Nghiên cứu nhân giống hữu tính và đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid trong củ cây bình vôi stephania glabra (roxb ) miers, theo năm tuổi và theo mùa trong năm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN KIỀU DUYÊN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ALCALOID TRONG CỦ CÂY BÌNH VÔI - Stephania glabra (Roxb.) Miers, THEO NĂM TUỔI VÀ THEO MÙA TRONG NĂM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI: 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN KIỀU DUYÊN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ALCALOID TRONG CỦ CÂY BÌNH VÔI - Stephania glabra (Roxb.) Miers, THEO NĂM TUỔI VÀ THEO MÙA TRONG NĂM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Quốc Huy 2. GS. TS. Phạm Thanh Kỳ HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của Trường Đại học Dược Hà Nội, các Thầy Cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Phạm Thanh Kỳ, TS. Nguyễn Quốc Huy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn: Các cán bộ Phòng Kiểm tra chất lượng là đồng nghiệp của tôi và lãnh đạo của tôi là Ths. Phùng Minh Dũng, DSCK II. Trần Bình Duyên - Công ty cổ phần Dược TW Mediplantex Các thầy cô Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường ĐH Dược Hà Nội đã đóng góp những ý kiến quí báu cho tôi khi thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các Giảng viên, các Kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội, nơi tôi công tác đã tạo điều kiện rất thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Cám ơn DS. Nguyễn Vũ Minh và các sinh viên nghiên cứu đã luôn sát cánh cùng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ông Đỗ Ngọc Sâm - Xã Tản Lĩnh, Huyện Ba Vì, Hà Nội; Anh Vũ Long Vân Công ty CP Lâm Y Dược Bắc Sơn tại xã Nghĩa Phương, Lục Nam, Bắc Giang đã giúp tôi thu thập mẫu, chăm sóc cây và bố trí, tiến hành nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người bạn, người thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ, chồng và các con đã luôn kịp thời động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất. Xin trân trọng cảm ơn ! Trần Kiều Duyên DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ CP Cổ phần DC Dịch chiết DL Dược liệu DĐVN III Dược điển Việt Nam III DĐVN IV GAP Dược điển Việt Nam IV Good Agricultural Practices Thực hành tốt trồng trọt HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HL hàm lượng NN & PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn NCKH Nghiên cứu khoa học S. Stephania SKĐ STT TCCS Sắc ký đồ Số thứ tự Tiêu chuẩn cơ sở TW Trung ương YDHCT Y dược học cổ truyền WHO World Health Organization DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1. Hình 1.1: Vị thuốc Bình vôi dùng trong Dược học cổ truyền 4 2. Hình 1.2: Hình ảnh loài S.glabra (Roxb.) Miers 6 3. Hình 1.3: Cây Bình vôi S.glabra (Roxb.) Miers mọc tự nhiên 6 4. Hình 3.4: Hạt Bình vôi đạt tiêu chuẩn 32 5. Hình 3.5: Cây mầm sau 6 tháng gieo hạt 35 6. Hình 3.6: Cây con vừa được vào bầu 36 7. Hình 3.7: Nhà huấn luyện cây con 39 8. Hình 3.8: Cây con được che bóng 75% sau 5 tháng ra bầu 39 9. Hình 3.9: Cây con được che bóng 50% sau 5 tháng ra bầu 39 10. Hình 3.10: Cây con được che bóng 25% sau 5 tháng ra bầu 40 11. Hình 3.11: Cây giống đạt tiêu chuẩn trước khi đem trồng 40 DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1. Bảng 1.1: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần của Nguyễn Tiến Vững 8 2. Bảng 1.2: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần của Lã Đình Mỡi 9 3. Bảng 1.3: Kết quả định lượng rotundin của Nguyễn Tiến Vững 11 4. Bảng 1.4: Kết quả định lượng rotundin Lã Đình Mỡi 11 5. Bảng 2.5: Thiết kế nghiên cứu mức độ che bóng 27 6. Bảng 2.6: Số lượng củ Bình vôi lấy mẫu theo số năm tuổi 28 7. Bảng 2.7: Ngày lấy mẫu theo mùa trong năm 28 8. Bảng 2.8: Giá trị tham khảo theo Test Dixon 30 9. Bảng 3.9: Kết quả thực nghiệm theo dõi cách bảo quản hạt 33 10. Bảng 3.10: Bảng quy trình xử lý hạt 34 11. Bảng 3.11: Theo dõi hạt nảy mầm ở 3 phương pháp xử lý hạt 34 12. Bảng 3.12. Số lượng cây sống sau khi ra bầu 36 13. Bảng 3.13. Sự phát triển của cây con sau khi ra bầu 37 14. Bảng 3.14: Tỷ lệ cây con sống sau khi ra bầu 5 tháng 38 15. Bảng 3.15: Sự sinh trưởng và phát triển của cây con 38 16. Bảng 3.16. Khối lượng củ theo tuổi khảo sát lần 1 41 17. Bảng 3.17. Khối lượng củ theo tuổi khảo sát lần 2 42 18. Bảng 3.18: So sánh khối lượng củ theo tuổi của 2 lần khảo sát 43 19. Bảng 3.19: Hàm lượng alcaloid toàn phần củ cây 1 tuổi, 2 tuổi, 3 tuổi 43 20. Bảng 3.20. Hàm lượng alcaloid toàn phần ở củ cây 2 tuổi, 3 tuổi, 4 tuổi 44 21. Bảng 3.21: So sánh hàm lượng alcaloid toàn phần tính theo năm tuổi 44 22. Bảng 3.22. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần đánh giá theo mùa 45 23. Bảng 3.23: So sánh hàm lượng alcaloid tích lũy trong củ giữa các mùa 45 24. Bảng 3.24: Kết quả đánh giá độ phù hợp cột C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) 46 25. Bảng 3.25: Đánh giá độ phù hợp của cột C18 (150 x 2,1 mm; 3µm) 46 26. Bảng 3.26: Đánh giá độ thích hợp và độ ổn định của hệ thống 47 27. Bảng 3.27: Đánh giá mức độ ảnh hưởng các thành phần alcaloid tới rotundin 48 28. Bảng 3.28: Hàm lượng rotundin ở củ cây 1 tuổi, 2 tuổi, 3 tuổi 48 29. Bảng 3.29. Hàm lượng rotundin ở củ cây 2 tuổi, 3 tuổi, 4 tuổi 49 30. Bảng 3.30: So sánh hàm lượng rotundin trong củ theo tuổi 49 31. Bảng 3.31: Số lượng pic và % diện tích rotundin so với tổng diện tích của alcaloid toàn phần 50 32. Bảng 3.32 Kết quả định lượng rotundin theo mùa trong năm 50 33. Bảng 3.33: Dữ liệu so sánh hàm lượng rotundin giữa các mùa 51 MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG Tên mục Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tình hình khai thác và nhu cầu sử dụng Bình vôi 1.1.1. Tình hình khai thác 1.1.2. Nhu cầu sử dụng 1.2. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học loài Stephania glabra (Roxb.) Miers 1.2.1. Đặc điểm thực vật 1.2.2. Thành phần hóa học 1.3. Phƣơng pháp định lƣợng, hàm lƣợng alcaloid toàn phần và rotundin ở củ một số loài Việt Nam 1.3.1. Phương pháp định lượng alcaloid toàn phần 1.3.2. Hàm lượng alcaloid toàn phần có trong củ một số loài Bình vôi 1.3.3. Phương pháp định lượng rotundin 1.3.4. Hàm lượng rotundin có trong củ một số loài Bình vôi 1.4. Sinh lý nẩy mầm của hạt và ƣu điểm nhƣợc điểm, một số yếu tố ảnh hƣởng tới nhân giống hữu tính 1.4.1. Sinh lý học nẩy mầm củ hạt 1. 4.2. Ưu nhược điểm của phương pháp nhân giống hữu tính 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống hữu tính 1.5. Hƣớng dẫn của tổ chức y tế thế giới (WHO) thực hiện thực hành tốt trồng cây thuốc 1.5.1. Nhận dạng/ xác định cây thuốc được trồng 3 3 3 4 4 7 7 7 8 9 11 11 11 11 13 17 1.5.2. Hạt giống và các vật liệu nhân giống khác 1.5.3. Trồng trọt 1.5.4. Thu hái 1.5.5. Nhân sự 17 18 21 23 Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu 2.1.3. Hóa chất, thuốc thử và chất chuẩn 24 24 24 25 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1. Nghiên cứu nhân giống hữu tính cây Bình vôi S.glabra 25 2.2.2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ Bình vôi theo năm tuổi và theo các mùa trong năm 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu 28 31 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1. Nghiên cứu nhân giống hữu tính cây Bình vôi S. glabra 3.1.1. Xác định thời điểm thu hái, hạt đạt tiêu chuẩn 3.1.2. Lựa chọn cách bảo quản hạt 3.1.3. Lựa chọn phương pháp xử lý hạt và thời hạn bảo quản hạt 3.1.4. Lựa chọn công thức dinh dưỡng bầu 3.1.5. Xác định mức độ che bóng cây con 3.1.6. Tiêu chuẩn cây con trước khi đem trồng 3.2. Sự thay đổi hàm lƣợng alcaloid toàn phần và rotundin trong của Bình vôi (S. glabra) theo tuổi và theo các mùa trong năm 3.2.1. Khảo sát sự thay đổi khối lượng củ theo tuổi 3.2.2. Định lượng alcaloid toàn phần trong củ S. glabra theo tuổi 3.2.3. Định lượng alcaloid toàn phần trong củ theo các mùa trong năm ở cây trưởng thành 32 32 33 34 35 37 40 41 41 41 43 44 [...]... Nghiên cứu nhân giống hữu tính và đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid trong củ cây Bình vôi Stephania glabra (Roxb. ) Miers, theo năm tuổi và theo mùa trong năm đã được thực hiện với 2 mục tiêu: 1 Nghiên cứu nhân giống hữu tính và tiêu chuẩn cây giống Bình vôi Stephania glabra (Roxb. ) Miers 2 Đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ cây Bình vôi Stephania glabra (Roxb. ). ..3.2.4 Định lượng rotundin trong củ theo năm tuổi 45 3.2.5 Định lượng rotundin trong củ theo các mùa trong năm ở mẫu củ trưởng thành 50 Chƣơng 4 BÀN LUẬN 52 4.1 Về xây dựng quy trình nhân giống hữu tính 52 4.2 Về sự thay đổi hàm lƣợng alcaloid toàn phần và rotundin theo tuổi và theo 54 mùa trong năm KẾT LUẬN 57 ĐỀ XUẤT 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Bình vôi (Stephania Lour .) là một chi... năm tuổi thu được từ vườn trồng Lần 1 củ có từ 1, 2, 3 năm tuổi thời gian trồng cụ thể cây 1 tuổi (trồng từ 3.2012 đến 3.301 3), 2 tuổi (trồng từ 3.2011 đến 3.201 3), 3 tuổi (trồng từ 3.2010 đến 3.201 3) Lần 2 củ của cây có từ 2, 3, 4 năm tuổi thời gian trồng cụ thể 2 tuổi (trồng từ 3.2012 đến 3.301 4), 3 tuổi (trồng từ 3.2011 đến 3.201 4), 4 tuổi (trồng từ 3.2010 đến 3.201 4) - Củ của cây trưởng thành (cây. .. loài Bình vôi (Stephania spp .) tạo nguyên liệu làm thuốc” công ty cổ phần dược TW Mediplantex chủ trì Vườn giống gốc được tạo ra từ các cây Bình vôi đã được xác định tên khoa học là S glabra mã số tiêu bản: HNIP/17794/11 lưu tại trường đại học Dược Hà Nội, được trồng và chăm sóc theo quy trình - Củ 1, 2, 3, 4 tuổi loài S glabra để nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin theo năm. .. phần trong một số loài Bình vôi Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững [30] đã công bố hàm lượng alcaloid toàn phần từ 3 loài Bình vôi bằng phương pháp trung hòa (Bảng 1. 1) Bảng 1.1 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (nghiên cứu của Nguyễn Tiến Vững) Stt Tên loài Nơi thu hái HL alcaloid toàn phần ( %) 1 S glabra (Roxb. ) Miers Ninh Bình 2,96 2 S kuinanensis H.S.Lo Lạng Sơn 4,41 3 Stephania sp3 Quảng Ninh 2,32 Năm. .. vôi Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững [30] đã xác định hàm lượng rotundin trong 3 loài Bình vôi nghiên cứu bằng phương pháp đo quang Bảng 1.3 Kết quả định lượng rotundin (nghiên cứu của Nguyễn Tiến Vững) Stt Tên loài Nơi thu hái Hàm lượng rotundin ( %) 1 S glabra (Roxb. ) Miers Ninh Bình 0,59 2 S kuinanensis H.S.Lo Lạng Sơn 3,06 3 Stephania sp3 Quảng Ninh 1,52 Năm 2002, Lã Đình Mỡi [21] đã khảo sát hàm lượng. .. LÝ NẨY MẦM CỦA HẠT VÀ ƯU NHƯỢC ĐIỂM VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH 1.4.1 Sinh lý nẩy mầm của hạt [21] 1.4.1.1 Sự hút nước: Hút nước là quá trình ñầu tiên của sự nảy mầm, quá trình này phụ thuộc vào 3 yếu tố: Thành phần các chất có trong hạt, khả năng thấm của vỏ hạt, lượng nước hữu hiệu và hoạt động của enzyme ngay sau khi hút nước đã tạo ra thay đổi và quá trình trao đổi chất xảy... 4 tuổi) để nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin theo các mùa trong năm được trồng tại vườn có thời gian trồng từ ngày tháng 3.2010 - Nơi thực hiện: + Vườn giống Xã Nghĩa Phương, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang + Bộ môn Thực vật Trường Đại Học Dược Hà Nội + Phòng Kiểm tra chất lượng đạt GLP, Công ty CP Dược TW Mediplantex 2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu 2.1.2.1 Nghiên cứu nhân. .. Hòa Bình, Hà Giang, Tuyên Quang, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Côn Đảo [2], [19], [21], [27], [29] 5 1 Củ 2 Hạt 3 Cành mang hoa đực 4 Hoa cái và quả Hình 1.2 Hình loài S glabra (Roxb. ) Miers [30] Hình 1.3: Cây Bình vôi Stephania glabra (Roxb. ) Miers mọc tự nhiên 6 1.2.2 Thành phần hóa học 1.2.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới - Thành phần hóa học trong củ Bình vôi gồm có alcaloid, ... di truyền với kiểu của một mẫu đã xác nhận Các tài liệu về lai lịch thực vật cần được lưu trong hồ sơ đăng ký 17 1.5.2 Hạt giống và các vật liệu nhân giống khác Hạt giống và các vật liệu nhân giống khác cần được nêu cụ thể và nhà cung cấp hạt giống và các vật liệu nhân giống khác cần cung cấp tất cả các thông tin cần thiết liên quan đến lai lịch, chất lượng và tính năng của sản phẩm của họ, cũng như . DUYÊN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ALCALOID TRONG CỦ CÂY BÌNH VÔI - Stephania glabra (Roxb. ) Miers, THEO NĂM TUỔI VÀ THEO MÙA TRONG NĂM LUẬN. Luận văn thạc sỹ Nghiên cứu nhân giống hữu tính và đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid trong củ cây Bình vôi Stephania glabra (Roxb. ) Miers, theo năm tuổi và theo mùa trong năm đã được thực. 1. Nghiên cứu nhân giống hữu tính và tiêu chuẩn cây giống Bình vôi Stephania glabra (Roxb. ) Miers 2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ cây Bình vôi Stephania