/l) thì khả năng phát sinh hình thái và cơ quan của mô sẹo càng tăng. Trong đó công thức T4 là có tác động mạnh nhất đến khả năng phát sinh hình thái mô sẹo, tốc độ phát sinh hình thái của mô sẹo là nhanh hơn, và số lƣợng chồi phát sinh là nhiều nhất sau 7 tuần nghiên cứu.
45
(e) (f)
(g) (h)
Hình 3.2. Sự phát sinh hình thái từ mô sẹo lá cây Đinh lăng sau 7 tuần ở các công thức: (e) CT T1, (f) CT T2, (g) CT T3, (h) CT T4
46
Nhƣ vậy từ thí nghiệm này giúp chúng tôi tìm ra công thức thích hợp nhất đối với quá trình phát sinh hình thái chồi từ mô sẹo cây Đinh lăng là môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung BAP 3 mg/l và 15 g đƣờng.
Hình 3.2. (i) hình thái chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo ở công thức CTT4 sau 14 tuần
47
3.3.Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng)
Sau thí nghiệm 2 chúng tôi sử dụng chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo đặt sang môi trƣờng có bổ sung NAA với nồng độ khác nhau để xác định ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ của chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo so với chồi Đinh lăng qua con đƣờng tạo đa chồi từ mô phân sinh đỉnh.
Rễ là một bộ phận quan trọng của cây. Nó có tác dụng hút nƣớc, muối khoáng và chất dinh dƣỡng cung cấp cho cây sinh trƣởng và phát triển. Do đó,
trong việc tạo cây in vitro hoàn chỉnh ta phải quan tâm đến bộ rễ của cây, tìm
môi trƣờng thật sự thích hợp cho sự tạo và phát triển của rễ.
Trong nuôi cấy mô, việc bổ sung các auxin vào môi trƣờng nuôi cấy cho hiệu quả kích thích cây khỏe mạnh, tạo nhiều rễ, phát triển tốt. Việc này phụ thuộc vào loại auxin sử dụng trong thí nghiệm, cũng nhƣ nồng độ sử dụng chúng.
Thông thƣờng chồi Đinh lăng không tạo rễ ở môi trƣờng có bổ sung NAA 0,3 mg/l trong vòng 4 tuần. Ở nồng độ NAA cao hơn là o,5 mg/l thì Đinh lăng bắt đầu mọc rễ chùm trắng sau 4 tuần, nhƣ vậy là tác động của
NAA đến việc tạo rễ của cây Đinh lăng in vitro là tƣơng đối chậm.
Đối với chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo lá non và thân cây thì ngay cả ở môi trƣờng có bổ sung NAA 0,3 mg/l cũng bắt đầu tạo rễ sau 1 tuần, rễ chùm có màu trắng. Còn trong môi trƣờng có bổ sung NAA 0,5 mg/l sau 1 tuần tốc độ tạo rễ nhanh hơn, và đặc biệt xuất hiện cả rễ chùm và rễ cọc.
Từ thí nghiệm này chúng tôi nhận thấy tác động của NAA đến việc tạo rễ của cây Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo là tƣơng đối cao, tốc độ và hiệu quả kinh tế cao hơn so với chồi Đinh lăng trong phƣơng pháp tạo đa chồi. Tìm ra môi trƣờng thích hợp nhất cho việc tạo rễ và đáp ứng mục tiêu sản xuất dƣợc liệu là môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung NAA 0,5 mg/l và 15 g đƣờng.
48
Hình 3.3. (a) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA 0,3 mg/l
Hình 3.3. (b) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA 0,5 mg/l
49
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Qua những thí nghiệm đã thực hiện chúng tôi đã rút ra đƣợc những kết luận sau về việc nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹocây Đinh lăng:
- Bƣớc đầu tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng (Polyscias
fruticosa (L.) Harms) trongđiều kiện nuôi cấy in vitro.
- Môi trƣờng thích hợp nhất tạo mô sẹo là: môi trƣờng MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + 2,4 D 2 mg/l + kinetin 0,2 mg/l.
- Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo với các bƣớc rất giống với trƣờng hợp phôi hữu tính trong các môi trƣờng: BAP 1 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l, BAP 1 mg/l + Kinetin 1 mg/l, BAP 3 mg/l + Kinetin 1 mg/l, BAP 3 mg/l,gồm 4 giai đoạn:
+ Giai đoạn phôi hình cầu + Giai đoạn phôi hình tim + Giai đoạn phôi hình “cá đuối” + Giai đoạn phôi trƣởng thành
- Môi trƣờng thích hợp nhất để phát sinh hình thái chồi từ mô sẹo câyĐinh lăng là: MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + BAP 3mg/l.
- Môi trƣờng tái sinh rễ chùm là: MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + NAA 0,3 mg/l. Môi trƣờng tái sinh rễ cọc là: MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + NAA 0,5 mg/l.
4.2. Kiến nghị
Nghiên cứu ở giai đoạn vƣờn ƣơm để tìm ra giá thể thích hợp cho sự
50
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích và các tác giả (2004), Cây thuốc và Động vật làm thuốc, Tập I,
Nxb Khoa học và Kĩ thuật, tr.793-796.
2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực
vật trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
3. Nguyễn Ngọc Dung (1998), Nhân giống cây Đinh lăng (Polyscias fruticosaL.
Harms) thông qua con đường tạo phôi soma trong nuôi cấy in vitro, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Viện Sinh học Nhiệt đới, Nxb Nông Nghiệp Tp.HCM, tr 442- 445.
4. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, quyển II, Nxb Trẻ, tr. 668.
5. Nguyễn Nhƣ Khanh, Nguyễn Văn Đính (2006), Sinh học phát triển thực vật,
Nxb Giáo dục Hà Nội.
6. Dƣơng Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, Nxb Đại Học Quốc gia
Tp.HCM.
7. Trần Thị Liên, Nguyễn Văn Thuận, Đoàn Thị Thanh Nhàn (2005), "Nghiên
cứu nhân nhanh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) bằng phƣơng
pháp in-vitro”,Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 14, tr 39.
8. Ngô Ứng Long và cs (1985), “So sánh tác dụng tăng lực và sinh thích nghi
của Đinh lăng, Chân chim và Eleuterococ”, Tạp chí Dược liệu, tr.24- 27.
9. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp
nghiên cứu sinh lý học thực vật. Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. Tr 111 – 114.
10.Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu và ứng
dụng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
11.Lê Thiên Thƣ (2006), "Sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy in-vitro cây Đinh
lăng và bƣớc đầu tìm hiểu saponin trong các mẫu cấy in- vitro cây Đinh lăng
Polyscias fruticosa (L.) Harms”, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên.
51
12.Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Đại học quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh.
13.Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
14.A. Śliwińska, O. Olszowska, M. Furmanowa, A. Nosov, “Rapid
multiplication of Polyscias filicifolia by secondary somatic
embryogenesis”. In: In Vitro Cellular & Developmental Biology– PlantApril
2008, Volume 44, Issue 2, pp 69-77.
15. Murashige, T. (1980), “Plant growth substances in commercial uses of tissue
culture”. In: Plant growth Substances 1979, ed. by F.Skoog. Springer- Verag,
Berlin Heidelberg New York, pp. 426 – 434.
16.Nickell, L.G. (1973), “Test-tube Approaches to by pass sexx”, Hawaiian
Planters Record.58, pp. 239-314.
17. Salwa S. Sakr, Saad S. Melad, M. A. El-Shamyand Asmaa E. Abd
Elhafez,“In vitro Propagation of Polyscias fruticosa Plant”. In: International
Journal of Plant & Soil Science, ISSN: 2320-7035,Vol.: 3, Issue.: 10 (October).
Tài liệu từ Internet
18.http://www.duk.vn/view/1209_tac-dung-cua-la-va-re-dinh-lang.htm 19.http://www.caythuocquy.info.vn/old/modules.php?name=News&opcase=deta ilsnews&mid=1266&mcid=245&pid=&menuid= 20.http://www.sciencedomain.org 21.https://scholar.google.com.vn/scholar?q=in+vitro+propagation+of+polyscias+ fruticosa+plant%2CSalwa+AL.+Sakr&btnG=&hl=vi&as_sdt=0%2C5&as_vi s=1 22.http://canthostnews.vn/?tabid=230&NDID=35653&keyword=Xay-dung-quy- trinh-nhan-giong-in-vitro-cay-dinh-lang-la-nho-