2. Mục đích nghiên cứu Error! Bookmark not defined.
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) được thu ngoài tự nhiên tại khu vực phường Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc. Cây được trồng, chăm sóc trong chậu, khi cây có chồi non khoảng 3-4 cm thì tiến hành thu mẫu cho nghiên cứu về nuôi cấy mô tại Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học & Chuyển giao Công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
19 Các thiết bị:
Tên thiết bị Model & hãng sản xuất
Cân kĩ thuật GM612, Đức
Tủ lạnh sâu FRIGO
Máy đo pH HM30G/TOA, Đức
Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAYAMA, Nhật
Tủ lạnh Hitachi 31AG5D, Thái lan
Máy cất nước hai lần Trung Quốc
Buồng cấy vô trùng AV – 110/TELSTAR Máy khuấy từ ra nhiệt ARE/VELP, Italia
Cân phân tích CP224S, Đức
Buồng khí hậu nhân tạo E800/AXYOS, Đức
Tủ ấm UNIVERSAL 320R/ HETTICH,
Đức
Micropipet Jinson Các loại 200 - 1000µl (Pháp)
Máy li tâm lạnh BE200, Đức
Máy quang phổ tử ngoại UV2450, SHIMADZU – Nhật Bản
Dụng cụ: Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50 ml, 15 ml,...), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy, panh, kéo,...
20
2.2.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962):
Thành phần Nồng độ (mg/l)
Khoáng đa lượng NH4NO3
KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 1650 1900 440 370 170 Khoáng vi lượng MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O H3PO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 23,3 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 Sắt EDTA Na2.EDTA FeSO4.7H2O 37,3 27,8 Vitamin Myo-Inositol Thiamin (B1) Nicotinic acid Pyridoxine (B6) Glycine 100 0,5 0,5 0,5 2
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng: BAP, NAA (mg/l). Các thành phần khác:
Đường saccarose: 30 g/l Agar: 8 g/l
Môi trường được điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N và HCl 1N) trước khi hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 117o
21
phút (đối với các dụng cụ thí nghiệm, dụng cụ thủy tinh không chứa môi trường thì khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút).
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối Nhiệt độ: 25 ± 2o C
Độ ẩm: 50 – 60 %
Cường độ ánh sáng: 2000 lux
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu
Chồi được cắt dài khoảng 3 - 4 cm từ đỉnh chồi.Chồi được cắt bỏ lá non, xử lý sơ bộ bằng cách: Rửa sạch nhiều lần dưới vòi nước máy, sau đó rửa trong dung dịch nước xà phòng và được rửa lại bằng nước máy bình thường, đưa mẫu vào trong tủ cấy vô trùng.
Trong tủ cấy vô trùng:
- Rửa chồi bằng nước cất vô trùng. - Lắc etanol 70% (v/v) trong 2 phút. - Rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng.
- Lắc mẫu bằng hóa chất khử trùng với nồng độ và thời gian theo thí nghiệm.
- Rửa lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng.
Hóa chất khử trùng sử dụng trong thí nghiệm: Etanol, Cefotaxime (thuốc kháng sinh diệt khuẩn), Povidon I ốt (dung dịch chứa I ốt dùng sát khuẩn trong y tế), Javen (NaOCl) và sục mẫu trong ô zôn (ô zôn được tạo bằng máy BKOzone H01, Viện Vật Lý Đại học Bách khoa).
22
Sơ đồ nghiên cứu:
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tạo vật liệu in vitro ở cây Đinh lăng 2.3.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, 40 mẫu/công thức.
Thu mẫu cây Đinh lăng
Đỉnh sinh trưởng (3-4cm)
Trồng và chăm sóc trong điều kiện phòng thí nghiệm
Phân loại
Xử lý sơ bộ mẫu Đinh lăng
Hiệu quả chất khử trùng đến mẫu Đinh lăng (Ô zôn, cefotaxim, cồn I ốt, Javen)
Đánh giá sinh trưởng mẫu Đinh lăng in vitro
(Nuôi cấy mẫu trên môi trường MS cơ bản, theo dõi chỉ tiêu sau 30 ngày nuôi cấy)
23
2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh Đinh lăng.
Đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng đã khử trùng sơ bộ được sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm này theo các công thức bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng.
Công thức Chất xử lý/thời gian
ĐC Xử lý sơ bộ
T1 Xử lý sơ bộ + Sục trong ô zôn/60 phút (ô zôn được tạo bằng máy BKOzone H01, Viện Vật Lý Đại học Bách khoa)
T2 Xử lý sơ bộ + cefotaxim 500mg.L-1/lắc 300 vòng/phút trong 24 giờ T3 Xử lý sơ bộ + Povidon I ốt 10% (v/v)/20 phút T4 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/10 phút T5 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/20 phút T6 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/30 phút T7 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/10 phút T8 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/20 phút T9 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/30 phút T10 Xử lý sơ bộ + Javen 15% (v/v)/10 phút T11 Xử lý sơ bộ + Javen 15% (v/v)/20 phút T12 Xử lý sơ bộ + Javen 15% (v/v)/30 phút
Mẫu cấy sau khi được khử trùng trong tủ cấy sẽ được cắt theo từng đốt đều nhau dài khoảng 0,5 – 1 cm, thấm khô mẫu rồi cấy vào các bình tam giác chứa môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962). Đặt trên giàn nuôi cấy theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống sau 30 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
24
- Tỷ lệ mẫu sống (%): (Tổng số mẫu sống / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - Tỷ lệ mẫu chết (%): (Tổng số mẫu chết / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - Hiệu quả khử trùng (%): Tỷ lệ mẫu sống - Tỷ lệ mẫu chết.
- Quy trình đơn giản tạo vật liệu in vitro cây Đinh lăng.
2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng phương pháp tạo đa chồi (Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi).
Sau khi xác định được công thức khử trùng tạo chồi Đinh lăng in vitro và nuôi cấy trong môi trường MS ở thí nghiệm 1 sau 30 ngày nuôi cấy, chúng tôi bổ sung BAP với nồng độ thay đổi từ 0 – 3,5 mg/l vào môi trường MS để xác định ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi cây Đinh lăng (đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy). Dựa vào tài liệu tham khảo và quá trình thí nghiệm thăm dò nồng độ BAP được chia theo các mức sau:
Bảng 2.2. Công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi cây Đinh lăng.
Công thức Thành phần môi trường
CT1 MS (Đối chứng) CT2 MS + 1,0 mg/l BAP CT3 MS + 1,5 mg/l BAP CT4 MS + 2,0 mg/l BAP CT5 MS + 2,5 mg/l BAP CT6 MS + 3,0 mg/l BAP CT7 MS + 3,5 mg/l BAP
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi = ∑ chồi tạo thành / ∑ chồi đưa vào
2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro (Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi đỉnh Đinh lăng) đến khả năng tạo rễ ở chồi đỉnh Đinh lăng)
Các chồi phát sinh sau khi thực hiện thí nghiệm 3 có kích thước 2 – 3 cm được đưa vào các môi trường có bổ sung NAA với nồng độ khác nhau, nhằm
25
xác định nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây Đinh lăng in vitro
và tạo cây con khỏe mạnh.
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của NAA đến tạo rễ cây Đinh lăng in vitro
Công thức Thành phần môi trường
CT1 MS (Đối chứng) CT2 MS + 0,1 mg/l NAA CT3 MS + 0,2 mg/l NAA CT4 MS + 0,3 mg/l NAA CT5 MS + 0,4 mg/l NAA CT6 MS + 0,5 mg/l NAA CT7 MS + 0,6 mg/l NAA
Chỉ tiêu theo dõi:
- Công thức nào tạo rễ (+) và công thức nào không tạo rễ (-) sau 4 tuần nuôi cấy.
- Chiều dài trung bình rễ (cm) sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.2.4. Thí nghiệm 4: Đánh giá một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và sinh lý của cây Đinh lăng in vitro lý của cây Đinh lăng in vitro
Thí nghiệm này chúng tôi bước đầu nghiên cứu một số đặc điểm hình thái giải phẫu, sinh lý của cây Đinh lăng in vitro nhằm đánh giá các đặc điểm này của cây Đinh lăng in vitro so với cây trồng ngoài tự nhiên có nhiều sự khác biệt gì hay không. Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Thực vật học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
a. Thí nghiệm 4a: Đánh giá một số đặc điểm hình thái, giải phẫu
Mẫu cây Đinh lăng invitro sau 4 tuần nuôi cấy chúng tôi tiến hành chụp ảnh chồi ngọn, giải phẫu thân và cuống lá cùng với đó là cây ngoài tự nhiên để đánh giá so sánh một số đặc điểm hình thái giải phẫu.
Mẫu thân, cuống lá cây in vitro và cây trồng ngoài tự nhiên được giải phẫu bằng cách cắt lát mỏng rồi đưa vào nhuộm kép với các bước như sau:
26
- Lát cắt được ngâm vào dung dịch Javen trong 15- 20 phút. - Rửa sạch javen bằng nước cất.
- Ngâm mẫu bằng axit axetic để tẩy javen. - Rửa sạch axit axetic bằng nước cất.
- Nhuộm đỏ bằng dung dịch Cacmin trong thời gian 2 tiếng. - Rửa qua nước cất.
- Nhuộm trong Xanh metylen khoảng 1 phút. - Rửa qua nước cất.
Lên kính bằng nước cất hoặc glixeron và quan sát, chụp ảnh ở độ phóng đại 10X. Sử dụng kính hiển vi quang học CXL ( hãng LABOMED).
b. Thí nghiệm 4b: Đánh giá một số đặc điểm sinh lý
Ở đây chúng tôi chỉ tìm hiểu về đặc điểm sinh lý của cây Đinh lăng giới hạn ở hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và tổng số (a+b). Nhằm so sánh hàm lượng diệp lục ở cây in vitro và cây ngoài tự nhiên để biết được thời gian chiếu sáng và cường độ chiếu sáng cho cây trên giàn nuôi cấy có hợp lý không.
Thí nghiệm này chúng tôi đánh giá hàm lượng diệp lục giữa lá cây Đinh lăng trồng ngoài tự nhiên và nuôi trong điều kiện in vitro bằng phương pháp quang phổ (theo Lichtenthaler H.K và Wellburn A.R, 1993) [19] và sử dụng dung môi là axeton.
Cách tiến hành [19]:
- Làm lạnh mẫu lá bằng nitơ lỏng, nghiền thành bột mịn.
- Lấy 0,2 g bột mịn vào ống, bổ sung 20 ml axeton và đợi nguyên liệu thấm axeton (khoảng 10 phút)
- Cho dung dịch vào ống fancol (loại 15 ml) ly tâm cho các hạt phân tán rơi xuống đáy.
- Đo sự hấp thụ của dịch chiết ở bước sóng 644,8 nm (A644,8) và 661,6 nm (A661,6).
27
Nồng độ của diệp lục a (Ca), diệp lục b (Cb) và Ca+b được tính toán theo phương trình sau (dịch chiết là axeton):
Ca (µg/ml) = 11,24. A661,6 - 2,04. A644,8
Cb (µg/ml) = 20,13. A644,8 - 4,19. A661,6 Ca+b (µg/ml) = 7,05. A661,6 + 18,09. A644,8
Hàm lượng diệp lục được tính theo công thức: A= C.V/P
C [Ca, Cb, Ca+b]: nồng độ sắc tố (µg/ml) V: thể tích dịch chiết sắc tố (ml)
P: khối lượng mẫu (g)
A: hàm lượng diệp lục (µg/g) lá tươi
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng chương trình Excel 2007 theo mô tả của Nguyễn Văn Mã và cộng sự, 2013 [19].
28
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) Harms)
Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn. Thí nghiệm đó phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Đây là bước quan trọng trong nuôi cấy mô cây Đinh lăng.
Thí nghiệm này là tìm ra loại hóa chất diệt khuẩn tốt nhất và hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý, khả năng thâm nhập của chúng vào các kẽ, ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy từ đó để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm sau.
Xử lý sơ bộ đóng vai trò quan trọng tới sự thành công của quá trình tạo vật liệu in vitro. Mẫu đỉnh sinh trưởng (3 - 4 cm) được xử lý sơ bộ như mô tả ở phần phương pháp. Trong giai đoạn này, chúng tôi sử dụng etanol 70% để khử trùng sơ bộ, vì etanol là chất lỏng, có sức căng bề mặt thấp, tạo điều kiện cho các chất khử trùng khác có thể xâm nhập tốt hơn.
Mẫu sau khi được xử lý sơ bộ sẽ được dùng làm nguyên liệu cho các công thức ở bảng 2.1. Theo dõi chỉ tiêu mẫu nhiễm, mẫu sạch sau 30 ngày nuôi cấy được kết quả như bảng 3.1 và hình 3.1.
29
Bảng 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng Công thức Tỷ lệ mẫu
nhiễm (%)
Mẫu sạch Hiệu quả khử trùng (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) ĐC 100 0 0 0 T1 100 0 0 0 T2 100 0 0 0 T3 100 0 0 0 T4 100 0 0 0 T5 96,26 3,74 0 3,74 T6 89,89 8,68 1,43 7,25 T7 78,63 17,50 3,87 13,63 T8 58,21 37,54 4,25 33,29 T9 73,69 21,45 4,86 16,59 T10 77,16 17,18 5,66 11,52 T11 75,80 17,92 6,28 11,64 T12 78,19 15,42 6,39 9,03
30
Hình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng
Kết quả cho thấy, mẫu khử trùng ở các công thức ĐC (xử lý sơ bộ), T1 (sục trong ô zôn), T2 (cefotaxim), T3 (povidon I ốt), T4 (dung dịch Javen 5%/10 phút) không cho hiệu quả khử trùng mẫu in vitro, các mẫu hầu hết đều bị nhiễm trong khoảng 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MS. Các công thức từ T5 đến T12 cho thấy Javen có tác dụng khử trùng mẫu in vitro. Tuy nhiên có sự khác nhau về hiệu quả, có thể xếp thành 3 nhóm: tác dụng khử trùng tốt nhất là ở công thức T8 (đạt 33,29%), tiếp theo là T7, T9, T10, T11 và tác dụng thấp là T5, T6, T12. Kết quả này cho thấy, khi sử dụng nồng độ Javen thấp thì hiệu quả khử trùng không rõ rệt (công thức T4), nhưng nếu tăng về thời gian, hiệu quả khử trùng có thể được tăng lên (T5, T6). Sự gia tăng về nồng độ Javen sử dụng cũng đưa lại hiệu quả tạo mẫu sạch, nhưng mang lại tác dụng phụ đó là tỷ lệ mẫu sạch nhưng không thể sống được trong môi trường in vitro cũng tăng lên. Có thể do Javen nồng độ cao thì ngoài tác dụng diệt vi khuẩn, bào tử nấm còn gây chết cho tế bào thực vật.
0 5 10 15 20 25 30 35 ĐC T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 0 0 0 0 0 3.74 7.25 13.63 33.29 16.59 11.52 11.64 9.03
31
Hình 3.2 Đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng. (Trái) mẫu in vitro vô trùng sau 5 ngày nuôi cấy, (Phải) mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy.
Từ kết quả này, chúng tôi đưa ra sơ đồ quy trình đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây Đinh lăng ở hình 3.3.
32 Bước 1. Thu mẫu cây
Đinh lăng ngoài thực địa
Bước 2. Thu đỉnh sinh trưởng mới hình thành trong phòng thí nghiệm (3-
4cm)
Bước 3. Rửa sạch đỉnh sinh trưởng dưới vòi nước sạch với xà phòng Bước 4. Xử lý bằng cồn 70% - 2 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng 2-3 lần, lắc trong Javen 10 % - 20 phút, rửa lại 3-5 lần nước cất
Bước 5. Thấm khô mẫu trên giấy lọc khô đã khử
trùng
Bước 6. Nuôi cấy trên môi trường MS vô trùng
Hình 3.3 Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây Đinh lăng
33
3.2. Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng phương pháp tạo đa chồi (Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi cây Đinh lăng in vitro) của BAP đến khả năng tạo đa chồi cây Đinh lăng in vitro)
Việc nhân chồi in vitro có vai trò quan trọng trong việc tạo ra lượng lớn cây con in vitro làm nguyên liệu cho các quá trình nhân giống tiếp theo. Đây là quá trình quan trọng và cũng có thể nói đây là nhiệm vụ của nhân giống vô tính.
Ở giai đoạn này chúng tôi sử dụng môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP ở các ngưỡng nồng độ khác nhau nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh, tạo ra số chồi nhiều, có chất lượng tốt trong