b. Thí nghiệm 4b: Đánh giá một số đặc điểm sinh lý
3.1.Tạo vật liệu invitro chồi đỉnh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.)
Harms)
Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn. Thí nghiệm đó phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Đây là bước quan trọng trong nuôi cấy mô cây Đinh lăng.
Thí nghiệm này là tìm ra loại hóa chất diệt khuẩn tốt nhất và hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý, khả năng thâm nhập của chúng vào các kẽ, ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy từ đó để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm sau.
Xử lý sơ bộ đóng vai trò quan trọng tới sự thành công của quá trình tạo vật liệu in vitro. Mẫu đỉnh sinh trưởng (3 - 4 cm) được xử lý sơ bộ như mô tả ở phần phương pháp. Trong giai đoạn này, chúng tôi sử dụng etanol 70% để khử trùng sơ bộ, vì etanol là chất lỏng, có sức căng bề mặt thấp, tạo điều kiện cho các chất khử trùng khác có thể xâm nhập tốt hơn.
Mẫu sau khi được xử lý sơ bộ sẽ được dùng làm nguyên liệu cho các công thức ở bảng 2.1. Theo dõi chỉ tiêu mẫu nhiễm, mẫu sạch sau 30 ngày nuôi cấy được kết quả như bảng 3.1 và hình 3.1.
29
Bảng 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng Công thức Tỷ lệ mẫu
nhiễm (%)
Mẫu sạch Hiệu quả khử trùng (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) ĐC 100 0 0 0 T1 100 0 0 0 T2 100 0 0 0 T3 100 0 0 0 T4 100 0 0 0 T5 96,26 3,74 0 3,74 T6 89,89 8,68 1,43 7,25 T7 78,63 17,50 3,87 13,63 T8 58,21 37,54 4,25 33,29 T9 73,69 21,45 4,86 16,59 T10 77,16 17,18 5,66 11,52 T11 75,80 17,92 6,28 11,64 T12 78,19 15,42 6,39 9,03
30
Hình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng
Kết quả cho thấy, mẫu khử trùng ở các công thức ĐC (xử lý sơ bộ), T1 (sục trong ô zôn), T2 (cefotaxim), T3 (povidon I ốt), T4 (dung dịch Javen 5%/10 phút) không cho hiệu quả khử trùng mẫu in vitro, các mẫu hầu hết đều bị nhiễm trong khoảng 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MS. Các công thức từ T5 đến T12 cho thấy Javen có tác dụng khử trùng mẫu in vitro. Tuy nhiên có sự khác nhau về hiệu quả, có thể xếp thành 3 nhóm: tác dụng khử trùng tốt nhất là ở công thức T8 (đạt 33,29%), tiếp theo là T7, T9, T10, T11 và tác dụng thấp là T5, T6, T12. Kết quả này cho thấy, khi sử dụng nồng độ Javen thấp thì hiệu quả khử trùng không rõ rệt (công thức T4), nhưng nếu tăng về thời gian, hiệu quả khử trùng có thể được tăng lên (T5, T6). Sự gia tăng về nồng độ Javen sử dụng cũng đưa lại hiệu quả tạo mẫu sạch, nhưng mang lại tác dụng phụ đó là tỷ lệ mẫu sạch nhưng không thể sống được trong môi trường in vitro cũng tăng lên. Có thể do Javen nồng độ cao thì ngoài tác dụng diệt vi khuẩn, bào tử nấm còn gây chết cho tế bào thực vật.
0 5 10 15 20 25 30 35 ĐC T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 0 0 0 0 0 3.74 7.25 13.63 33.29 16.59 11.52 11.64 9.03
31
Hình 3.2 Đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng. (Trái) mẫu in vitro vô trùng sau 5 ngày nuôi cấy, (Phải) mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy.
Từ kết quả này, chúng tôi đưa ra sơ đồ quy trình đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây Đinh lăng ở hình 3.3.
32 Bước 1. Thu mẫu cây
Đinh lăng ngoài thực địa
Bước 2. Thu đỉnh sinh trưởng mới hình thành trong phòng thí nghiệm (3-
4cm)
Bước 3. Rửa sạch đỉnh sinh trưởng dưới vòi nước sạch với xà phòng Bước 4. Xử lý bằng cồn 70% - 2 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng 2-3 lần, lắc trong Javen 10 % - 20 phút, rửa lại 3-5 lần nước cất
Bước 5. Thấm khô mẫu trên giấy lọc khô đã khử
trùng
Bước 6. Nuôi cấy trên môi trường MS vô trùng
Hình 3.3 Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây Đinh lăng
33
3.2. Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng phương pháp tạo đa chồi (Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi cây Đinh lăng in vitro)