Nghiên cứu nhân giống hữu tính và đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid trong củ cây bình vôi stephania glabra (roxb ) miers, theo năm tuổi và theo mùa trong năm

là một chi lớn trên thế giới, được phân bố chủ yếu ở các nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan…Việt Nam có khoảng 20 loài Bình vôi, Bình vôi là dược liệu được sử dụng nhiều trong Y Dược

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN KIỀU DUYÊN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ

SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ALCALOID TRONG CỦ CÂY BÌNH VÔI - Stephania glabra (Roxb.) Miers,

THEO NĂM TUỔI VÀ THEO MÙA TRONG NĂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI: 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN KIỀU DUYÊN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ

SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ALCALOID TRONG CỦ CÂY BÌNH VÔI - Stephania glabra (Roxb.) Miers,

THEO NĂM TUỔI VÀ THEO MÙA TRONG NĂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60720406

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Nguyễn Quốc Huy

2 GS TS Phạm Thanh Kỳ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của Trường Đại học Dược Hà Nội, các Thầy Cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới

GS TS Phạm Thanh Kỳ, TS Nguyễn Quốc Huy đã trực tiếp hướng dẫn,

hết lòng chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Các cán bộ Phòng Kiểm tra chất lượng là đồng nghiệp của tôi và lãnh đạo của tôi

là Ths Phùng Minh Dũng, DSCK II Trần Bình Duyên - Công ty cổ phần

Dược TW Mediplantex

Các thầy cô Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường ĐH Dược Hà Nội

đã đóng góp những ý kiến quí báu cho tôi khi thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các Giảng viên, các Kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội, nơi tôi công tác đã tạo điều kiện rất thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cám ơn DS Nguyễn Vũ Minh và các sinh viên nghiên cứu đã luôn sát

cánh cùng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ông Đỗ Ngọc Sâm - Xã Tản Lĩnh, Huyện Ba

Vì, Hà Nội; Anh Vũ Long Vân Công ty CP Lâm Y Dược Bắc Sơn tại xã Nghĩa Phương, Lục Nam, Bắc Giang đã giúp tôi thu thập mẫu, chăm sóc cây và

bố trí, tiến hành nghiên cứu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người bạn, người

thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ, chồng và các con đã luôn kịp thời động

viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất

Xin trân trọng cảm ơn !

Trần Kiều Duyên

( Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

DANH MỤC HÌNH

1 Hình 1.1: Vị thuốc Bình vôi dùng trong Dược học cổ truyền 4

2 Hình 1.2: Hình ảnh loài S.glabra (Roxb.) Miers 6

3 Hình 1.3: Cây Bình vôi S.glabra (Roxb.) Miers mọc tự nhiên 6

8 Hình 3.8: Cây con được che bóng 75% sau 5 tháng ra bầu 39

9 Hình 3.9: Cây con được che bóng 50% sau 5 tháng ra bầu 39

10 Hình 3.10: Cây con được che bóng 25% sau 5 tháng ra bầu 40

11 Hình 3.11: Cây giống đạt tiêu chuẩn trước khi đem trồng 40

DANH MỤC BẢNG

rotundin 48

của alcaloid toàn phần

50

1.3 Phương pháp định lượng, hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin ở củ một

số loài Việt Nam

1.3.1 Phương pháp định lượng alcaloid toàn phần

1.3.2 Hàm lượng alcaloid toàn phần có trong củ một số loài Bình vôi

1.3.3 Phương pháp định lượng rotundin

1.3.4 Hàm lượng rotundin có trong củ một số loài Bình vôi

1.4 Sinh lý nẩy mầm của hạt và ưu điểm nhược điểm, một số yếu tố ảnh hưởng

tới nhân giống hữu tính

1.4.1 Sinh lý học nẩy mầm củ hạt

1 4.2 Ưu nhược điểm của phương pháp nhân giống hữu tính

1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống hữu tính

1.5 Hướng dẫn của tổ chức y tế thế giới (WHO) thực hiện thực hành tốt trồng cây thuốc

1.5.1 Nhận dạng/ xác định cây thuốc được trồng

1.5.2 Hạt giống và các vật liệu nhân giống khác

2.1 Nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử và chất chuẩn

24

24

24

25

2.2.1 Nghiên cứu nhân giống hữu tính cây Bình vôi S.glabra 25

2.2.2 Đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ Bình

vôi theo năm tuổi và theo các mùa trong năm

2.3 Phương pháp xử lý số liệu

28

31

3.1 Nghiên cứu nhân giống hữu tính cây Bình vôi S glabra

3.1.1 Xác định thời điểm thu hái, hạt đạt tiêu chuẩn

3.1.2 Lựa chọn cách bảo quản hạt

3.1.3 Lựa chọn phương pháp xử lý hạt và thời hạn bảo quản hạt

3.1.4 Lựa chọn công thức dinh dưỡng bầu

3.1.5 Xác định mức độ che bóng cây con

3.1.6 Tiêu chuẩn cây con trước khi đem trồng

3.2 Sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong của Bình vôi

(S glabra) theo tuổi và theo các mùa trong năm

3.2.1 Khảo sát sự thay đổi khối lượng củ theo tuổi

3.2.2 Định lượng alcaloid toàn phần trong củ S glabra theo tuổi

3.2.3 Định lượng alcaloid toàn phần trong củ theo các mùa trong năm ở cây trưởng thành

3.2.4 Định lượng rotundin trong củ theo năm tuổi

3.2.5 Định lượng rotundin trong củ theo các mùa trong năm ở mẫu củ trưởng thành

45

50

Chương 4 BÀN LUẬN

4.1 Về xây dựng quy trình nhân giống hữu tính

4.2 Về sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin theo tuổi và theo mùa trong năm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bình vôi (Stephania Lour.) là một chi lớn trên thế giới, được phân bố

chủ yếu ở các nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan…Việt Nam có khoảng 20 loài Bình vôi, Bình vôi là dược liệu được sử dụng nhiều trong Y Dược học cổ truyền và trong công nghiệp chiết xuất rotundin để làm nguyên liệu bào chế thuốc tân dược với tác dụng an thần, gây ngủ Tại công ty CP dược TW Mediplantex hàng năm có nhu cầu khoảng 3 tấn vị thuốc Bình vôi khô (tương đương khoảng 40 tấn Bình vôi tươi) và khoảng 1000 tấn Bình vôi tươi để chiết xuất lấy 3000 kg rotundin

Qua các tài liệu nghiên cứu về hàm lượng rotundin trong các loài Stephania

ở Việt Nam có nhiều loài có hàm lượng cao như S brachyandra, S

kuinanensis, S kwangsiensis, S glabra [21], [29] Một số loài có hàm lượng

rotundin thấp như S dielsiana, S venosa [14] Thậm chí một số loài hầu như không có rotundin như S pierrei [14]

Qua khảo sát thấy rằng loài S brachyandra mọc ở Sa Pa, Lào Cai là loài có

hàm lượng rotundin cao nhất nhưng loài này không thích hợp để trồng lớn do đặc điểm của loài này khối lượng củ tăng chậm theo năm tuổi và khó lựa chọn được vùng trồng có khí hậu như Sapa Trong các loài có hàm lượng rotundin cao còn lại

thì loài S glabra qua khảo sát có nhiều đặc điểm thích hợp để phát triển hơn cả

Loài này được đưa vào DĐVN IV, có hàm lượng rotundin khá cao và đặc điểm sinh học phù hợp với các điều kiện để phát triển vùng trồng lớn tại vùng đồi núi thấp phía Bắc

Chính vì vậy Công ty CP dược trung ương Mediplantex đã chọn loài

S glabra trong đề xuất và được giao thực hiện đề tài cấp nhà nước: “Khai thác

phát triển nguồn gen một số loài Bình vôi (Stephania spp.) tạo nguyên liệu

làm thuốc” để chủ động cho nguồn nguyên liệu Bình vôi và chất lượng nguyên

liệu đạt tiêu chuẩn, tránh sự nhầm lẫm giữa các loài Bình vôi làm ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm của công ty và góp phần bảo tồn bền vững nguồn gen

Vì các lý do trên Luận văn thạc sỹ “Nghiên cứu nhân giống hữu tính và

đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid trong củ cây Bình vôi Stephania

glabra (Roxb.) Miers, theo năm tuổi và theo mùa trong năm” đã được thực

hiện với 2 mục tiêu:

1 Nghiên cứu nhân giống hữu tính và tiêu chuẩn cây giống Bình vôi Stephania glabra (Roxb.) Miers

2 Đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ

cây Bình vôi Stephania glabra (Roxb.) Miers, theo năm tuổi và các mùa trong năm

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ NHU CẦU SỬ DỤNG BÌNH VÔI

1.1.1 Tình hình khai thác

Trữ lượng Bình vôi ở Việt Nam trước đây rất phong phú, gần 10 năm trở lại đây, do bị khai thác ồ ạt bán qua biên giới và sử dụng trong nước, nên nguồn nguyên liệu này bị cạn kiệt nhanh chóng Hiện nay, giá của rotundin đã tăng lên khoảng 10.000.000đ/kg, 1000 kg Bình vôi chiết được khoảng 2-3 kg rotundin Giá thu mua cao cũng là một trong những nguyên nhân làm cho củ Bình vôi ngày càng bị khai thác cạn kiện Bên cạnh đó phần lớn Bình vôi được các tiểu thương thu mua và bán sang Trung Quốc qua đường tiểu ngạch Bình vôi tự nhiên bị thu mua và khai thác tự do không có quản lý và bảo tồn đã làm cho cạn kiện nguồn tài nguyên Cũng chính vì bị khai thác quá mức dẫn tới nguy cơ tuyệt chủng mà 3

loài Bình vôi (loài S brachyandra Diels, S cepharantha và S dielsiana Y C

Wu) đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam ở mức EN (Endangered) [23], được xếp trong nhóm IIA Nghị định 32/2006CP Bộ NN&PTNT và lãnh đạo các tỉnh đã chỉ đạo cấm không được khai thác Bình vôi Như vậy vấn đề bảo vệ và khai thác hợp

lý có quy hoạch từng loài Bình vôi cụ thể ở Việt Nam đang là vấn đề cấp thiết

hiện nay

1.1.2 Nhu cầu sử dụng

Bình vôi là loại dược liệu quý được sử dụng trong Y dược học cổ truyền và trong chiết xuất nguyên liệu rotundin Trong Y dược học cổ truyền Bình vôi được thái nhỏ, phơi khô dùng dưới dạng thuốc sắc, ngâm rượu chữa hen, ho lao, lỵ, sốt, đau bụng, đau dạ dày, an thần kinh [19], nhu cầu sử dụng vị thuốc Bình vôi trong

Y Dược học cổ truyền hàng năm ước tính đến hàng trăm tấn Bình vôi khô

Hình 1.1: Vị thuốc Bình vôi dùng trong Y Dược học cổ truyền

Ở trong nước hằng năm ước tính nhu cầu về Bình vôi để chiết xuất rotundin đến hàng ngàn tấn (theo số liệu của các doanh nghiệp Dược sản xuất thuốc có hoạt chất rotundin) Trong khi đó Bình vôi thu hái từ tự nhiên trên cả nước chỉ đáp ứng được khoảng vài trăm tấn/năm Các doanh nghiệp trong nước hiện nay phải mua rotundin của Trung Quốc Đây là nguyên nhân khiến cho các doanh nghiệp sản xuất trong nước không chủ động được nguồn nguyên liệu ảnh hưởng tới giá thành sản xuất và chất lượng sản phẩm không ổn định

1.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC LOÀI

Stephania glabra (Roxb.) Miers

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Loài Bình vôi S glabra là cây dây leo, cây lâu năm có thể dài tới 5-15m,

hoặc hơn Toàn thân nhẵn, nhựa từ thân và lá không mang màu Thân rễ phình to thành củ, có dạng hình cầu hay bất định, kích thước lớn, đường kính thân có thể lên tới 60 cm, khối lượng củ có thể lên đến 30-170 kg Lá đơn, mọc so le, mép lá nguyên, đôi khi hơi chia thùy phần ngọn lá Toàn thân và lá không có lông Cuống

lá dài 5-10cm, gốc cuống lá hơi phình lên và cong Phiến lá to, hình tim với gốc lá phẳng hoặc hơi lõm, ngọn lá thuôn nhọn, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh lợt Gân lá có khoảng 11, xếp tỏa tròn do cuống lá đính vào 1/3 phiến lá tính từ gốc lá [1], [10]

Cụm hoa đực dạng xim tán kép, cụm hoa càng về gốc cuống lá càng dài 12cm) Mỗi cuống cụm hoa mang từ 5-8 tán, mỗi tán mang 8 tán cấp 2, mỗi cuống tán cấp 2 lại mang 4 tán cấp 3, kết thúc gồm 3 hoa với cuống của mỗi hoa rất ngắn (1-2 mm) hoa đực: đài 6, rời, hình trứng hẹp (phía móng hơi thu hẹp lại), xếp thành 2 vòng (mỗi vòng 3) gần như bằng nhau, chiều dài 1,5mm Hoa 3 cánh, hình trứng, màu xanh lá khi còn trong nụ và màu vàng khi hoa nở, dài 0,8 – 1 mm, rộng 1,2 mm Bộ nhị hàn liền thành 1 trụ, bao phấn 6, màu vàng nhạt xếp thành vòng tròn đường kính 0,6 - 1mm trên 1 trụ do chỉ nhị hàn liền biến thành cột ngắn 0,5-1 mm Khi hoa nở các bao phấn mở nắp ngang quay ra xung quanh Hạt phấn nhỏ màu vàng Khi hoa già các bao phấn tạo thành 1 viên tròn như vành khăn màu nâu sẫm hoặc thâm đen [14], [29]

(3-Cụm hoa cái dạng xim tán, cuống các bông hoa rất ngắn nên các bông hoa xếp xít vào nhau thành dạng đầu Mỗi đầu gồm 20-70 bông hoa Cuống cụm hoa dài 2-5 cm Hoa cái không đều, đài 1, hình elip, dài khoảng 1mm; cánh hoa 2, hình gần tròn, đường kính 1-1,2 mm; đài và cánh hoa xếp lệch về 1 phía của hoa Bầu hình trứng, núm nhụy chia 4-5 thùy dạng gai nhỏ và hầu như không có vòi nhụy Quả hạch, hình trứng ngược dài 5 - 6 mm, rộng 4-5mm Vỏ quả ngoài nhẵn, lúc non màu xanh, chuyển sang màu vàng đến đỏ sẫm khi chín Hạt hình trứng ngược, cụt một đầu, vỏ hạch cứng chia nhiều vạch (17- 20 vạch) Giá noãn có lỗ thủng ở giữa [10], [14], [19]

Loài Bình vôi S glabra thường được phân bố: Hà Tây, Hòa Bình, Hà

Giang, Tuyên Quang, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Côn Đảo [2], [19], [21], [27], [29]

1 Củ 2 Hạt

3 Cành mang hoa đực 4 Hoa cái và quả

Hình 1.2 Hình loài S glabra (Roxb.) Miers [30]

Hình 1.3: Cây Bình vôi Stephania glabra (Roxb.) Miers mọc tự nhiên

1.2.2 Thành phần hóa học

1.2.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

- Thành phần hóa học trong củ Bình vôi gồm có alcaloid, flavonoid tinh bột, đường khử, acid malic, men oxydase [31], [34], [35] Trong đó alcaloid là thành phần chính và được quan tâm nhiều nhất

- Cho đến nay đã có trên 300 alcaloid được phân lập và xác định cấu trúc hóa học

từ các loài thuộc chi Stephania Lour Từ loài S glabra đã phân lập được một số

alcaloid như: rotundin, promeferin, grindarin, grindaricin, gindarinin, hyndarin, magnoflorin, roemerin, stephararin, cycleanin, stepholidin, stepharin, palmatin, dehydrocorydalmin, stephranin [31], [32], [33], [34]

1.2.2.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài S glabra tại Việt Nam

Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững đã phân lập được 2 alcaloid từ loài S glabra là

rotundin và roemerin [30]

1.3 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG, HÀM LƯỢNG ALCALOID TOÀN PHẦN VÀ ROTUNDIN CỦA MỘT SỐ LOÀI BÌNH VÔI Ở VIỆT NAM 1.3.1 Phương pháp định lượng alcaloid toàn phần

- Phương pháp cân [16], [17]: Phải chiết được alcaloid tinh khiết bằng dung môi thích hợp, đem bốc hơi dung môi, sấy cặn tới khối lượng không đổi đem cân

- Phương pháp trung hòa [6], [16], [17]: Chiết alcaloid ở dạng base, dung dịch phải trong, không lẫn các chất kiềm, amin, chất béo, chất màu vì sẽ gây sai số thừa Phương pháp này được DĐVN III công bố trong chuyên luân dược liệu Bình vôi chỉ tiêu định lượng “Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu Thấm ẩm bằng amoinac 6N trong 2 giờ Sau cho vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform cho đến hết alcaloid cất thu hồi cloroform, hòa tan cắn trong acid clohydric 5%, (5-7 lần mỗi lần 5ml) Rửa dịch chiết bằng ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml, kiềm hóa bằng amoniac 6N đến pH 10-11 Chiết bằng cloroform 5 lần, mỗi lần 10 ml để lấy hết alcaloid Tập trung dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH trung tính Bốc hơi dịch chiết tới khô Hòa tan cắn với 1 lượng chính xác 20,0 ml dung dịch acid sulfuric 0,1 N Định lượng acid dư bằng dung dịch kali hydroxyd 0,1N với chỉ thị

đỏ methyl Hàm lượng alcaloid toàn phần được tính theo rotundin, 1ml dung dịch

acid sulfuric 0,1 N tương ứng với 0,071 g rotundin (C21H25O4N) Tỷ lệ phần trăm

alcaloid toàn phần (X %) trong mẫu được tính theo công thức sau:

V: số ml NaOH 0,1N dùng để trung hòa H2SO4 0,1N dư

M: số gam dược liệu khô tuyệt đối (đã trừ độ ẩm )

- Phương pháp so màu [16], [17]: Hầu hết các alcaloid không có màu nhưng có

màu nhưng có thể tiến hành theo nguyên tắc: (i) Dựa vào phản ứng tạo màu của

alcaloid, dung dịch có màu để định lượng; (ii) Cho alcaloid tác dụng với thuốc thử

tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan tủa trong dung môi thích hợp sẽ

được dung dịch có màu để định lượng; (iii) Biến đổi alcaloid thành một dẫn chất

có màu để tiến hành so màu

1.3.2 Hàm lượng alcaloid toàn phần trong một số loài Bình vôi

Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững [30] đã công bố hàm lượng alcaloid toàn phần từ 3

loài Bình vôi bằng phương pháp trung hòa (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần

(nghiên cứu của Nguyễn Tiến Vững)

Năm 2002, Lã Đình Mỡi [21], đã khảo sát hàm lượng alcaloid toàn phần trong 5

loài Bình vôi bằng phương pháp trung hòa (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần

(nghiên cứu của Lã Đình Mỡi)

toàn phần (%)

1.3.3 Phương pháp định lượng rotundin

Trước đây, một số tác giả đã định lượng rotundin bằng nhiều phương pháp khác nhau như: chuẩn độ thể tích bằng AgNO3, dựa vào mật độ quang, dựa vào diện tích vết sắc

ký qua phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao [23], sắc ký lỏng hiệu năng cao [8]

- Phương pháp chuẩn độ thể tích bằng AgNO3 [8] Chuyên luận nguyên liệu rotundin DĐVN IV (phương pháp này chỉ áp dụng được cho mẫu tinh khiết )

- Phương pháp đo mật độ quang gồm các bước: Xử lý mẫu Tiến hành sắc ký lớp mỏng hệ Cloroform – Methanol (9:1) đối với mẫu thử, chuẩn rotundin Xác định vết

có hệ số Rf tương ứng với rotundin chuẩn ở bước sóng 366nm, cạo vết và phản hấp phụ bằng Ethanol Xác định mật độ quang của mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng tại bước sóng 289 nm.Tính % rotundin có trong dược liệu

- Phương pháp định lượng rotundin trong viên Sen vông- R bằng phương pháp đo diện tích vết HPTCL[23] Tóm tắt các bước như sau:

Xử lý mẫu.Tiến hành sắc lớp mỏng với hệ dung môi Chloroform: Aceton: Diethylamin (10:10:2) song song với chuẩn rotundin ở nồng độ phù hợp Phun thuốc thử hiện màu Dragendoff lên bản mỏng Bản mỏng sau khi hiện màu được đưa lên máy quét ảnh để thu được hình ảnh các vết, đo diện tích (độ rộng và độ đậm) vết bằng phần mềm photoshop Lập tương quan giữa diện tích vết và logarit nồng độ mẫu bằng phần mềm excel Nồng độ mẫu thử được tính theo công thức:

(Với Cx, Co lần lượt là nồng độ của mẫu thử và mẫu chuẩn; Vx, Vo lần lượt là tích độ rộng và độ đậm của các vết)

- Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, DĐVN IV

Pha động: Dung dịch đệm pH 4,5 - acetonitril (70 : 30), điều chỉnh nếu cần Lọc

qua màng lọc có cỡ lỗ 0,45 µm, lắc siêu âm

Dung dịch chuẩn: Hoà tan rotundin chuẩn trong pha động để thu được dung dịch

có nồng độ khoảng 0,05 mg/ml

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu chuyển vào một túi giấy

lọc Thấm ẩm bằng 0,5 ml dung dịch amoniac 6 N (TT), để yên trong 30 phút Chuyển túi giấy lọc vào bình Soxhlet dung tích 100 ml, thêm 30 ml cloroform

(TT), chiết trong 4 giờ đến hết alcaloid Lấy dịch chiết cô trên cách thuỷ tới cắn,

hòa tan cắn trong dung dịch acid sulfurric 5 N (TT) (5 lần, mỗi lần 10 ml) Lọc qua giấy lọc vào bình gạn Kiềm hoá dịch lọc bằng amoniac đặc (TT) đến pH 10 Chiết bằng cloroform (TT) 4 lần, mỗi lần 10 ml Gộp các dịch chiết cloroform,

bốc hơi trên cách thuỷ đến cắn khô Dùng pha động hoà tan cắn và chuyển vào bình định mức 500 ml, thêm pha động đến vạch, lắc đều Lọc qua giấy lọc thường,

bỏ 10 ml dịch lọc đầu Phần dịch lọc còn lại tiếp tục lọc một lần nữa qua giấy lọc

có cỡ lỗ 0,45 µm được dung dịch thử

Điều kiện sắc ký:

Cột thép không gỉ (15 cm x 4 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 m)

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 283 nm

Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

Thể tích tiêm: 20 l

Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Dựa vào diện

tích (hay chiều cao) pic thu được của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và nồng độ rotundin(C21H25NO4) của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng rotundin(C21H25NO4) trong dược liệu

1.3.4 Hàm lượng rotundin trong một số loài Bình vôi

Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững [30] đã xác định hàm lượng rotundin trong 3 loài

Bình vôi nghiên cứu bằng phương pháp đo quang

Bảng 1.3 Kết quả định lượng rotundin (nghiên cứu của Nguyễn Tiến Vững)

Năm 2002, Lã Đình Mỡi [21] đã khảo sát hàm lượng rotundin trong 5 loài Bình vôi (Bảng 1.4)

Bảng 1.4 Kết quả định lượng rotundin (nghiên cứu của Lã Đình Mỡi)

rotundin (%)

HL rotundin so với alcaloid toàn phần (%)

2 S glabra (Roxb.) Miers Mai Châu, Hòa Bình 2,1 50,0

4 S kwangsiensis

H.S.Lo

Cẩm Phả, Quảng Ninh 1,8 50,5

1.4 SINH LÝ NẨY MẦM CỦA HẠT VÀ ƯU NHƯỢC ĐIỂM VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH

1.4.1 Sinh lý nẩy mầm của hạt [21]

1.4.1.1 Sự hút nước: Hút nước là quá trình ñầu tiên của sự nảy mầm, quá trình

này phụ thuộc vào 3 yếu tố: Thành phần các chất có trong hạt, khả năng thấm của

vỏ hạt, lượng nước hữu hiệu và hoạt động của enzyme ngay sau khi hút nước đã tạo ra thay đổi và quá trình trao đổi chất xảy ra

1.4.1.2 Phá vỡ các mô dự trữ: bằng các phản ứng hoá học phá vỡ các mô dự trữ

và tổng hợp vật chất mới được chứng minh bằng các pha hoạt động của enzim bao gồm tổng hợp các enzim phân giải chất dự trữ như α -amylase, ribonuleases, endo

- β gluconase và photphatase

1.4.1.3 Khởi đầu sinh trưởng của phôi: Trong thời gian đầu của sự nảy mầm có

đặc điểm là giảm khối lượng chất khô của nội nhũ và đồng thời tăng trọng lượng chất khô của trục phôi Sự thay đổi này là giảm nitơ tổng số và protein hoà tan xảy ra ở nội nhũ và sự chuyển dời hợp chất này đến trục mầm Sự thay đổi tương

tự sẽ được thực hiện theo sau là sự thuỷ phân tinh bột nội nhũ thành maltose và sau đó thành glucose

1.4.1.4 Sự xuất hiện của rễ: Khi xuất hiện rễ thật quá trình nảy mầm được hình

thành nó xuất hiện có kết quả kéo dài và phân chia tế bào Nhìn chung sự kéo dài

tế bào xảy ra trước sự phân chia tế bào Bởi vậy sự xuất hiện của rễ xuyên qua vỏ hạt khởi đầu bởi do kéo dài tế bào tiếp theo là phân chia thân ở hầu hết các hạt

1.4.1.5 Hình thành cây con: Cây con tự nó được hình thành khi bắt đầu hút nước

và quang hợp Khởi đầu trải qua một giai đoạn thay đổi trạng thái khi tự nó tạo ra một ít dinh dưỡng cho nó, nó vẫn phụ thuộc mô dinh dưỡng từ các mô dự trữ Khi cây con hoàn chỉnh và bám chắc được vào đất nó bắt đầu hút nước và tạo ra hầu hết dinh dưỡng cho nó dần dần trở lên sống tự lập và quá trình nảy mầm hoàn thành

- Các yếu tố ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt: Đã có hạt tốt rồi, khi gieo,

hạt có thể mọc được hay không lại còn tùy một số điều kiện như:

+ Đủ ôxy: Đất gieo hạt phải tơi, xốp, thoáng khí, khi gieo hạt không lấp hạt quá sâu

Hai điều kiện là ôxy (không khí) và độ ẩm quan trọng, nếu đảm bảo 2 yếu tố này thì hạt có thể nảy mầm tốt Nhưng thực tế thì hai điều kiện này lại thường mâu thuẫn với nhau nếu ẩm quá thì thiếu ôxy và nhiều ôxy quá thì lại hay thiếu độ ẩm Giải quyết mâu thuẫn này bằng cách gieo hạt ở đất có nhiều mùn, nhiều cát, đặt hạt ở độ sâu thích hợp, không quá nông, hoặc quá sâu, thường độ sâu không quá

3 - 4 lần đường kính của hạt, tưới nhẹ để có độ ẩm, phủ rác bồi lên trên mặt đất khi gieo xong

1.4.2 Ưu nhược điểm của quá trình nhân giống hữu tính [2], [3], [4], [5], [22],

[25, [26];

Ưu điểm:

- Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện

- Cây có bộ rễ phát triển mạnh, tuổi thọ thường cao hơn các phương pháp nhân giống khác

- Cây nhân giống từ hạt sinh trưởng khỏe, tính chống chịu với ngoại cảnh cao

- Hệ số nhân giống cao

- Chí phí sản xuất thấp hơn so với các phương pháp khác

Nhược điểm:

Nhiều biến dị, ví dụ như cây mẹ tốt nhưng cây con có thể xấu Những cây con

nhân giống từ một cây mẹ nhưng lại rất khác nhau, sản lượng và chất lượng không

giống nhau

Một số lưu ý trong quá trình nhân giống cây con từ hạt

- Kiểm tra sức nảy mầm của hạt trước khi gieo: Phương pháp thực hiện là tùy từng loại hạt giống khác nhau mà chúng ta có thể lấy từ vài chục hạt đến hàng trăm hạt từ các vị trí khác nhau đại diện cho lô hạt để gieo thử Nếu tỉ lệ nảy mầm dưới 50% thì cần có các biện pháp xử lý để nâng cao tỷ lệ nảy mầm của lô hạt Do biết tỉ lệ nảy mầm có thể điều chỉnh lượng hạt cần gieo

1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống hữu tính

1.4.3.1 Ảnh hưởng của chất lượng hạt giống

Hạt giống phải có chất lượng tốt thì tỉ lệ nảy mẩm sẽ cao (điều kiện cần)

1.4.3.2 Ảnh hưởng của phương pháp xử lý hạt [3], [4], [5], [6], [33]

Trong thực tế thường sử dụng 3 phương pháp xử lý sau:

- Phương pháp vật lý:

Phương pháp này thường được áp dụng phổ biến Nhiệt độ cao làm cho hạt nứt nẻ hoặc mềm ra, nước và không khí dễ thấm qua vỏ hạt, quá trình sinh lý dược xúc tiến mạnh hơn, hạt nẩy mầm nhanh, đều và diệt trừ mầm mống sâu bệnh lẫn trong hạt Có nhiều hình thức tạo nhiệt độ cao như nước nóng, đốt …Trong thực tiễn sản xuất cây giống lâm nghiệm thì phương pháp tạo nhiệt độ bằng nước nóng được áp dụng phổ biến và rất hiệu quả đối với nhiều hạt giống

Các bước thực hiện:

Bước 1: Làm sạch

+ Sơ bộ kiểm tra hạt

+ Sàng, sảy, loại bỏ các hạt kém chất lượng

+ Rửa hạt bằng nước sinh hoạt 2 -3 lần

Bước 2: Khử trùng hạt: Ngâm hạt bằng thuốc tím nồng độ 0,05% (0,5 gam thuốc

trong 1 lít nước) trong 15 - 20 phút, vớt hạt, rửa lại bằng nước sinh hoạt đến khi sạch

C trong khoảng từ 6 – 20 giờ (duy trì nhiệt độ trong thời gian ngâm hạt, thời gian phụ thuộc vào từng loại hạt), hết thời gian ngâm, rửa lại hạt, để ráo nước đem ủ

Bước 4: Ủ và rửa chua hạt

+ Cho hạt vào túi vải và ử trong tro bếp hoặc cát ẩm

+ Hàng ngày rửa chua hạt thấy hạt nứt nanh đem gieo

- Phương pháp cơ học

Phương pháp này áp dụng cho những loại hạt vỏ dày, cứng khó thẩm nước Tác động bằng cách đập, khía hạt, cắt … Sau đó ngâm hạt trong nước 2 sôi 3 lạnh Phương pháp này ít được dùng trong sản xuất vì năng suất lao động thấp, hạt dễ bị tổn thương, nhiễm bệnh hại

- Phương pháp xử lý hạt bằng hóa chất

Phương pháp dùng hóa chất với nồng độ thích hợp để ăn mòn vỏ hạt, để nước thẩm thấu vào trong dược dễ dàng Hóa chất dùng để xử lý hạt, có nhiều loại như: acid, base để ăn mòn vỏ hạt, tạo điều kiện cho khí, nước vào Các hóa chất vô cơ (ZnSO4, CuSO4, KMnO4, ), hữu cơ như (C2H5OH, CH4…), các chất kích thích sinh trưởng (Gibberillin; 2,4 D; một số Vitamin) có tác dụng tăng cường quá trình hô hấp, sinh lý hạt, tăng khả năng sinh trưởng của cây non sau này Các hóa chất thường có tác dụng nhiều mặt, song nếu dùng quá nồng độ và thời gian ngâm

sẽ độc hại, cho nên tùy theo từng loại hạt mà dùng nồng độ và thời gian ngâm khác nhau

1.4.2.3 Gieo hạt [4], [5], [6], [24]

- Để xác định thời vụ gieo hạt người ta thường căn cứ vào đặc tính sinh vật học của từng loại cây (mùa hạt chín, khả năng giữ sức nẩy mầm, điều kiện nẩy mầm, sức đề kháng của cây con), điều kiện khí hậu, đất, khả năng cất trữ hạt giống, mùa trồng, tuổi cây con đem trồng, đem cấy

- Nhìn chung đại bộ phận các loài cây đều gieo hạt vào mùa Thu hoặc mùa Xuân, tuy nhiên có một số loài cây có thể gieo vào các mùa khác nhau Ở miền Bắc thường gieo hạt vào mùa khô từ tháng 9 đến tháng 2 năm sau

- Ngoài các yếu tố thời vụ cần phải quan tâm đến một số yếu tố khác như: (i) Xác định mật độ gieo hạt; (ii) Xác định phương pháp gieo hạt (gieo hạt theo hàng, gieo hạt vào bầu…); (iii) Kỹ thuật cấy cây, ra bầu (chuẩn bị các điều kiện trước khi ra bầu, tiêu chuẩn của cây được cấy, các phương pháp cấy cây )

1.4.2.4 Chăm sóc cây con, che nắng, che mưa chống rét [5], [6]

- Tưới nước (điều kiện của nước tưới, thời gian tưới, cách tưới ….)

- Che nắng mưa, chống rét cho cây

+ Hệ thống che sáng từ phía trên: Bằng lưới che cây chuyên dụng (Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam) gồm 3 tầng lưới di động độc lập, điều khiển (kéo dãn ra hoặc dồn lại) dễ dàng bằng cơ cấu tăng đơ-puly-cáp kéo thủ công), điều chỉnh được hệ

số che ánh sáng mặt trời theo 3 cấp: không che (khi trời nhiều mây mù, mưa), che

1 lớp (khi nắng yếu hoặc nửa đầu buổi sáng, nửa cuối buổi chiều), che 2, 3 lớp (khi trời nắng mạnh)

+ Hệ thống che xung quanh: (i) Vách che gió bằng tấm nhựa composit hình sóng,

đặt trong khe của hộp vách Các tấm che được dồn lại hoặc được rút ra khỏi hộp vách dễ dàng khi không cần che chắn gió lạnh, gió bão để tăng cường ánh sáng tăng khả năng thông gió tự nhiên giảm nhiệt độ không khí trong nhà và trong môi trường khi nắng nóng; (ii) Lưới che sáng xung quanh dạng di động, được cuộn lên bằng cơ cấu thủ công để tăng cường ánh sáng trong nhà giâm hom khi thiếu sáng

1.4.2.5 Phân loại cây con

Dựa vào mức độ phát triển của cây con để phân loại là một việc làm cần thiết, nhằm mục đích kiểm kê nắm được số cây tốt xấu, phân loại riêng để có biện pháp chăm sóc phù hợp, mỗi lần phân loại làm cho hạn chế sự phát triển của bộ rễ vượt

ra khỏi túi bầu, đồng thời giúp cho cây phát triển cân đối về đường kính và chiều cao

1.4.2.7 Phòng trừ sâu, bệnh hại cây

- Một số loại sâu hại thường có: dế, sâu róm, sâu xám nhỏ…

- Một số bệnh hại: do nấm, virus, vi khuẩn gây nên, chúng phá hủy tế bào thực vật làm thối hạt, thối mầm, thối rễ, khô lá, khô thân Các cây con vườn ươm thường mắc các loại bệnh như lở cổ rễ, bệnh nấm mốc sương, bệnh rơm lá thông, bệnh nấm phấn trắng…

- Mỗi loại sâu, bệnh mắc phải đều có biện pháp xử lý nhưng quan trọng là cần theo dõi liên tục phát hiện bệnh kịp thời để có biện pháp xử lý phù hợp

Như vậy để xây dựng một quy trình nhân giống Bình vôi S glabra từ hạt cần phải

quan tâm đến rất nhiều yếu tố để đảm bảo có cây con chất lượng tốt tỷ lệ sống sót cao và khả năng sinh trưởng, phát triển tốt

1.5 HƯỚNG DẪN CỦA TỔ CHỨC Y TẾ THỂ GIỚI VỀ THỰC HÀNH TỐT TRỒNG TRỌT CÂY THUỐC

1.5.1 Nhận dạng và xác định các cây thuốc đã trồng [9], [21]

1.5.1.1 Chọn cây thuốc

Khi có thể áp dụng, các loài hoặc những chủng loại thực vật được chọn để trồng cần phải giống y như loài đã được qui định trong Dược điển quốc gia hoặc được khuyến cáo trong các tài liệu quốc gia của nước người sử dụng cuối cùng Nếu không có các tài liệu quốc gia, thì nên xem xét việc chọn loài hoặc những chủng loại thực vật đã ấn định trong Dược điển hoặc các văn kiện có thẩm quyền của những nước khác

Với các giống cây trồng có bán trên thị trường, cần nêu tên của giống cây và nhà cung cấp Nếu là giống nguyên thủy được thu thập, nhân giống, phổ biến và trồng trong một vùng nào đó, thì cần ghi vào hồ sơ ở dòng tên địa phương, bao gồm xuất xứ của cây, hạt giống gốc hoặc vật liệu nhân giống

1.5.1.3 Mẫu kiểm nghiệm

Khi một loài cây thuốc được đăng ký lần đầu tại nước sản xuất, hoặc khi có

lý do để nghi ngờ lai lịch của một loài thực vật thì cần gửi mẫu thực vật kèm các tài liệu đến một viện Dược thảo cấp quốc gia hay khu vực để nhận dạng Nếu có thể, nên so sánh kiểu di truyền với kiểu của một mẫu đã xác nhận Các tài liệu về lai lịch thực vật cần được lưu trong hồ sơ đăng ký

1.5.2 Hạt giống và các vật liệu nhân giống khác

Hạt giống và các vật liệu nhân giống khác cần được nêu cụ thể và nhà cung cấp hạt giống và các vật liệu nhân giống khác cần cung cấp tất cả các thông tin cần thiết liên quan đến lai lịch, chất lượng và tính năng của sản phẩm của họ, cũng như lịch sử phát triển sản phẩm, nếu có thể Vật liệu dùng để nhân giống hoặc trồng trọt cần có chất lượng thích hợp và càng sạch bệnh và sạch ô nhiễm càng tốt

để cây tăng trưởng mạnh khoẻ Vật liệu trồng trọt tốt hơn nên có tính đề kháng hoặc dung nạp được các nhân tố sống hoặc không có sự sống

Hạt giống và các vật liệu nhân giống khác dùng để sản xuất sản phẩm hữu cơ

cần được chứng nhận là các dẫn xuất hữu cơ Chất lượng của vật liệu nhân giống -

gồm cả mọi chất mầm biến đổi gen cần theo đúng các quy định của khu vực và/hoặc quốc gia có dán nhãn thích hợp và có lưu hồ sơ, tài liệu

Cần thận trọng trong loại bỏ các loài, loại và giống thực vật ngoại lai của cây thuốc trong toàn bộ quá trình sản xuất Phải tránh các loại vật liệu giả mạo, kém tiêu chuẩn và bị pha trộn

1.5.3 Trồng trọt

Việc trồng cây thuốc cần thâm canh và quản lý chặt chẽ Điều kiện và thời gian cần cho việc trồng trọt thay đổi tuỳ theo chất lượng của loại dược liệu cần có Nếu không có các số liệu về trồng trọt được công bố hoặc ghi trong tài liệu khoa học thì nên theo các phương pháp trồng trọt cổ truyền nếu phương pháp này khả thi Nếu không thì cần nghiên cứu phát triển phương pháp trồng trọt

Cần theo đúng các nguyên tắc canh tác tốt, bao gồm việc luân canh thích hợp các loại cây được chọn theo mức thích hợp với môi trường và việc làm đất cần thích ứng với sự tăng trưởng của cây và các yêu cầu khác

Cần theo những kỹ thuật Bảo tồn trong nông nghiệp nếu thấy thích hợp, nhất

là trong việc tích chứa các chất hữu cơ và giữ độ ẩm cho đất

1.5.3.1 Chọn địa điểm

Các cây thuốc có nguồn gốc từ cùng một loài có thể có chất lượng rất khác nhau khi trồng ở những điạ điểm khác nhau, do ảnh hưởng của đất, khí hậu và các

yếu tố khác Những khác biệt này liên quan đến ngoại dạng thực thể hoặc những biến đổi của các hợp chất mà sự sinh tổng hợp của những hợp chất này có thể bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường bên ngoài, bao gồm các biến số về sinh thái và địa lý, được nghiên cứu và xem xét

Cần tránh những nguy cơ bị ô nhiễm do đất, không khí hoặc nước bởi các hoá chất độc hại Cần đánh giá tác động của những lần sử dụng trước đây tại địa điểm canh tác, gồm cả việc trồng các loại cây trước đây và việc áp dụng những sản phẩm bảo vệ cây trồng, nếu có

1.5.3.2 Môi trường sinh thái và tác động xã hội

Việc trồng cây thuốc có thể ảnh hưởng đến sự cân bằng sinh thái và đặc biệt

là tính đa dạng di truyền của hệ thực vật và động vật trong các môi trường sống ở xung quanh Chất lượng và sự tăng trưởng của cây thuốc cũng có thể bị ảnh hưởng bởi các loại cây khác, sinh vật khác và bởi những hoạt động của con người Việc đưa vào canh tác một loại cây thuốc không thuộc bản địa có thể có tác động

có hại cho thế cân bằng sinh học và sinh thái của khu vực Cần theo dõi tác động sinh thái của các hoạt động trồng trọt theo thời gian, nếu có thể được

Tác động xã hội của việc canh tác đối với các cộng đồng địa phương cần được khảo sát để đảm bảo tránh được các tác động tiêu cực đối với việc làm ăn sinh sống tại địa phương Xét theo các cơ hội tạo thu nhập cho địa phương thì canh tác quy mô nhỏ thường tốt hơn là sản xuất quy mô lớn, nhất là khi các nông dân sản xuất quy mô nhỏ cùng tổ chức bán sản phẩm của họ Nếu việc trồng cây thuốc quy mô lớn đã và đang được xúc tiến thì cần thận trọng sao cho các cộng đồng địa phương được hưởng lợi trực tiếp, ví dụ như mức lương công bằng, cơ hội làm việc đồng đều và tái đầu tư nguồn vốn

1.5.3.3 Các điều kiện khí hậu, ví dụ như:

Độ dài của ngày, lượng mưa (cung cấp nước) và nhiệt độ trên đồng ruộng, đều ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng của cây thuốc về mặt vật lý, hoá học và sinh học Thời gian có nắng, lượng mưa trung bình, nhiệt độ trung bình, gồm cả

các khác biệt về nhiệt độ ban ngày và ban đêm, cũng ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý, sinh hoá của cây và cần xét đến những hiểu biết đã có

1.5.3.4 Thổ nhưỡng

Đất cần có những lượng thích hợp các dưỡng chất, chất hữu cơ và những yếu

tố khác để bảo đảm chất lượng và sự tăng trưởng tối ưu của cây thuốc Các điều kiện tối ưu của đất, bao gồm loại đất, hệ thống thoát nước khả năng giữ ẩm, độ phì nhiêu và độ pH phải thích hợp cho loài cây thuốc được chọn và/hoặc bộ phận thảo dược cần có

Thường không thể tránh khỏi việc dùng phân bón để cây thuốc đạt sản lượng cao Tuy nhiên, cần phải bảo đảm việc dùng phân bón đúng loại và đúng lượng, qua nghiên cứu trong nông nghiệp Thực tế là các loại phân bón hữu cơ và hoá học thường được dùng

Không được dùng phân người làm phân bón do tiềm năng hiện diện các vi sinh vật hoặc ký sinh trùng truyền nhiễm Phân súc vật (phân chuồng) cần được ủ

kỹ để đạt các tiêu chuẩn vệ sinh, an toàn với giới hạn vi khuẩn có thể chấp nhận

và diệt được khả năng nẩy mầm của cỏ dại Mọi lần sử dụng phân chuồng đều phải lưu hồ sơ, nên dùng các loại phân hoá học đã được nước canh tác và nước tiêu thụ chấp nhận

Tất cả các chất dùng để bón đều cần được áp dụng một cách tiết kiệm theo đúng nhu cầu cụ thể của loài cây thuốc và khả năng cung cấp của đất Cần dùng phân bón thế nào để tránh thất thoát đến mức tối thiểu

Các nhà trồng trọt cần theo đúng những tập quán góp phần bảo tồn đất đai,

và giảm thiểu sự xói mòn, ví dụ như bằng cách tạo những vùng đệm trên các bờ sông, suối và trồng các loài cây bao phủ mặt đất và làm “phân xanh”

1.5.3.5 Tưới nước và thoát nước

Cần kiểm tra và thực hiện việc tưới nước và thoát nước đúng theo nhu cầu của từng loài cây thuốc trong các thời kỳ tăng trưởng khác nhau của cây Nước dùng để tưới cần đúng tiêu chuẩn chất lượng của địa phương, khu vực và/hoặc

quốc gia Cần thận trọng để bảo đảm các cây đang trồng không bị thiếu nước hay úng nước

Nhìn chung, khi chọn cách tưới nước, phải xét đến tác động đối với sức khoẻ của các cách tưới nước khác nhau (như tưới trên mặt đất, dưới mặt đất hoặc tưới phun), nhất là những nguy cơ truyền bệnh do các vật chủ trung gian

1.5.3.6 Chăm sóc và bảo vệ cây

Các thực hành quản lý trên đồng ruộng cần phải tuỳ theo những đặc điểm tăng trưởng và phát triển của từng loại cây thuốc cũng như bộ phận nào của cây được định dùng để là thuốc Việc áp dụng đúng lúc các biện pháp như bấm ngọn, nhặt nụ, tỉa cành và che nắng có thể áp dụng để khống chế sự tăng trưởng và phát triển của cây, để cải thiện chất lượng và số lượng dược liệu sản xuất được

Mọi loại hoá chất nông nghiệp dùng để kích thích tăng trưởng hoặc để bảo

vệ cây thuốc cần được giữ ở mức tối thiểu, và chỉ áp dụng khi không có biện pháp nào khác Cần theo đúng phương pháp phối hợp quản lý sâu rầy, khi thích hợp Khi cần, chỉ được dùng các loại thuốc hiệu quả, theo đúng nhãn thuốc và/hoặc các hướng dẫn đặt trong bao bì của từng loại sản phẩm và các yêu cầu quy định áp dụng cho các nước đối với người trồng và người sử dụng cuối cùng Chỉ có các nhân viên có đủ khả năng sử dụng các thiết bị đã có sự phê chuẩn mới được tiến hành áp dụng thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ Tất cả các lần sử dụng đều phải lưu

hồ sơ Khoảng thời gian tối thiểu giữa những lần xử lý nói trên và kỳ thu hoạch theo đúng nhãn thuốc và/hoặc các hướng dẫn đặt trong bao bì của mỗi loại sản phẩm bảo vệ cây trồng, và việc xử lý nói trên chỉ được tiến hành sau khi có tham khảo và được sự thoả thuận của bên mua cây thuốc hay dược liệu Nhà trồng trọt

và nhà sản xuất phải theo đúng các giới hạn tối đa về lượng tồn dư thuốc trừ sâu

và thuốc diệt cỏ theo quy định của các cơ quan luật pháp cấp địa phương, khu vực và/hoặc cấp quốc gia trong các nước và hoặc khu vực của cả người trồng trọt và người sử dụng cuối cùng Các thoả ước Quốc tế như Công ước Quốc tể Bảo vệ Cây trồng và Các qui tắc về thực phẩm cũng cần được tham khảo, liên quan đến việc sử dụng thuốc trừ sâu và lượng tồn dư

1.5.4 Thu hái

Cần thu hái cây thuốc trong mùa hay khoảng thời gian tối ưu để đảm bảo sản xuất được dược liệu và thành phẩm thảo dược với mức chất lượng tốt nhất có thể được Thời điểm thu hái phụ thuộc vào bộ phận dùng của cây thuốc Có thể tìm được các thông tin chi tiết về việc ấn định thời điểm thích hợp cho thu hái, trong các Dược điển quốc gia, các tiêu chuẩn đã xuất bản, những chuyên khảo chính thức và những loại sách tham khảo chủ yếu Tuy nhiên, mọi người đều biết rằng nồng độ của các hợp chất có hoạt tính sinh học thay đổi tuỳ theo giai đoạn tăng trưởng và phát triển của cây Điều này cũng áp dụng cho các thành phần trong những loài cây bản địa độc hại hoặc có độc tính như không có mục đích sử dụng Thời điểm tốt nhất cho thu hoạch (mùa vụ/thời điểm trong ngày đạt đỉnh chất lượng) cần được xác địnhtheo chất lượng và khối lượng các hợp chất có tính sinh học hơn là tổng sản lượng thực vật của các bộ phận cây thuốc được nhắm đến Trong khi thu hái phải cẩn thận để bảo đảm không có tạp chất, cỏ dại hoặc những loại cây có độc xen lẫn vào các dược liệu đã thu hoạch

Nên thu hái cây thuốc trong những điều kiện tốt nhất có thể được, tránh sương, mưa hoặc ẩm quá cao Nếu thu hoạch trong điều kiện ẩm ướt, thì dược liệu

đã thu hoạch cần được vận chuyển ngay đến một cơ sở sấy khô trong nhà để tiến hành sấy khô nhằm ngăn ngừa các ảnh hưởng có hại do độ ẩm tăng cao, tạo điều kiện cho sự lên men của vi sinh vật và nấm mốc phát triển

Các thiết bị thu hoạch và các loại máy khác cần được giữ sạch và điều chỉnh

để giảm sự thiệt hại và ô nhiễm do đất và các loại vật liệu khác Cần giữ các máy móc, thiết bị này ở nơi không bị ô nhiễm và khô ráo, hoặc ở cơ sở không có côn trùng, loài gặm nhấm, chim và các loài gây hại khác, và tránh tiếp xúc với thú nuôi và loài gia súc

Càng tránh chạm đất càng tốt để giảm tối thiểu lượng vi khuẩn trong các dược liệu đã thu hái Khi cần, có thể dùng các tấm trải rộng bằng vải, tốt hơn là vải muslin sạch để lót giữa cây thuốc đã thu hoạch và đất Nếu có dùng các bộ phận dưới mặt đất (như rễ), thì phải loại bỏ mọi đất cát bám vào dược liệu ngay khi thu hoạch Dược liệu đã thu hái phải được vận chuyển ngay trong điều kiện sạch và khô Có thể đặt dược liệu trong các giỏ sạch, bao khô, xe moóc, phễu cấp

liệu hoặc các đồ đựng thông thoáng khác và đưa đến một điểm tập trung để dễ vận chuyển đến cơ sở chế biến

Mọi đồ đựng dùng trong thu hoạch phải được giữ sạch, không bị ô nhiễm bởi các cây thuốc khác đã thu hoạch trước và những tạp chất Nếu có dùng đồ đựng bằng nhựa thì phải đặc biệt chú ý không để hơi ẩm tồn đọng vì có thể khiến cho nấm mốc phát triển Khi không sử dụng, phải giữ các đồ đựng này trong điều kiện khô, ở nơi được bảo vệ khỏi ảnh hưởng của các loại côn trùng, loài gặm nhấm, chim và các loài gây hại khác, cũng như thú nuôi và gia súc

Nên tránh mọi sự hư hại cơ học hoặc nén chặt dược liệu, ví dụ như do hậu quả của việc chồng chất hoặc dồn quá đầy vào các túi hay bao, có thể khiến cho dược liệu bị ủ ẩm hoặc giảm sút chất lượng theo cách khác Các loại dược liệu bị phân huỷ cần phải được đánh dấu và loại bỏ trong khi thu hoạch, kiểm tra sau thu hoạch và chế biến, để tránh ô nhiễm vi khuẩn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

1.5.5 Nhân sự

Các nhà trồng trọt và cơ sở sản xuất cần phải có đủ hiểu biết về loại cây thuốc họ đang trồng hay chế biến Điều này cần bao gồm phần nhận dạng thực vật, các đặc tính trong canh tác và yêu cầu về môi trường (loại đất, độ pH và độ phì của đất, khoảng cách cây trồng và yêu cầu về ánh sáng), cũng như các phương tiện thu hoạch và tồn trữ

Toàn bộ nhân sự (gồm cả công nhân trên đồng ruộng) tham gia các công đoạn nhân giống, canh tác, thu hoạch và chế biến sau thu hoạch trong công tác sản xuất cây thuốc, cần giữ vệ sinh cá nhân đúng mức và được tập huấn về trách nhiệm vệ sinh của họ

Chỉ có những nhân viên được huấn luyện thích hợp, đeo các trang phục thích hợp (như áo khoác ngoài, bao tay, nón bảo hộ, kính bảo hộ, mặt nạ) mới được sử dụng các loại hoá chất nông nghiệp

Nhà trồng trọt và cơ sở sản xuất phải được hướng dẫn về tất cả vấn đề liên quan đến bảo vệ môi trường, bảo tồn các loài thảo dược và việc quản lý hàng nông nghiệp một cách thích hợp

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Hạt để thí nghiệm xác định mức độ ảnh hưởng của một số điều kiện tới nhân

giống hữu tính: Quả thu được từ quả loài S glabra được sát hạt làm sạch vỏ, quả

thu hái tại vườn giống gốc của đề tài “Khai thác phát triển nguồn gen một số

loài Bình vôi (Stephania spp.) tạo nguyên liệu làm thuốc” công ty cổ phần dược

TW Mediplantex chủ trì Vườn giống gốc được tạo ra từ các cây Bình vôi đã được

xác định tên khoa học là S glabra mã số tiêu bản: HNIP/17794/11 lưu tại trường

đại học Dược Hà Nội, được trồng và chăm sóc theo quy trình

- Củ 1, 2, 3, 4 tuổi loài S glabra để nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng alcaloid

toàn phần và rotundin theo năm tuổi thu được từ vườn trồng Lần 1 củ có từ 1, 2, 3 năm tuổi thời gian trồng cụ thể cây 1 tuổi (trồng từ 3.2012 đến 3.3013), 2 tuổi (trồng từ 3.2011 đến 3.2013), 3 tuổi (trồng từ 3.2010 đến 3.2013) Lần 2 củ của cây có từ 2, 3, 4 năm tuổi thời gian trồng cụ thể 2 tuổi (trồng từ 3.2012 đến 3.3014), 3 tuổi (trồng từ 3.2011 đến 3.2014), 4 tuổi (trồng từ 3.2010 đến 3.2014)

- Củ của cây trưởng thành (cây 4 tuổi) để nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin theo các mùa trong năm được trồng tại vườn có thời gian trồng từ ngày tháng 3.2010

- Nơi thực hiện:

+ Vườn giống Xã Nghĩa Phương, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang

+ Bộ môn Thực vật Trường Đại Học Dược Hà Nội

+ Phòng Kiểm tra chất lượng đạt GLP, Công ty CP Dược TW Mediplantex

2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Nghiên cứu nhân giống hữu tính Bình vôi S glabra

- Tủ lạnh, chum sành, cát đã khử trùng, túi bầu đựng thành phần dinh dưỡng cho

cây con, đất mùn, phân chuồng đã ủ đạt tiêu chuẩn, giá thể, tấm lưới che nắng đạt

tiêu chuẩn, nhà huấn luyện cây con có thiết kế che bóng, hệ thống tưới đạt tiêu

chuẩn, cọc có độ cao khác nhau, Máy đo cường độ ánh sáng Light meter LX 107

2.1.2.2 Nghiên cứu sự thay đổi alcaloid theo tuổi và theo mùa trong năm

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimazu, Detector DAD

- Cột sắc ký C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) và C18 (150 x 2,1 mm; 3µm)

- Máy siêu âm Ultrasonic

- Cân phân tích Metler Toledo 5 số

- Dụng cụ thủy tinh: Bộ chiết Soxhlet, buret 10 ± 0,02ml,bình gạn 250 ml và các dụng cụ thủy tinh chính xác cấp độ A (bình định mức, pipet ….)

- Bể cách thủy điều nhiệt

2.1.3 Hóa chất và thuốc thử, chất chuẩn

- Hóa chất: Methanol, acetonitril, acid acetic, nước vôi trong, cloroform,

amoniac… đạt tiêu chuẩn DĐVN IV [8]

- Thuốc thử: Acid sulfuric chuẩn độ 0,1N, dung dịch chuẩn NaOH 0,1 N, đỏ

methyl, amoniac 6 N, pha theo hướng dẫn của DĐVN IV [8]

- Mẫu chuẩn: Chuẩn rotundin của viện kiểm nghiệm thuốc trung ương cung cấp:

số lô: 0102141; hàm lượng khan: 99,4%; độ ẩm: 4,6%

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu nhân giống hữu tính Bình vôi S glabra

2.2.1.1 Lựa chọn thời điểm thu hái quả và hạt đạt tiêu chuẩn [3], [4],

- Khảo sát để xác định thời điểm quả chín, thời điểm quả cho chất lượng hạt tốt nhất (tính từ ngày quả bắt đầu chuyển từ màu xanh sang vàng và đỏ)

- Thu hái và xác định khối lượng tương đối của quả

- Lấy hạt và xác định khối lượng hạt

2.2.1.2 Lựa chọn điều kiện bảo quản hạt và xác định thời hạn bảo quản hạt

[4], [5], [12], [13]

- Các điều kiện bảo quản được nghiên cứu

+ Cách 1: Hạt lấy về được bảo quản trong tủ lạnh thông thường nhiệt độ từ 2-8oC

+ Cách 2: Hạt lấy về được bảo quản trong chum vại và đậy nắp kín ở nhiệt độ phòng

+ Cách 3: Hạt lấy về được bảo quản trong cát ẩm theo tỷ lệ 1 phần hạt/3 phần cát ẩm

- Phương pháp bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu

+ Sử dụng phương pháp chia làm 3 lô hạt (mỗi lô 50 hạt đạt tiêu chuẩn) để bảo quản Xác định thời gian bảo quản các công thức trên tại thời điểm sau 0, 3, 6 tháng

+ Hạt được xử lý ở cùng điều kiện sau đó đem gieo để theo dõi tỷ lệ nảy mầm để

xác định cách bảo quản hạt tốt nhất và thời gian bảo quản bao lâu thì thích hợp

2.2.1.3 Lựa chọn phương pháp xử lý hạt giống [3], [4], [5], [12], [13], [22]

- Bố trí thí nghiệm theo các công thức:

+ Công thức 1: Ngâm hạt trong nước acid acetic loãng 2% trong 8 giờ, sau đó ủ

hạt trong túi vải ẩm 8 giờ, rửa hạt 3 lần bằng nước sạch, gieo hạt vào trong các giá thể để theo dõi điều kiện nẩy mầm

+ Công thức 2: Ngâm hạt trong nước khoảng 45 - 50oC (2 sôi 3 lạnh) trong 20 giờ,

sau đó ủ hạt trong túi vải ẩm 8 giờ, rửa hạt 3 lần bằng nước sạch, gieo hạt vào trong các giá thể để theo dõi điều kiện nẩy mầm

+ Công thức 3: Ngâm hạt trong nước vôi loãng 2% trong 8 giờ, sau đó ủ hạt trong

túi vải ẩm 8 giờ, rửa hạt 3 lần bằng nước sạch, gieo hạt vào trong các giá thể để theo dõi điều kiện nẩy mầm

- Bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu:

+ Mỗi công thức thí nghiệm cần xử lý 50 hạt và lặp lại 3 lần

+ Sau khi xử lý hạt gieo cần theo dõi hàng ngày, ghi chép lại ngày hạt bắt đầu nảy mầm, ngày kết thúc nảy mầm, mỗi ngày nảy mầm được bao nhiêu hạt của từng công thức

2.2.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng của bầu đến sinh trưởng và phát triển của cây con [3], [4], [5], [12], [13]

- Công thức dinh dưỡng được nghiên cứu

+ Công thức 1: 90% thành phần ruột bầu là đất mùn tơi xốp + 10% phân chuồng

đã ủ theo tiêu chuẩn

+ Công thức 2: 90% thành phần ruột bầu là đất mùn tơi xốp + 9% phân chuồng

đã ủ theo tiêu chuẩn + 1% phân lân

+ Công thức 3: 90% thành phần ruột bầu là đất mùn tơi xốp + 8% phân chuồng

đã ủ theo tiêu chuẩn + 2% phân lân

- Bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu

+ Mỗi công thức thực hiện 3 lô (mỗi lô 30 bầu), lặp lại 3 lần

+ Theo dõi khả năng phát triển của cây con sau hàng tháng (0, 1, 2, 3, 4, 5) cụ thể

là chiều dài của củ và chu vi củ (chỗ lớn nhất)

Lưu ý: Bố trí các công thức này cùng đặt trong một luống có cùng điều kiện về ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để có kết quả chính xác nhất

2.2.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của giàn che tới sinh trưởng cây con trong giai đoạn huấn luyện [12], [13], [22]

- Tiến hành 4 mức độ che bóng x 3 lô x 30 bầu

+ Mức độ 1: Che bóng 0% (cây con không được che bóng)

Bảng 2.5: Thiết kế nghiên cứu về mức độ che bóng

Công thức

Che lưới Độ lưới so với cao

mặt đất (mét)

Cường độ ánh sáng đo được