Nghiên cứu nhân giống cây Gừng núi đá ( Zingiber purpureum Roscoe) bằng phương pháp in vitro

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường nuôi cấy MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi Gừng núi đá sau 3 tuần .... Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trườ

- -

HOÀNG TRUNG SƠN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG NÚI ĐÁ

(Zingiber purpureum Roscoe) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo :Chính quy Chuyên ngành:Công nghệ sinh học Khoa :CNSH - CNTP Khóa học :2012 - 2016

Thái Nguyên - 2016

- -

HOÀNG TRUNG SƠN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG NÚI ĐÁ

(Zingiber purpureum Roscoe) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp : K44 - CNSH

Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 - 2016 Giảng viên hướng dẫn :1 PGS.TS Ngô Xuân Bình

2 ThS Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên - 2016

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS.Ngô Xuân Bình, cô giáo Ths Nguyễn Thị Tình và chị Phạm Thị Thảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện tốt nhất có thể và luôn là chỗ dựa tinh thần cho tôi trong quá trình học tập ,cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua Do thời gian thực tập đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái nguyên, ngày 23 tháng 05 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Hoàng Trung Sơn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch

HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu 25 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường nuôi cấy (MS,

B5, WPM) đến khả năng tái sinh chồi Gừng núi đá sau 3 tuần 27 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

chồi Gừng núi đá sau 4 tuần 30 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân

nhanh chồi Gừng núi đá sau 4 tuần 32 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến

khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá sau 4 tuần 34 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng cảm ứng

hình thành rễ của Gừng núi đá sau 4 tuần 36 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và

phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm sau 2 tuần 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch

HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu 26 Hình 4.2 Ảnh củ Gừng núi đá trong giai đoạn tái sinh chồi 26 Hình 4.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường MS , B5 và WPM đến khả

năng tái sinh chồi gừng núi đá 28 Hình 4.4 Ảnh tái sinh chồi Gừng núi đá sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trường MS

28 Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

chồi Gừng núi đá 30 Hình 4.6 Ảnh mô Gừng núi trong môi trường nhân nhanh MS có bổ sung nồng độ

BA 1,5mg/l sau 4 tuần 31 Hình 4.7 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân

nhanh chồi Gừng núi đá 32 HÌnh 4.8 Ảnh chồi gừng núi đá trong môi trường nhân nhanh bổ sung Kinetin

1mg/l trong 4 33 Hình 4.9 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp NAA đến khả năng

nhân nhanh chồi Gừng núi đá 35 Hình 4.10 Ảnh chồi Gừng núi đá trong môi trường nhân nhanh MS bổ sung BA kết

hợp với NAA sau 4 tuần với nồng độ BA 1,5mg/l và nồng độ NAA 0,5 mg/l 35 Hình 4.11 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng cảm ứng rễ

của gừng núi đá 37 Hình 4.12 Ảnh Gừng núi đá ra rễ trong môi trường MS khi bổ sung nồng độ NAA

0,5 mg/l sau 4 tuần 37 Hình 4.13 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả năng sinh

trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm 39

Hình 4.14 ảnh cây Gừng núi đá được trồng trên giá thể đất + trấu hun +mùn (1:2:1)

sau 2 tuần 40

LSD : Least Significant Difference Test

MS : Murashige and Skoog‟s

NAA : α - Naphlene axetic acid

2,4-D :2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.Mục đích nghiên cứu 2

1.3.Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiến 2

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về Gừng núi đá 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2.Đặc điểm hình thái 3

2.1.3 Đặc điểm phân bố 4

2.1.4 Sinh thái, trồng trọt 4

2.1.5 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý 5

2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) 6

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.2.2 Tính toàn năng của tế bào 6

2.2.3 Phản phân hóa và phân hóa tế bào 7

2.2.4 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.3 Tình hình nghiên cứu Gừng núi đá trong nước và thế giới 13

2.3.1 Tình hình nghiên cứu thế giới 13

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 16

3.1.1 Đối tượng 16

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 16

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 16

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 16

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 16

3.3 Điều kiện nuôi cấy 16

3.4 Nội dung nghiên cứu 17

3.5 Phương pháp nghiên cứu 17

3.5.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 17

3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 17

PHẦN 4 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu 25

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường nuôi cấy (MS, B5, WPM) đến khả năng tái sinh chồi Gừng núi đá 27

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá 29

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá 31

4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA Kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá 33

4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng cảm ứng rễ của Gừng núi đá 36

4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm 38

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……….……… 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Họ Gừng bao gồm khoảng 47 chi và hơn 1.000 loài , phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chủ yếu ở nam và đông nam châu Á Ở Việt Nam hiện nay biết gần 20 chi và gần 100 loài, trong đó Gừng núi đá là một trong những loài có giá trị lớn [13]

Tên khoa học Zingiber purpureum Roscoe , họ Gừng zingiberaceae,

thuộc chi Gừng zingiber, bộ Gừng Zingiberales Cây Gừng núi đá cao khoảng

từ 0,3-1m, thân rễ dạng củ phân nhiều nhánh [12]

Từ đời nhà Minh Trung Quốc nhà y học nổi tiếng Lý Thời Châu đã viết trong cuốn “ Bản Thảo Cương Mục” như sau: “Gừng đắng mà không hôi, đắng có thể xua tà, đuổi ác, có thể ăn sống, ăn chín, ngâm giấm, làm tương, ngâm muối, xào với mật, đường Cũng có thể làm rau, làm kẹo, làm thuốc rất

có lợi”

Nước Gừng tính ôn có công dụng long đờm chữa ho Vỏ Gừng tính mát

có công dụng tỳ vị, tiêu viêm ,sưng, Gừng khô tính nhiệt, dùng ấm, có công dụng giải hàn, trừ tỳ vị hư hàn Lá Gừng có tính ôn có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, hoạt huyết

Ngày nay với khoa học và kỹ thuật phát triển cây Gừng có tác dụng đặc biệt đã được phát hiện như hoạt tính kháng virus, chống oxy hóa và kháng khuẩn Tuy nhiên nguồn gen cây họ Gừng đang có nguy cơ mất mát nhanh do

sự khai thác quá mức

Theo quyết định số 80/2005QĐ- BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn từ năm 2005 cây Gừng núi đá đã được xếp vào nhóm cây thực phẩm quý hiếm cần được bảo tồn Vì vậy Gừng núi đá rất cần có định hướng

để bảo tồn đúng đắn để phục vụ trong tương lai [20]

Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu giống cây Gừng núi đá (Zingiber purpureum Roscoe ) bằng phương pháp in vitro”

1.2.Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu thành công quy trình nhân giống cây Gừng núi đá bằng

phương pháp in vitro

1.3.Yêu cầu

- Xác định được thời gian khử trùng thích hợp

- Xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp đến khả năng tái sinh Gừng núi đá

- Xác định được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin, NAA) đến qua trình nhân nhanh chồi, ra rễ chồi Gừng núi đá

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng cảm ứng rễ của chồi Gừng núi đá

- Xác định được loại giá thể phù hợp đến khả năng sinh trưởng và phát

triển của cây con in vitro trong vườn ươm

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được biện pháp kỹ thuật nhân giống

Gừng núi đá bằng phương pháp in vitro Đánh giá được chất kích thích sinh

trưởng, thành phân môi trường nuôi cấy và thời gian khử trùng trong quy

trình nhân giống Gừng núi đá bằng phương pháp in vitro

1.4.2 Ý nghĩa thực tiến

- Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống Gừng núi đá bằng phương

pháp nuôi cấy in vitro, để đảm bảo cung cấp số lượng lớn cây giống có chất

lượng cao phục vụ cho sản xuất

- Bảo tồn được loại dược liệu quý

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Gừng núi đá

Loài : Zingiber purpureum Roscoe

Tên Việt Nam: Gừng núi đá

Tên khoa học: Zingiber purpureum Roscoe

Tên khác: Cây Ngải, Zơ Rơng, Gừng Gié, Gừng Tía

Tên nước ngoài: Zingiber cassumunar Roxb., Bengle (Java)

2.1.2.Đặc điểm hình thái

Cây thân thảo cao 1-1,4m, thân rễ dạng củ, phân nhánh, màu trắng, lúc

củ còn non có màu vàng nhạt, thơm Củ càng già càng to và chắc trong ruột

củ có màu vàng, mùi thơm ngọt, dễ chịu Thân khí sinh khỏe, mọc thẳng đứng [10]

Lá mọc xếp lớp, không cuống mọc thành hai dãy, thuôn dài đầu nhọn, dài khoảng 20cm, rộng 5cm, mặt trên nhẵn , mặt dưới có lông rải rác, bẹ lá to nhẵn, lưỡi bẹ tròn dễ gãy [10]

Cụm hoa dạng trứng, đôi khi hình trụ, mọc từ thân rễ trên một cán mập, dài 20- 30cm, phủ bởi những lá bắc xếp lợp, mép màu lục nhạt, đôi khi pha hồng Đài hoa nhỏ, tràng hoa có ống loe thành thùy màu trắng, một nhị, bao phấn dài hơn trung đới, cánh môi rộng màu vàng nhạt, chia ba thùy ngắn, nhị lép tạo thành thùy bên của cánh môi,bầu hình elip [10]

Quả nang hình bầu dục, chứa ít hạt màu đen, có áo mềm mầu trắng Mùa hoa : tháng 7-9

2.1.3 Đặc điểm phân bố

Gừng núi đá có nguồn gốc từ Ấn Độ, hiện nay có mặt ở các vùng nhiệt đới như Polynesia, Hawaii, Đông Nam Á bao gồm một số nước như Malaysia, Thái Lan, Lào, Việt Nam và Nam Trung Quốc Ở nước ta cây xuất hiện tự nhiên khá nhiều ở vùng núi cao Trà Bồng( Quảng Ngãi), một số vùng rừng núi ở Tây Nguyên, Tây Bắc và vùng đồng bằng có địa hình núi ở miền Tây Hiện nay Gừng núi đá được trồng ở nhiều nơi để làm thuốc [3][10]

2.1.4 Sinh thái, trồng trọt

2.1.4.1 Sinh thái

Gừng núi đá ưa khí hậu nóng ẩm, ưa ánh sáng, có thể bị che bóng một phần trong ngày, thường mọc ở ven rừng và dưới tán rừng kín thường xanh ở vùng trung du và đồng bằng cây mọc lẫn trong các lùm bụi dưới chân đồi hoặc quanh làng bản Cây sinh trưởng mạnh vào mùa hè, nhiệt độ thích hợp 21-27°C, lượng mưa hang năm 1500- 2500mm Gừng gió có hệ thống rễ phát triển, mỗi năm từ một nhánh mẹ có thể mọc thêm 2-3 nhánh con Do đó, trong

tự nhiên cây thường tạo thành những bụi lớn, có khi chiếm 1-2m [10]

2.1.4.2 Trồng trọt

Cây thích hợp ở vùng có một mùa khô ngắn, có nhiệt độ không khí tương đối cao trong thời kỳ của Gừng thành thục Vì vậy, khí hậu ở nhiều địa phương ở miền Nam nước ta thích hợp cho trồng Gừng núi đá Cây cần đất

tương đối tốt, tầng đất dày, tơi xốp, ít đá lẫn, Khả năng dữ nước lớn nhưng thoát nước tốt, có độ ẩm đầy đủ trong suốt thời gian cây sinh trưởng, tốt nhất

là đất thịt không ưa đất cát và đất sét Đất có hàm lượng mùn cao rất thích hợp cho trồng Gừng núi đá [12]

Cắt các đoạn thân ngầm ( củ) dài 2,5-5 cm, trên mỗi đoạn thân ngầm có

ít nhất một mắt mầm ( chồi ngủ) để làm giống trồng Giống Gừng có thể lấy ngay sau khi thu hoạch để trồng hoặc bảo quản trong thời gian ngắn ở nơi khô, thoáng mát sau đó mới đem trồng Cây được đem trồng vào tháng 2-3

âm lịch, sau 10- 20 ngày, mắt mầm bắt đầu nảy chồi non và lá non, sau một năm sẽ cho thu hoạch củ [12]

2.1.5 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý

Gùng núi đá chứa nhiều tinh dầu, dầu béo và nhựa, Thành phần chủ yếu của tinh dầu là các monoterpen chiếm 13% và nhiều sesquiterpen Các monoterpen gồm α-pinen, camphen, limonene, cineol và camphor Các sesquiterpen chủ yếu là các humulen chiếm 27%, sesquiterpen monoterpen monocyelic ceton và 37,5% zerumbon Nhiều loại hợp chất thứ cấp cũng được phân lập từ Gừng núi đá như terpenoid, flavonoid [10]

Trong số đó, zerumbon là thành phần chính của thành phần Gừng núi đá

và được xem là hoạt chất chính có tác dụng sinh học đáng chú ý

Zerumbom có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng và trực cầu lao Zerumbon là một serquiterpen dạng tinh thể được phân lập từ tinh dầu Gừng núi đá Thành phần có hoạt tính sinh học này có cấu trúc rất đặc biệt và duy nhất, với một nối ceton lieen hợp ở vị trí C số 11, nhờ đó nó có tác dụng sinh học rất đặc biệt Các nghiên cứu trong và ngoài nước cũng đã góp phần làm rõ hơn về zerumbon

Gừng núi đá đang trở nên dần quen thuộc ở các nước Đông Nam Á và được sử dụng trong các bài thuốc truyền thống, đem lại hiệu quả trong điều trị

một vài bệnh Ở Malysia, rễ Gừng núi đá được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh như đau bụng, buồn nôn, đau họng, ho, trị vết thâm, sẹo, chữa đau mắt, chữa bệnh gan, chữa thấp khớp, chữa khối u ác tính,chữa hen suyễn [6][10]

2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro)

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống qua các cơ quan dinh dưỡng ( thân, lá,củ, vỏ…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt

ghép và nuôi cấy mô in vitro Trong đó nuôi cấy mô được gọi là phương pháp

hữu hiệu nhất[2]

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ dùng chung để chỉ quá trình

nuôi cấy in vitro và các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật

trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh thực vật, duy trì và bảo vệ các nguồn gen quý…[2]

2.2.2 Tính toàn năng của tế bào

Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tằng

để phất triển thành một cá thể hoàn chỉnh [1]

Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen và môi trường Do đó, khi gặp điều kiện thuận lợi cơ quan, mô, tế bào đều có thể phất triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [1]

2.2.3 Phản phân hóa và phân hóa tế bào

2.2.3.1 Sự phân hóa tế bào

Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bào

và giai đoạn dãn của tế bào Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng [14]

Sau đó, các tế bào bắt đầu phân hóa thành các mô chuyên hóa để đảm nhận các chức năng khác nhau; các tế bào trong giai đoạn này có các đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng [14]

Có thể nói rằng sự phân hóa tế bào là sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa [14]

2.2.3.2 Sự phản phân hóa tế bào

Sự phản phân hóa tế bào là quá trình ngược lại với sự phân hóa tế bào Các tế bào đã phân hóa trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia của mình, trong những điều kiện thích hợp, chúng có thể quay lại đóng vai trò như các mô phân sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới [14]

2.2.4 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy

2.2.4.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm

bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao nuôi cấy bị nhiễm Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi

cấy mô in vitro

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, đèn tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao Thông thường hay sử dụng một số hóa chất như: HgCl2 0,1% , nước Clolox, cồn 70°, Ca(ClO)2… để khử trùng [1]

- Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

+ Ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: Thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12- 18h/ ngày

Cường độ chiếu sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Theo Ammirato (1986) : Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy là 1000 – 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của

mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với

ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế, vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay trong các phòng nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 – 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40cm [2]

+ Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt đọ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào nguồn gốc của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loại cây là 25±2ºC [2]

2.2.4.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy mô tế bào và thực vật Mỗi loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải lựa chon cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp

Từ năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, B5, WPM

Tuy có nhiều loại nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [2]:

+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

+ Nguồn cacbon

+Các vitamin và amino acid

+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

- Các muối khoáng đa lƣợng và vi lƣợng

Đối với các cây trồng, các chất khoáng đa lượng và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca cấu tạo màng

tế bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một

số enzyme cần thiết cho hoạt động sống của tế bào

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzyme

Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thế hoạt hóa của thực vật Các yếu tố như: K,

Ca rất quan trọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào [15]

- Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng

quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào

Nguồn cacbon được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hóa, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [15]

- Các vitamin và axit amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro

ở các loài khác nhau là khác nhau

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các lạo vitamin

cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amoni acid Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật Acid nicotinic (B3) và pyridoxine (B6) cũng có thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [2]

- Các chất bổ sung

+Agarose

Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hóa môi trường Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6 – 1% đây là loại

tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxy nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [7]

- Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều tiết sinh trưởng gồm chất kích thích và ức chế Trong nhân giống cây trồng, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng để kích thích sự phát sinh của cơ quan

Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và sinh trưởng Trong tế bào, NAA có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic [15]

Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây

+ Gibberellin

Gibberellin được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Gibberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Gibberellin

có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [11]

+ Cytokinin

Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia

tế bào do chúng hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp acid nucleic và protein Các cytokinin thường gặp là kinetine, BAP

Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic Kinetin thực chất là một chất dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều kinetine Kinetine và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào Ngoài ra các chất này còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein làm tăng hoạt tính của một số enzyme Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện ở múc độ tương hỗ của cytokinin với nucleoprotein làm yếu mối lien kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA [15]

Những nghiên cứu của miller và Skoog (1936) đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hooc môn sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hóa và biệt hóa được điều khiển bằng

sự tác động tương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin thì thích hợp cho sự hình thành của rễ, và thấp thì thích cho

sự phất triển của chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thích hợp cho sự phất triển mô sẹo (callus)

Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp DNA, dẫn đến quá trình phân hóa tế bào và cảm ứng cho sự phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng của cả hai chất kích thích Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ quá trình này diễn ra một cách bình thường Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát triển [15]

2.3 Tình hình nghiên cứu Gừng núi đá trong nước và thế giới

2.3.1 Tình hình nghiên cứu thế giới

Adinkudik K Lincy và cs (2009) [16], đã tạo phôi vô tính từ thân khí sinh của Gừng

Năm 2010, Anwar Hossain cùng cs đã xây dựng quy trình tái sinh cây

Gừng thông qua phương pháp in vitro [17]

Các nhà khoa học tại Malaysia và Sudan đã cùng hợp tác nghiên cứu và

xây dựng quy trình tái sinh in vitro có hiệu quả cao đối với đối tượng cây Gừng gió Zingiber zerumbet Smith [19]

Năm 2013, ở Banglades đã nghiên cứu thành công quy trình vi nhân

giống cây nghệ đen (Curcuma zedoaria) từ vật liệu ban đầu là chồi Mẫu

được đưa vào môi trường MS có chứa hỗn hợp các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ khác nhau Sau khi nhân để tạo nhiều chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, cây được chuyển ra giá thể là hỗn hợp gồm đất vườn cùng phân trộn (với tỷ lệ 1:1) để thích nghi, sau đó đưa ra điều kiện đồng ruộng [18]

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Gừng núi đá đã được nuôi cấy ở một số nước trên thế giới như Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ… Tuy nhiên ở Việt Nam việc nuôi cấy Gừng núi đá chưa được nghiên cứu nhiều Từ năm 2005, cây Gừng núi đá đã được xếp vào nhóm giống cây thực phẩm quý hiếm cần được bảo tồn theo Quyết định số 80/2005/QĐ- BNN và Phát triển Nông thôn [20]

Sở Khoa Học và công nghệ tỉnh bắc cạn cùng viện di truyền nông nghiệp

đã tiến hành điều tra tình hình sản suất Gừng núi đá tại Liêm Thủy và Xuân Dương huyện Na Rì tỉnh Bắc Kạn Tại mỗi xã chọn 50 hộ dân tham gia mô hình trồng Gừng núi đá Từ đó, tiến hành đánh giá kiểu hình, kiểu gen, nhân

nhanh giống Gừng núi đá bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ( in vitro) [21]

Qua triển khải và thực hiện dự án đã hoàn thành điều tra, khảo sát tình hình sản xuất, giống Gừng núi đá tại Xã Liêm Thủy và Xã Xuân Dương, huyện Na Rì tỉnh Bắc Kạn, đánh giá các cá thể Gừng núi đá trên ruộng, nhân

giống thành công bằng phương pháp in vitro, phân tích các thành phần chính

của giống Gừng núi đá tại Bắc Kạn nhằm đánh giá giá trị nguồn gen của giống tại nơi nghiên cứu Mô hình trồng 500m2, trong đó trồng bằng Gừng núi

đá từ nuôi cấy mô là 200m2

, còn trồng từ củ là 300m2 Kết quả cho thấy trồng

từ cây nuôi cấy bằng phương pháp in vitro cho thấy cây sinh trưởng và phát

triển tốt Chiều cao cây trồng từ nuôi cấy mô đạt 15 -18cm, được 8-10 lá và

đẻ 3-5 nhánh Gừng trồng từ củ địa phương cây phát triển tốt, mỗi khóm 6-10 nhánh [21]

Đặng Văn Hoài và cs (2010) [8], đã tiến hành thí nghiệm và so sánh

thành phần tinh dầu của Gừng dại và Gừng trâu thuộc chi Zingiber

Năm 2012, tại Lạng Sơn cũng tiến hành một đề tài nghiên cứu nhân

giống cây Gừng Núi Đá bằng phương pháp in vitro của Trung tâm ứng dụng

Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn [9]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả

năng tái sinh, nhân nhanh và ra rễ cây Gừng núi đá bằng phương pháp in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể ( mùn, trấu hun, đất + mùn + trấu hun) đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Gừng núi đá giai đoạn sau nuôi cấy mô

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp phía bắc – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2016

3.3 Điều kiện nuôi cấy

Các thí nghiệm nuôi cấy trong phòng được duy trì trong điều kiện:

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi Gừng núi đá

- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh chồi, ra rễ Gừng núi đá

- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng (NAA) đến khả năng cảm ứng rễ của Gừng núi đá

- Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả năng sinh trưởng và

phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

- Sử dụng môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung agar 7g/l +

đường 30g/l, pH trong khoảng 5,8 – 6,0

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin

bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm

- Thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50 - 70 ml/bình

- Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,1 atm

trong 15-20 phút

3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.5.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy

- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng

bằng dung dịch HgCl 2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy

+ Phương pháp nghiên cứu:

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 15 mẫu

Củ Gừng núi đá sau khi thu hái về dùng nước máy rửa sạch lớp đất bẩn rồi bằng nước rửa chén sau đó tráng lại nhiều lần dưới vòi nước máy rồi đưa vào buồng cấy vô trùng để khử trùng với HgCl2 0,1% ở các thời gian khác nhau Sau khi khử trùng cấy mỗi bình một định sinh trưởng

+ Chỉ tiêu theo dõi:

 Tỷ lệ mẫu nhiễm:

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm (mẫu) x 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

 Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm:

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu) x 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

 Tỷ lệ mẫu chết

Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết (mẫu) x 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

 Chất lượng mẫu Mẫu sống: Mẫu không bị biến màu và mẫu tươi Mẫu nhiễm: mẫu bị biến màu

Mẫu chết: mẫu màu đen

3.5.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả

năng tái sinh chồi của Gừng núi đá

- Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường

nuôi cấy (MS, B5, WPM) đến khả năng tái sinh chồi Gừng núi đá

+ Công thức thí nghiệm

 CT1: Môi trường MS

 CT2: Môi trường B5

 CT3: Môi trường WPM Chú ý: A là môi trường thích hợp cho khả năng tái sinh chồi của Gừng

núi đá được dùng cho thí nghiệm sau

+ Phương pháp nghiên cứu

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu

Thử nghiệm trên ba loại môi trường nuôi cấy Mỗi môi trường là một công

thức Theo dõi và tìm ra môi trường thích hợp cho nuôi cấy Gừng núi đá

+ Chỉ tiêu theo dõi

 Tỷ lệ tái sinh chồi (%)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = Tổng số mẫu tái sinh (mẫu) x 100 %

Tổng số mẫu ban đầu (mẫu)

 Chất lượng chồi

Chồi tốt: chồi to, khỏe, mập và xanh đậm Chồi kém chồi nhỏ, yếu màu xanh nhạt

3.5.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh

trưởng đến quá trình nhân nhanh chồi, ra rễ Gừng núi đá

- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh của hàm lƣợng BA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá

Chú ý: A là môi trường thích hợp được xác định từ thí nghiệm 1

Trong các công thức bổ sung: Agar 7g/l + Đường 30g/l

+ Phương pháp nghiên cứu:

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 lần mẫu

Chất điều tiết sinh trưởng: Benzyladenin (BA) được bổ xung vào 5

công thức thí nghiệm, mỗi bình một mẫu nuôi cấy đã vô trùng

- Chỉ tiêu theo dõi:

 Hệ số nhân chồi

Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi bật (chồi) x 100%

Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu)

 Chất lượng chồi

+ Chồi tốt: Chồi khỏe, xanh đậm

+ Chồi trung bình: Chồi khỏe , xanh nhạt

+ Chồi kém: Chồi yếu, xanh nhạt

- Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm hượng Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá

Trong các công thức bổ sung: Agar 7g/l + Đường 30g/l

+ Phương pháp nghiên cứu:

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với ba lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 lần mẫu

Chất điều tiết sinh trưởng: Kinetin được bố trí trên 5 công thức thí nghiệm, mỗi bình một mẫu nuôi cấy đã vô trùng

+ Chỉ tiêu theo dõi:

 Hệ số nhân chồi

Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi bật (chồi) x 100%

Tổng số chồi nuôi cấy (chồi)

 Chất lượng chồi bật

+ Chồi tốt: Chồi khỏe,xanh đậm

+ Chồi trung bình: Chồi khỏe,xanh nhạt

+ Chồi kém: Chồi yếu, xanh nhạt

- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA Kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá

+ Công thức thí nghiệm

 CT1: A (không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng)

+ Phương pháp nghiên cứu:

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 lần mẫu

Chất điều tiết sinh trưởng: BA và NAA được bố trí trên 7 công thức thí

nghiệm, mỗi bình một mẫu nuôi cấy đã vô trùng

+ Chỉ tiêu theo dõi

+ Chồi tốt: Chồi khỏe ,xanh đậm

+ Chồi trung bình: Chồi khỏe, xanh nhạt

+ Chồi kém: Chồi yếu, xanh nhạt

3.5.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng cảm ứng

rễ của chồi Gừng núi đá

- Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng củaNAA đến khả năng cảm ứng rễ của chồi Gừng núi đá

+ Công thức thí nghiệm

 CT1: A + 0mg NAA/l

+ Phương pháp nghiên cứu:

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu

Chất điều tiêt sinh trưởng: Naphthyl acetic acid (NAA) được bố trí trên 5

công thức thí nghiệm, mỗi bình một mẫu nuôi cấy đã vô trùng

+ Chỉ tiêu theo dõi:

3.5.2.5 Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả năng sinh trưởng

và phát triển cây con in vitro ở vườn ươm

- Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến khả

năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm

+ Công thức thí nghiệm

 CT1: Mùn hữu cơ

 CT2: Trấu hun

 CT3: Đất phù xa + Trấu hun + Mùn hữu cơ (1:2:1)

+ Phương pháp nghiên cứu:

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu

+ Chỉ tiêu theo dõi