Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng rutin trong phát triển của hoa hòe và nụ hoa hòe chế biến theo y học cổ truyền bằng phương pháp HPTLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TỐNG XUÂN QUANG NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG PHÁT TRIỂN CỦA HOA HOÈ VÀ NỤ HOA HOÈ CHẾ BIẾN THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPT

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TỐNG XUÂN QUANG

NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI

HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG PHÁT TRIỂN CỦA HOA HOÈ VÀ NỤ HOA HOÈ CHẾ BIẾN THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

HPTLC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ KHOÁ 65

HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TỐNG XUÂN QUANG

NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI

HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG PHÁT TRIỂN CỦA HOA HOÈ VÀ NỤ HOA HOÈ CHẾ BIẾN THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

HPTLC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS Nguyễn Quốc Huy và PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển, người thầy đã trực tiếp

hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới:

Khoa Kiểm nghiệm Đông dược của viện Kiểm nghiệm Trung ương đã hỗ trợ và

cung cấp nguyên liệu tôi trong quá trình làm

DS Nguyễn Thị Thuỳ Linh đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi rất nhiều kinh nghiệm

trong quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn

Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật và bộ môn Dược học cổ truyền

đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận

Bạn Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, bạn Lương Thị Lan – M1K65, Quách Thị Thuý Nga – M2K65, đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên

cứu khoa học tại bộ môn

Và tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học qua, cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Tống Xuân Quang

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang ĐẶT VẤN ĐỀ……….……… … 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN….……… … 3

1.1 HOÈ…… ………… ……… 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố.……….…… 3

1.1.2 Thành phần hoá học…….……….… 4

1.1.3 Tác dụng sinh học , chế biến và công dụng ……….……….…… 5

1.1.3.1 Tác dụng sinh học……….…… 5

1.1.3.2 Chế biến theo YHCT và công dụng ……… 6

1.2 TỔNG QUAN VỀ RUTIN……….……… 7

1.2.1 Tính chất vật lý rutin ……….…… 7

1.2.2 Định tính rutin ……….…… 8

1.2.3 Định lượng rutin……….……… 9

1.2.4 Một số nghiên cứu về rutin ….……… 11

1.3 SẮC KÝ LƠP MỎNG HIỆU NĂNG CAO ….……… 11

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng ……… …… ……… 11

1.3.1.1 Nguyên tắc……… … 11

1.3.1.2 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng……….………… 13

1.3.2 Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao-HPTLC… 15 1.3.3 Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu……… 16

1.3.2.1 Định tính ……… 16

1.3.2.2 Bán định lượng ……… … 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 20

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ……….….… 20

2.1.1 Nguyên liệu ……… ……… …… 20

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ……… 23

2.1.2.1 Máy móc và dụng cụ thí nghiệm……… … 23

2.1.2.2 Hóa chất……….……… 23

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 24

2.2.1 Nội dung nghiên cứu ……….……… 24

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu……… …… 24

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng……… 24

2.2.2.2 Định lượng hàm lượng Rutin trong quá trình phát triển hoa và trong các mẫu chế biến theo YHCT………

29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 30

3.1 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM……….……… 30

3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC ……… 30

3.1.1.1 Xử lý mẫu thử ……….…… 30

3.1.1.2 Lựa chọn dãy nồng độ chuẩn ……… 32

3.1.1.2 Lựa chọn độ pha loãng thích hợp ……… 34

3.1.1.3 Thẩm định phương pháp ……… 35

3.1.2 Định lượng hàm lượng hoạt chất rutin trong phát triên hoa hoè và sau khi chế biến theo YHCT ………

39 3.1.3 Đánh giá hàm lượng rutin trong chế biến nụ hoa hoè theo YHCT………… 40

3.1.3.1 Kết quả so sánh hàm lượng rutin trong phát triển của hoa hoa hoè …… 41

3.1.3.2 Kết quả so sánh hàm lượng rutin trước và sau khi chế biến theo YHCT 41

3.2 BÀN LUẬN ……… 42

3.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng ….……… 42

3.2.2 Sự thay đổi hàm lượng rutin của hoa hoè trong phát triển hoa hoè và trong chế biến theo YHCT ……….………

43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……… 46

KẾT LUẬN ……… ……… 46

KIẾN NGHỊ ……… 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

NMR Nuclear magnetic resonance

Rf Retention factor (Hệ số lưu)

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các nguồn có chứa rutin khác ……… 12

Bảng 1.2 Một số chất làm pha tĩnh cho TLC ……… 13

Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong nghiên cứu dược liệu ……… 15

Bảng 2.1 Các mẫu nghiên cứu ……… 21

Bảng 2.2 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml) ……… 25

Bảng 3.1 Độ pha loãng của các mẫu ……… 35

Bảng 3.2 Nồng độ rutin chuẩn và diện tích pic đáp ứng ……… 36

Bảng 3.3 Giá trị Rf và diện tích pic của các vết ……… 37

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng ……… 38

Bảng 3.5 Hàm lượng rutin tích luỹ trong quá trình phát triển hoa và sau khi chế biến theo YHCT ……… 39

Bảng 3.6 So sánh hàm lượng rutin giữa các mẫu với nụ non ……… 41

Bảng 3.7 So sánh hàm lượng rutin trước và sau khi chế biến theo YHCT …… 42

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Cây hoè và hoa hoè ……… 3

Hình 1.2 Các thành phần hoá học có trong nụ hoa ……… 4

Hình 1.3 Cấu trúc hoá học của Rutin và Quercetin ……… … 7

Hình 2.1 Cây hoè tại vườn ……… 20

Hình 2.2 Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC ……… 23

Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn và thử tại 3 hệ dung môi soi tại ánh sáng trắng và bước sóng 254nm ……… 30

Hình 3.2 Pic sắc ký chuẩn rutin tại hệ dung môi 3 ……….… 31

Hình 3.3 Pic sắc ký chuẩn rutin tại hệ dung môi 2 ……… 31

Hình 3.4 Đường chuẩn của dãy chuẩn 1 ……….……… 32

Hình 3.5 Đường chuẩn của dãy chuẩn 2 ……….……… 32

Hình 3.6 Đường chuẩn của dãy chuẩn 3 ……… ………… 32

Hình 3.7 Đồ thị đường chuẩn rutin theo chiều cao pic ……… …… 33

Hình 3.8 Đồ thị đường chuẩn rutin theo diện tích pic ……….… 34

Hình 3.9 Sắc ký đồ tại bước sóng 254nm ……… 35

Hình 3.10 Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng ……… 36

Hình 3.11 Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic ……… 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước có hệ thực vật phong phú, trong đó có khoảng 4000 loài thực vật có thể làm thuốc trong các nền y học dân gian, 800 loài thường được dùng trong y học cổ truyền (YHCT) chính thống và 300 loài dùng trong công nghiệp dược [38] Như vậy có thể thấy tiềm năng về cây thuốc ở Việt Nam còn rất lớn Tìm chất mới cũng như nâng cao giá trị các dược liệu đã có là việc làm cần thiết phát triển nền YHCT Việt Nam

Hoè (Styphnolobium japonicum (L.) Schott.) là vị thuốc YHCT rất phổ biến

tại Việt Nam nhất là một số tỉnh duyên hải Bắc bộ như Thái Bình, Nam Định, hoè được trồng làm cảnh, làm thuốc chữa bệnh… Từ xa xưa nụ hoa hoè đã được sử dụng làm thuốc và chế biến nhiều cách như sao vàng, sao cháy hay thán sao để sử dụng trong các bài thuốc Rutin là một flavonoid có nhiều trong các loài thực vật Trong Công nghiệp Dược, rutin được chiết xuất từ các phần của cụm bông hoa hoè cho hiệu suất cao, là nguồn nguyên liệu, vị thuốc được sử dụng nhiều trong đời sống và y học do đó hoa hoè được chuẩn hoá về dược liệu và hàm lượng rutin trong dược liệu trong Dược Điển Việt Nam và trong 1 số dược điển nước khác như Trung Quốc, Nhật Bản [3]

Hoa hòe được sử dụng trong YHCT và chiết rutin cho công nghiệp dược Thực tế hiện nay, người dân thu hái tự phát chưa theo quy trình chuẩn về thời điểm thu hái và tiêu chuẩn của nụ hòe để có nguồn nguyên liệu chất lượng trong YHCT thì nụ hoè có thể vi sao, sao vàng hay là thán sao (sao đen) [5], [7.] Với mỗi dạng chế biến có nhưng công dụng chỉ định, cách dùng trong các bài thuốc trong YHCT khác nhau như hạ huyết áp cho người cao huyết áp, thanh nhiệt, cầm máu, chỉ huyết Toàn bộ quá trình này chưa có những đánh giá chuẩn hóa từ thu hái đến chế biến cũng như đánh giá hàm lượng rutin trong nụ hòe DĐVN [3] đã hướng dẫn sử dụng phương pháp đo quang để định lượng rutin [3] Nhưng đo quang thì có nhiều bất lợi với phân tích dược liệu do dịch chiết tổng chứa nhiều chất gây tạp Nếu sử dụng phương pháp HPLC cho đánh giá thì chi phí cao hơn nhiều Hiện nay HPTLC

là phương pháp, đã và đang được sử dụng trong phân tích dược liệu và đánh giá

nhanh hàm lượng các chất hiện Do đó, đề tài “Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng Rutin trong sự phát triển của hoa hòe và nụ hoa hòe chế biến theo YHCT bằng phương pháp HPTLC” với mục tiêu sau :

1 Xây dựng phương pháp bán định lượng hoạt chất rutin trong hoa hoè bằng phương pháp HPTLC

2 Đánh giá sự tích luỹ hàm lượng hoạt chất rutin trong một số mẫu hoa hoè trong quá trình phát triển và nụ sau khi chế biến theo YHCT

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 HOÈ

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố [5], [8], [10], [19]

- Hoè - Styphnolobium japonicum (L.) Schott hay có tên khoa học khác là

Sophora japonica L Schott , chi Styphnolobium, tông Sophoreae, họ Đậu

(Fabaceae), phân bộ Đậu (Fabales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan

(Magnoliophyta) [16]

- Hoè hay còn được gọi là hoè hoa, Lài Luồng (Tày) Tại một số quốc gia khác có tên là Hòe Thực (Bản Kinh), Hòe Nhụy (Bản Thảo Đồ Kinh), Hòe nhụy (Bản Thảo Chính), Thái dụng (Nhật Hoa Tử Bản Thảo), Hòe mễ, Hòe hoa mễ, Hoà trần mễ (Hòa Hán Dược Khảo), Hòe hoa thán, Hòe mễ thán, Hòe nga, Hòe giao, Hòe nhĩ,

Hòe giáp (Trung Quốc Dược Học Đại Từ Điển) [2], [16],[29]

- Hoè là một cây gỗ, to, cao 5-15m, thân thẳng, có chỏm lá tròn lá kép lông chim

lẻ, mọc so le, mỗi lá có từ 9-13 lá chét, lá chét hình trứng, đỉnh nhọn, nguyên dài

3-4 cm, rộng 1.5 -2.5 cm [19] Hoa mọc thành cụm, hình chuỳ ở đầu cành; tràng hoa hình bướm màu trắng ngà Nụ hoa hình trứng có cuống nhỏ, ngắn, một đầu hơi nhọn, dài 3 - 6 mm, rộng 1 - 2 mm, màu vàng xám Đài hoa hình chuông, màu vàng xám, dài bằng 1/2 đến 2/3 chiều dài của nụ hoa, phía trên xẻ thành 5 răng nông Hoa

chưa nở dài từ 4 - 10 mm, đường kính 2 - 4 mm Cánh hoa chưa nở màu vàng

Hình 1.1 Cây hoè và hoa hoè

- Quả loại đậu, không mở, vỏ dày, có thắt nhỏ lại ở giữa các hạt Quả dài 5-8cm, khi khô có màu nâu đen, chứa 4-6 hạt hình bầu dục, hơi dẹp, đen bóng [16]

- Mùa ra hoa khoảng từ tháng 6-11 hàng năm, Hoè được nhân giống bằng cách giâm cành, thường sau khi trồng từ 3-4 năm mới ra hoa và cây từ 6-7 tuổi trở đi cho hoa nhiều và sản lượng cao [5]

- Loài S japonicum (L.) Schott phân bố nhiều ở Việt Nam, Trung Quốc, Nhật

Bản, Triều Tiên [27] được trồng dùng làm thuốc hay làm cảnh, lấy bóng râm Tại Việt Nam, Hoè được trồng nhiều tại các tỉnh như Thái Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Nam Định, Nghệ An Những năm gần đây còn được trồng ở các tỉnh khác như Tây Nguyên, một số tỉnh miền Trung [2], [29]

Rutin

Sophoradiol Betuin

- Ngoài ra trong Hoa hoè còn có các hoạt chất khác như Bentulin, Lupan, Sophoradiol, Sophorin A, Sophorin B và Sophorin C Và một số alcaloid như Oxymatrine , cytisin, N-methyl cytisin, sophocarmin, matrin [19] Trong đó, Betulin

là một dẫn chất triterpenoid thuộc nhóm Lupan, Sophoradiol là dẫn chất thuộc nhóm olean [8], [5], [19]

1.1.2.2 Quả

Trong hạt hoè có chưa các alcaloid như cytisin, N-methyl cytisin, sophocarmin, matrin các flavonoid như rutin, sophorine Ngoài ra còn chứa các Polysaccharides như galactomannans, các dầu béo, protein và khoáng chất Trong

vỏ quả hoè có nhóm flavonoid chiếm 10.5%, chủ yếu là các chất chuyển hoá như genistein, sophoricoside (hay genistein-4'-glucoside), sophorabioside (phần biose gồm glucose và rhamnose), Kaempferol, Rutin ; Sophorose [5], [19]

1.1.3 Tác dụng sinh học, chế biến và công dụng

1.1.3.1 Tác dụng sinh học [16],[19]

Rutin là 1 loại vitamin P, có tác dụng tăng cường sức chịu đựng của mao mạch Chữa P là chữ đầu của chữ peméabilité có nghĩa là thấm một số chất khác cũng có tính chất vitamin P như esculozit, hesperidin (trong vỏ cam), v v…[9]

 Rutin có tác dụng chủ yếu là bảo vệ sức chịu đựng bình thường của mao mạch Thiếu vitamin này tính chất chịu đựng của mao mạch có thể bị giảm, mao mạch dễ đứt vỡ, hiện tượng này trước đây người ta chỉ cho rằng cơ thể thiếu Vitamin C mà

có , gần đây mới phát hiện sự liên quan đến Vitamin P [19]

 Rutin thường dùng cho bệnh nhân cao huyết áp mà mao mạch dễ vỡ đứt, để đề phòng đứt mạch máu ở não, xuất huyết cấp tính di viêm thận, xuất huyết cấp tính do

viêm thận, xuất huyết ở phổi mà không rõ nguyên nhân, còn có tác dụng đối với bệnh cao huyết áp

- Theo Parrot thì cơ chế, tác dụng của vitamin P như sau : vitamin P làm giảm sự phân huỷ adrenalin trong cơ thể, gần đây có nghiên cứu chỉ ra rằng adrenalin có tác dụng tăng sức chịu đựng của mao mạch vì thế mà vitamin P có tác dụng tăng sức chịu đựng của mao mạch và tăng cường [19]

- Theo Hoàng Chiêu Đức (Trung nam y học tạp chí, 1952) [19] :

 Nước sắc hoa hoè loại bỏ rutin đi rồi vẫn có thể làm giảm huyết áp của chó gây

mê

 Có tác dụng hưng phấn nhẹ đối với tim cô lập của ếch

 Có tác dụng kích thích sự bài tiết của niêm mạc ruột

- Có nghiên cứu khác trên tử cung có thai và không có thai đều thấy có tác dụng kích thích và đối với chó gây mê có tác dụng lợi tiểu tạm thời [19]

1.1.3.2 Chế biến theo YHCT và công dụng [5], [10], [16], [19]

- Chế biến theo YHCT [23] :

 Khi trời khô ráo (thường vào buổi sáng), ngắt các chùm hoa chưa nở, tuốt lấy nụ, loại bỏ các bộ phận khác của cây, phơi nắng hoặc sấy nhẹ cho đến khô

 Hoa hoè chủ yếu sử dụng nụ hoa để chế biến, ngoài ra quả được sử dụng

 Các dạng chế biến của nụ hoa hoè gồm sao vàng, sao đen

 Quả có tính chất gần như hoa nhưng có thể gây xảy thai, dùng để chữa xích bạch

lỵ, trĩ ra máu, thổ huyết máu cam, phụ nữ băng huyết

 Hiện nay, nhân dân dùng hoa hoè làm thuốc cầm máu, dùng trong cách bệnh ho ra máu, đổ máu cam, tiểu tiện ra huyết ruột chảy máu

1.2 TỔNG QUAN VỀ RUTIN

Flavonoid là một nhóm chất lớn có mặt ở trong hầu hết các loài thực vật hiện nay Theo các nghiên cứu hiện nay, các Flavonoid có rất nhiều tác dụng và có nhiều hoạt chất có cấu trúc tính chất gần giống với các vitamin cần thiết cho cơ thể

Flavonoid chia làm 4 nhóm là Eucoflavonoid, Isoflavonoid, Neoflavonoid, Triflavonoid Trong đó nhóm Eucoflavonoid có các nhóm như flavon, flavonol, flavanol, chalon [5] Rutin là một chất thuộc nhóm Eucoflavonoid trong nhóm flavon và flavonol

1.2.1 Tính chất vật lý của rutin

 Rutin có tên IUPAC : 2 - ( 3,4-dihydroxyphenyl ) - 5,7 – dihydroxy – 3 - {[( 2S,3R,4S,5S,6R ) - 3,4,5 – trihydroxy – 6 - ({[( 2R,3R,4R,5R,6S ) - 3,4,5 –trihydroxy – 6 – methyloxan – 2-yl] oxy} methyl) oxan - 2-yl] oxy} - 4H- chromen – 4 – one hay có tên khác là : 3.3’,4’,5,7-pentahydroxyflavon 3-Rutinosid

 Rutin là một glucosid chiết được từ nụ hoa cây Hòe (S japonicum L), họ Đậu (Fabaceae), hoặc từ nhiều cây khác thuộc các họ thực vật khác nhau Rutin là một

chất thuộc nhóm Flavon, có phần aglyol là Quercetin thuộc nhóm Flavonol [3],[5], [35]

 Tan trong methanol và trong các dung dịch hydroxyd kiềm, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong nước và dichloromethan

 Phổ của rutin có λmax ở 362,5 và 258 nm, ở λ = 362.5 thì có E(1%, 1cm) = 325 (ethanol) [5]

1.2.2 Định tính rutin

Theo dược điển Việt Nam IV, các phương pháp dùng để định tính rutin :

- Phương pháp A: So sánh phổ hồng ngoại với phổ chuẩn [3]

Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của rutin chuẩn (Đối chiếu)

- Phương pháp B : Đo quang [3]

Hòa tan 50.0 mg chế phẩm trong methanol và pha loãng thành 250.0 ml với cùng dung môi, lọc nếu cần Pha loãng 5,0 ml dung dịch này thành 50.0 ml bằng methanol Đo phổ hấp thụ tử ngoại trong khoảng từ 210 nm đến 450 nm, dung dịch phải cho hai cực đại hấp thụ ở 257 nm và 358 nm Độ hấp thụ riêng ở bước sóng cực đại 358 nm phải từ 305 đến 330 tính theo chế phẩm khan

- Phương pháp C: Phương pháp sắc ký lớp mỏng [3]

 Bản mỏng: Silica gel GF254

 Dung môi khai triển: N-butanol - acid acetic khan - nước - methyl ethyl ceton -

ethyl acetat (5 : 10 : 10 : 30 : 50)

 Dung dịch thử: Hòa tan 25 mg chế phẩm trong methanol và pha loãng thành 10.0

ml với cùng dung môi

 Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 25 mg Rutin chuẩn (Đối chiếu) trong methanol và

pha loãng thành 10.0 ml với cùng dung môi

 Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên Triển

khai sắc ký đến khi dung môi đi được 10 cm Để khô bản mỏng ngoài không khí Phun lên bản mỏng hỗn hợp gồm 7.5 ml dung dịch kali fericyanid 1% (Thuốc thử)

và 2.5 ml dung dịch sắt (III) clorid 10.5% (Thuốc thử) Quan sát bản mỏng trong vòng 10 phút Vết chính trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử tương ứng về vị

trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu

- Phương pháp D: [3]

Hòa tan 10 mg chế phẩm trong 5 ml ethanol 96% (Thuốc thử) Thêm 1 g kẽm (Thuốc thử) và 2 ml dung dịch acid hydrocloric 25% (Thuốc thử), sẽ xuất hiện màu

đỏ

- Phương pháp E : Phản ứng với hơi amoniac [3]

Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3 Có thể quan sát sự biến đổi màu này bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại

- Phương pháp F : Phản ứng cyanidin [3]

 Phản ứng do sự có mặt nhân γ-penzopyron trong đa số flavonoid Thuốc thử là HCl đặc và bột Magie kim loại

 Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H2SO4 đậm đặc

 Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H2SO4 đậm đặc, sau đó cho thêm 0.1 gam Magie, tiếp theo thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm Đun nóng, có màu hồng từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc đỏ tím

- Phương pháp G : Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5% [3]

Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc

sẽ xuất hiện màu xanh đen

1.2.3 Định lượng rutin

Có nhiều phương pháp để định lượng:

- Đo bằng quang phổ kế : Nguyên tắc dựa vào phổ của rutin có λmax ở 362.5 và

258 nm, ở λ = 362.5 thì có E(1%, 1cm) = 325 (ethanol), Đo quang phổ kế để tính

nồng độ dựa trên E (1%, 1cm) [5]

- Đo màu : Nguyên tắc dựa vào màu của rutin khi tác dụng với AlCl3 hoặc tiến

hành phản ứng Cyanidin rồi đo màu [5]

- Phương pháp cân : nguyên tắc của phương pháp là chiết xuất rutin bằng cồn

nóng, sau đó thuỷ phân bằng dung dịch acid sufuric, quercetin ít tan được lọc và cân

rồi tính ra rutin

- Theo Dược điển Việt Nam IV quy định [3] :

 Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0.2 g rutin chuẩn đã sấy khô (trong chân không) tới khối lượng không đổi, cho vào một bình định mức 100 ml Hoà tan trong

70 ml methanol (Thuốc thử) bằng cách làm ấm trên cách thuỷ Để nguội, thêm methanol (Thuốc thử) đủ 100 ml, lắc kỹ Lấy chính xác 10 ml dung dịch này cho vào một bình định mức 100 ml khác Thêm nước tới vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa 0.2

mg Rutin khan)

 Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy chính xác 1.0 – 2.0 - 3.0 – 4.0 – 5.0 và 6,0 ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm nước cho tới 6 ml ở mỗi bình rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5% (Thuốc thử), trộn kỹ Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch nhôm nitrat 10% (Thuốc thử), trộn kỹ, lại để yên 6 phút Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (Thuốc thử), thêm nước tới vạch, trộn

kỹ và để yên trong 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm Vẽ đường cong

chuẩn, lấy độ hấp thụ là trục tung, nồng độ là trục hoành

 Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu thô đã sấy khô ở 60oC trong 6 giờ cho vào bình Soxhlet Thêm 120 ml ether (Thuốc thử), chiết tới khi dịch chiết không màu Để nguội và gạn bỏ ether Thêm 90 ml methanol (Thuốc thử) và chiết tới khi dịch chiết không còn màu Chuyển dịch chiết vào một bình định mức

100 ml, rửa bình chiết bằng một lượng nhỏ methanol rồi cho tiếp vào bình định mức Thêm methanol cho tới vạch và lắc kỹ Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước tới vạch và trộn kỹ Lấy chính xác 3 ml cho vào bình định mức 25 ml, thêm 3 ml nước rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5% (Thuốc thử), trộn kỹ Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch nhôm nitrat 10% (Thuốc thử), trộn kỹ, để yên 6 phút Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (Thuốc thử), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm Tính khối lượng rutin (µg) của dung dịch thử từ nồng độ đọc được trên đường cong chuẩn xây dựng trên độ hấp thụ và tính hàm lượng phần trăm

rutin trong dược liệu thông qua độ hấp thụ

 Hàm lượng rutin trong nụ hoa hoè không ít hơn 20%

1.2.4 Một số nghiên cứu về rutin

- Rutin là một chất được sử dụng rộng rãi trong thuốc và đang được tìm hiểu rất nhiều về thành phần, cấu trúc và tác dụng sinh học Ngoài ra còn có những nghiên cứu các nguồn nguyên liệu chiết xuất rutin khác nhau trong cây cỏ và nghiên cứu so sánh hàm lượng rutin tích luỹ giữa các vùng trồng với nhau

- Năm 1842, lần đầu tiên rutin được phân lập từ cây cửu lý hương – Ruta

graveolens L bởi dược sĩ người Đức – Weyb Nhưng 100 năm sau, rutin mới được

sử dụng nhiều trong Y học

- Hlasiwetz và nhiều người khác đã tiến hành nghiên cứu cấu trúc của rutin Perkin đã xác nhận được công thức phân tử của rutin là C27H30O16 và chỉ ra rằng gốc đường gắn vào vị trí số 3 của quercetin Charaux là người đầu tiên cô lập được phần đường của rutin là 1 disaccharide và gọi tên nó là “rutinose” Sau đó, Zemplén

và Gerecs đã thuỷ giải ruitin lấy từ hạt Rhamnus utilis bằng enzym và nhận được

rutinose

- Năm 2001, Nguyễn Văn Đậu đã thiết lập quy trình phân lập rutin trong nụ hoa hoè, có nhiều nghiên cứu khác nhằm đánh giá hàm lượng rutin trong các thành phần của cây và như trong nụ

- Một số nghiên cứu gần đây đã thành công trong việc chuyển hoá rutin thành troxerutin – một dẫn xuất của rutin có nhiều tác dụng trong chống oxy hoá Và có nhiều nghiên cứu về phản ứng thuỷ phân rutin thành quercetin thiết lập chất chuẩn định tính các hợp chất

- Năm 2010, có nghiên cứu chỉ ra hàm lượng rutin trong hoè thu hái tại 1 số tỉnh của Việt Nam trồng có hàm lượng thay đổi và tại Thái Bình cho hàm lượng cao nhất

- Bên cạnh đó tại Việt Nam, Hội đồng dược điển đã thiết lập chuyên luận riêng cho dược liệu là hoè và các sản phẩm như viên nén rutin và viên nén rutin C

- Một số cây khác có chứa rutin

Các nguồn rutin được chiết xuất từ một số dược liệu được thống kê theo Bảng 1.1

Bảng 1.1 Các nguồn có chứa Rutin khác [5]

Rutin

Moench

Polygonacea

e Mạch ba góc 5-8%

1.3 SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng

1.3.1.1 Nguyên tắc

- Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một lớp mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp

và được hút lên bản sắc kí bởi lực mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1]

- Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Rf = 𝑑𝑅 𝑑𝑀⁄Trong đó:

dR : khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM : khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Bảng 1.2 Một số chất làm pha tĩnh cho TLC [6]

Pha tĩnh Cơ chế sắc ký Ứng dụng phân tích

Silica Hấp phụ Acid amin, hydrocarbon, alcaloid, vitamin Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực

Cellulose Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid

Alumina Hấp phụ Hydrocarbon, alcaloid, chất màu thực phẩm,

lipid Cát biển Phân bố Đường, acid béo

Cellulose trao đổi ion Trao đổi ion Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,

halogenid Gel Sephadex Loại cỡ Polymer, protein, phức kim loại

- Pha động cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường rửa giải, thường kết hợp 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa 2 pha Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường chủ yếu dựa vào kinh nghiệm Một số gợi ý chung nhất cho pha động TLC [1]:

 Dung môi cần có độ tinh khiết cao

 Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0.2 – 0.8, đạt độ phân giải cực trị

 Chất phân tích dạng ion hay phân cực rửa giải tốt bằng dung môi phân cực như hỗn hợp n-butanol – nước Thêm một ít acid acetic hoặc ammoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng

 Khi dùng silica hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động

sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng Nếu thêm một ít dung môi phân cực như ethyl ethylic vào dung môi không phân cực như methylbenzene sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf

 Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ hoàn toàn có thể sử dụng cho TLC với pha tĩnh là silica hoặc alumina

1.3.1.2 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

Đầu tiên là lựa chọn bản mỏng sắc ký có kích thước phù hợp, hoạt hóa trong thời gian và nhiệt độ thích hợp Sau đó, thực hành sắc ký lớp mỏng có 4 bước sau

Bước 1: Đưa chất phân tích lên bản mỏng:

- Lượng và thể tích mẫu chấm: Lượng mẫu đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan

trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến trị số Rf Nếu lượng chất quá lớn, vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó các vết có trị số Rf gần nhau sẽ chồng lên nhau và không tách riêng được Nếu lượng chất quá nhỏ có thể khó phát hiện vết Lượng mẫu đưa lên bản mỏng khoảng 0.1 – 50 µg Tùy theo kiểu đưa mẫu lên bản mỏng

mà thể tích mẫu cũng khác nhau Trường hợp mẫu đưa dưới dạng điểm, thể tích mẫu khoảng 1-5 µl; còn trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dạng vạch thì lượng mẫu đưa lên khoảng 0.1 – 0.2 µl [1], [6]

- Vị trí đưa mẫu lên bản mỏng: Đường xuất phát cách mép dưới bản mỏng và mép

của dung môi pha động đủ lớn để tốc độ di chuyển của dung môi từ khi bắt đầu đến điểm đưa mẫu lên bản mỏng đã khá ổn định Tốt nhất là cách mép dưới bản mỏng 1.5 cm và cách mép dung môi từ 0.8 - 1cm Khoảng cách giữa các vết và giữa vết với mép ngoài bản mỏng tốt nhất nên là 1 cm để tránh hiệu ứng bờ [1], [6]

Bước 2: Khai triển sắc ký

- Thiết bị triển khai sắc ký thường là bình thủy tinh có nắp đậy kín, kích thước phù hợp với bản mỏng Để tăng độ bão hòa dung môi pha động trong bình (nhất là đối với dung môi có độ nhớt cao, khó bay hơi), đặt tờ giấy lọc áp sát thành bình

- Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô được cho vào bình sắc ký đã bão hòa pha động Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm vẫn cách bề mặt pha động khoảng 1 cm [6]

Bước 3: Hiện sắc ký đồ, dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất cần phân tích

để lựa chọn cách phát hiện thích hợp vết sắc ký

- Sử dụng thuốc thử hiện màu [6]: Sau khi khai triển, muốn quan sát đầy đủ nhất

tất cả các vết, thường phải phun thuốc thử lên bề mặt bản mỏng hoặc nhúng cả bản mỏng vào thuốc thử Đôi khi làm nóng bản mỏng để làm tăng tốc độ phản ứng tạo màu và cường độ vết màu

Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong nghiên cứu dược liệu

5 Hữu cơ nói chung H2SO4 20% ( không đặc hiệu)

7 Không no Hơi iod (không đặc hiệu)

10 Terpenoid VS, AS (không đặc hiệu)

- Soi dưới ánh sáng đèn UV [1]: Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ trở nên tối

hoặc phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 hoặc 366 nm Một số bản mỏng tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh quang

- Dùng densitometer [1]: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng

khi soi dưới đèn UV-VIS Chất phân tích bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký

Bước 4: Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm [1]

1.3.2 Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao – HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kỹ thuật SKLM Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động như: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc

ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết (TLC Scanner 3.4), và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [31], [37]

Ưu điểm của phương pháp này so với SKLM thông thường là [6]:

- Khả năng phân tách tốt hơn Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng cao

có kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản mỏng cũng tốt hơn

- Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản mỏng có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn

- Thời gian triển khai ngắn hơn

- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc ký tự động, buồng triển khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu Các yếu tố về môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được kiểm soát và hạn chế tới tối đa các thay đổi

- HPTLC ngày càng đươc ứng dụng nhiều trong định tính, định lượng

1.3.3 Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu

1.3.3.1 Định tính

- Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được: Chấm tương đối đậm mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau Nếu cả 3 sắc ký đồ đều cho một vết gọn trong một vùng Rf = 0.30 – 0.75 thì có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết Việc khẳng định sự tinh khiết của mẫu thử sẽ được kiểm tra bằng phương pháp phổ học khác (UV, IR,

- So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất 3 vết: vết I (mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn) Nếu trên cả 3 sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số Rf, về hình dạng vết, về màu sắc vết trước và sau khi hiện màu) thì có thể sơ bộ kết luận mẫu thử và mẫu

chuẩn là đồng nhất [6]

- Kiểm nghiệm dược liệu: Cùng với một quy trình chiết xuất như nhau, dịch chiết của mẫu thử dược liệu được chấm song song với dịch chiết của mẫu dược liệu chuẩn (thực hiện trên 3 bản mỏng khác nhau, không cần chấm trùng) Sau đó so sánh các vết cùng trên 1 bản mỏng về số vết, Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược liệu

dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm các dược liệu [6]

Theo kết quả thống kê trong tài liệu [11], SKLM là một trong các tiêu chuẩn định tính có mặt trong hầu hết các chuyên luận dược liệu trong Dược điển Dược điển thảo dược Hoa Kỳ có 31 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc (2010) có 873 chuyên luận và con số này trong Dược điển Việt Nam IV là 168 [3] Hình ảnh sắc

ký đồ SKLM cho các vết đặc trưng của dược liệu Ứng dụng này giúp xây dựng

“dấu vân tay” hóa học của từng dược liệu và từ đó xác định tính đúng của dược liệu, phát hiện sự nhầm lẫn, giả mạo, đánh giá chất lượng dược liệu

Bằng “dấu vân tay” hoá học của từng dược liệu, năm 2013, Nguyễn Ngọc Tú đã

xác định sự tương đồng về thành phần hoá học của một số loài trong chi Gymnena

R.Br trồng tại một số nơi khác nhau và dựa vào đó để xây dựng cây phân loại thực vật chí [25]

1.3.3.2 Bán định lượng

Dựa trên diện tích hoặc dựa trên cường độ màu (khi phun thuốc thử hoặc khi soi UV) của các vết xuất hiện trên bản mỏng (đặc biệt là bản mỏng hiệu năng cao), nếu

có mẫu chuẩn tương ứng, có thể bán định lượng một chất (hay một nhóm chất) có trong mẫu thử HPTLC được ứng dụng trong bán định lượng bằng phương pháp so sánh Một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau được pha sẵn Dựa vào mối liên hệ giữa nồng độ chất chuẩn đã biết và diện tích pic đáp ứng của chất

đó trên sắc ký đồ để từ đó xây dựng đường chuẩn định lượng Đo tín hiệu đáp ứng diện tích pic của chất cần phân tích trong mẫu thử và nội suy nồng độ từ đường chuẩn đã xây dựng ở trên [6]

Trên thế giới, nhiều lĩnh vực đã ứng dụng HPTLC trong bán định lượng như: nghiên cứu lâm sàng, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp, pháp y, môi trường [11] Trong nghiên cứu dược liệu, theo xu hướng phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc thực vật, định lượng hoạt chất trong dược liệu bằng HPTLC là một nội dung nghiên cứu được quan tâm phát triển Năm 2010 nghiên cứu định lượng berberin bằng HPTLC được tiến hành ở Ấn Độ Kết quả hàm lượng berberin là khoảng 4.0% Thẩm định độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp cho RSD lần lượt là 3.0% và 2.7% [31] Cũng ứng dụng quy trình trên, năm 2012, Nguyễn Thị Thu Hằng cũng đã định lượng berberin trong thân và

rễ của 1 số cây loài Berberis bằng phương pháp HPTLC Kết quả hàm lượng

berberin trong mẫu rễ là 3.98% và trong mẫu thân là khoảng 1.6% đến 3.1% [13]

Quy trình định lượng tetrandrine trong củ S tetrandra S More (phòng kỷ, họ

Tiết dê - Menisperaceae) bằng phương pháp HPTLC là một trong số các bộ quy

trình định lượng đang được hãng Camag xây dựng [31] Tetrandrine là thành phần

hoạt chất chính, có tác dụng lợi tiểu và làm giảm tình trạng thấp khớp Dược điển Trung Quốc quy định hàm lượng của tetrandrine trong dược liệu phải trên 0.7% HPTLC không chỉ giúp xác định nhanh hàm lượng tetrandrine mà hình ảnh sắc ký

đồ còn giúp phân biệt vị thuốc này với một vị thuốc khác cũng có tên là phòng kỷ nhưng thuộc họ Mộc thông (Aristolochiaceae), trong thành phần có chứa acid độc aristolochic là chất gây suy thận và ung thư [36]

Quy trình định lượng hàm lượng oxostephania trong cây Củ Dòm - Stephania

dielsiana Y C Wu – thu hái tại Ba Vì Oxostephania là một alkaloid có tác dụng ức

chế một số dòng tế bào ung thư [15] HPTLC đã đánh giá nhanh được hàm lượng oxostephania giữa các các mẫu lá, thân và củ của cây, giữa cây trồng có nguồn nhân giống vô tính và hữu tính [18], [21]

Dựa vào “dấu vân tay” hoá học của dược liệu, năm 2014, tại hội nghị Khoa học tuổi trẻ của trường đại học Dược Hà Nội, Phạm Thị Việt Hồng đã đánh giá nhanh được hàm lượng rotudin trong một số loài Bình Vôi thu hái tại Việt Nam bằng

phương pháp HPTLC, kết quả thu được tại 1 số loài như sau : Stephania

brachyandra Diels (6.25%); Stephania sinica Diels (3.05%); Stephania glabra

(Roxb) Miers (4.03%); Stephania kwangsiensis H.S.LO (3.61%); Stephania

dielsiana Y.C.Wu (0.2%); Stephania venosa (0.43%) [14]

CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

- Nguyên liệu nghiên cứu là mẫu nụ, hoa và quả của Hoè (S japonicum (L.)

Schott) thu hái tại xã Vũ Vân, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình và đã được giám định

tên và lưu tiêu bản tại phòng tiêu bản, số hiệu tiêu bản là HNIP/18115/15

Hình 2.1 Cây hoè tại vườn

- Mẫu nghiên cứu để xây dựng quy trình định lượng được lấy từ các cây trưởng thành, phát triển tốt, ra nhiều hoa hàng năm, được trồng trong vườn

- Xử lý mẫu để bảo quản và trước khi chế biến

 Mẫu sau khi thu hái được rửa sạch, thu lấy phần nụ - hoa – quả loại bỏ các tạp

 Phân loại thành các mẫu nghiên cứu Các mẫu sau khi thu hái và phân loại được sấy khô ở nhiệt độ 60C để bảo quản và ngăn phân huỷ hoạt chất Sau khi làm khô, nụ được chế biến theo YHCT

- Các mẫu thu hái theo bảng 2.1

Bảng 2.1 Các mẫu nghiên cứu

nụ có hình trứng

2 H02 Nụ bánh tẻ

Nụ đang phát triển dần thành hoa, có phần cánh hoa nhô ra ngoài lá đài một phần nhỏ hơn 50% so với thân nụ hoa Kích thước nụ, chiều dài khoảng 1-3mm, chiều ngang khoảng 1-2mm

3 H03 Nụ sắp nở

Là các nụ đang trong giai đoạn cuối quá trình phát triển hoa,

có phần cánh hoa nhô ra ngoài

lá đài trên 50% chiều dài thân

Phần cánh hoa nhô ra vẫn khép chưa nở ra Kích thước

nụ, chiều dài thân nụ khoảng 5-7mm, chiều ngang nụ khoảng 1-3mm

STT Kí

4 H04 Hoa nở

Là các hoa đã nở, có phần cánh nở hoàn toàn, phần nhị

và bộ nhuỵ thấy được, 1 cánh hoa úp xuống bên dưới che phần thân cuống, có màu trắng

or trắng vàng, lựa chọn các hoa chưa có phần cánh bị rụng

ra khỏi hoa Chiều dài từ 4-10

mm

5 H05 Quả

Thu quả đã phát triển, quả hình đậu, thắt eo ở giữa các hạt, không mở, vỏ quả đóng, mọc thành chùm, quả có vỏ màu xanh, không bị sâu hay chín vàng

6 H06 Nụ sao vàng

Nụ non sao vàng có màu vàng đậm, mùi thơm, bên trong vàng sáng Chế biến theo quy trình ở mục 2.2.2.1 phần chế biến theo YHCT

7 H07 Nụ sao đen

Nụ non sao đen toàn bộ phía ngoài đen đều, không bị cháy, bên trong có màu nâu hơi vàng Chế biến theo quy trình

ở mục 2.2.2.1 phần chế biến theo YHCT

- Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merk) dành cho HPTLC và TLC

- Tủ sấy WiseVen (R) WOF

- Máy cất quay Buchi R-210

- Máy đo hàm ẩm A&D Scales MF-50

- Cân phân tích Shimadzu (AY220)

- Nồi đun cách thủy

- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 100 và 200 ml; bình định mức 100 ml; pipet

bầu chính xác 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh

2.1.2.2 Hoá chất

- Ethanol 96, methanol, ethyl acetat, nước cất, acid formic, n-butanol, acid acetic

- Chất chuẩn rutin độ tinh khiết 99,90% (chuẩn đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương)

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin bằng HPTLC:

 Khảo sát hệ dung môi khai triển và các biện pháp xử lý mẫu để chọn ra các điều kiện thực nghiệm cho các vết trên bản mỏng gọn, tròn, vết rutin tách được khỏi các vết khác Khảo sát khoảng nồng độ của chuẩn rutin trong các mẫu thử

 Đánh giá tính tuyến tính, độ đặc hiệu, độ thích hợp của phương pháp

- Đánh giá sự tích luỹ hàm lượng của rutin trong quá trình phát triển của hoa hoè

và trong các dạng chế biến của nụ hoa Hoè theo phương pháp YHCT

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng

- Xử lý mẫu thử:

 Chiết xuất dược liệu [12], [20]:

Mẫu sau khi làm khô được nghiền thành bột thô Sau đó chiết theo quy trình sau:

Bột dược liệu cân

m ≈ 1,00g

Dịch lọc

Cô cắn

- Dung môi ethanol 96%

- Phương pháp chiết hồi lưu

- Chiết 3 lần lấy dịch lọc loại

bỏ bã

Hoà tan lại trong 100ml

methanol

 Phương pháp chế biến YHCT [22], [23]

Chọn mẫu nụ non loại bỏ các nụ bánh tẻ, nụ sắp nở, hoa đã nở, cành, quả và đem đi sao theo YHCT:

- Sao vàng: Cho hoa hòe vào chảo, lửa nhỏ, vừa đun vừa đảo đều tay cho đến khi mặt ngoài vàng đậm Đổ ra, trải mỏng cho nguội Sau khi sao, Hoa hòe sao vàng có màu vàng đậm, mùi thơm, bên trong vàng sáng [22]

- Sao đen (thán sao): Cho hoa hòe vào chảo, lửa nhỏ đến vừa, đun từ từ, vừa đun vừa đảo đều cho đến khi toàn bộ phía ngoài bị đen, bên trong có màu nâu hơi vàng,

có mùi thơm Đổ ra, trải mỏng cho khỏi cháy Sau khi sao, nụ hoa hòe sao đen toàn

bộ phía ngoài đen đều, không bị cháy, bên trong có màu nâu hơi vàng [22]

 Lựa chọn độ pha loãng phù hợp cho dung dịch thử:

Dịch chiết sau khi pha loãng 100 lần tiến hành pha loãng các nồng độ khác nhau như sau lấy lần lượt thể tích dịch A là 5-4-3-2-1 ml dung dịch A pha loãng trong vừa đủ 25ml methanol Thu được các dung dịch có nồng độ pha loãng lần lượt như sau dung dịch pha loãng 500 lần (dung dịch B), pha loãng 625 lần (dung dịch C), pha loãng 833.33 lần (dung dịch D), pha loãng 1250 lần (dung dịch E)

Đem khai triển trên bản mỏng và so sanh xem nồng độ pha loãng nào phù hợp với dãy chất chuẩn và hiện vết tròn, rõ nét, màu thay đổi theo nồng độ

 Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch chuẩn:

Cân chất chuẩn trên cân phân tích có độ chính xác 0.1 mg và pha trong methanol, có thể đun nóng nhẹ Pha các dãy nồng độ dung dịch chuẩn rutin có các nồng độ khác nhau như bảng 2.2

Bảng 2.2 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)

Dãy 1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Dãy 2 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Dãy 3 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.45

Triển khai sắc ký lớp mỏng các mẫu thử và mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên mối liên hệ giữa nồng độ rutin

và diện tích pic đáp ứng Từ đường chuẩn định lượng, khảo sát khoảng nồng độ rutin trong các mẫu thử, từ đó lựa chọn được dãy nồng độ chất chuẩn phù hợp

- Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC [32], [34]:

 Bản mỏng: Bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110˚C trong

60 phút Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm

 Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat5 Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 1.5 cm, cách mép dung môi

từ 0.8 – 1 cm Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 1.5 cm

Độ dài băng chấm 6 mm và thể tích chấm mỗi vết là 6 µl Tốc độ phun là 100µl/s

Mỗi bản mỏng kích thước 20 × 10 cm chấm tối đa 15 vết

 Hệ dung môi khai triển [3], [12], [24], [28] :

Tiến hành triển khai bản mỏng trên một số hệ dung môi:

Hệ 1 : N-butanol : acid acetic : nước = 4:1:5

Hệ 2 : Ethyl acetat : acid formic : methanol = 7:1:1

Hệ 3 : Ethyl acetat : acid formic : nước = 8:1:1

- Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ rutin của các mẫu chuẩn Xác định nồng độ rutin trong các mẫu thử Từ đó tính hàm lượng rutin trong dược liệu theo công thức sau :

% Rutin = C × P

Trong đó : C là nồng độ dung dịch thử (% g/mL)

m là khối lượng bột dược liệu (g)

a là 100 lần độ ẩm của bột dược liệu (%)

P là độ pha loãng của mẫu

- Thẩm định phương pháp định lượng :

 Độ đặc hiệu: [4], [30]

Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định

chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác

có trong mẫu thử

Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau:

a Mẫu trắng: dung dịch methanol;

b Mẫu thử: dịch chiết methanol của nụ hoa sấy 60C

c Mẫu chuẩn rutin hòa tan trong methanol

Triển khai sắc ký với mẫu bằng hệ dung môi khai triển được lựa chọn ở trên Soi và chụp ảnh bản mỏng tại ánh sáng trắng, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết và

so sánh giá trị RSD của Rf [32]

Đánh giá kết quả: Đánh giá dựa trên giá trị RSD của Rf Công thức tính RSD:

Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu:

a Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf

với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn

b Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn

Giá trị đề nghị chấp nhận khi so sánh trị số Rf: Độ lệch chuẩn tương đối của giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ dung dịch thử không quá 5% Độ lệch giá trị Rf trên vết mẫu thử so với vết mẫu chuẩn không quá 5% [4], [30]

 Tính tuyến tính:

Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu

được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử[4]

Cách tiến hành: Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn với nồng độ:

0.1-0.15-0.2-0.25-0.3(mg/ml) Tiến hành triển khai HPTLC với dãy dung dịch chuẩn trên Xây dựng

phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu [4], [30]

Đánh giá: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính

Thông thường với giá trị r > 0.90 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến

tính tốt [17]

 Độ thích hợp của hệ thống:

Khái niệm: Độ thích hợp của hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết

bị, dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích Độ thích hợp của

hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thử nghiệm [17]

Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn rutin có nồng độ 0.2 mg/ml Tiêm 6 lần dung

dịch chuẩn, triển khai HPTLC [4], [30]

Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic Giá trị RSD của diện tích

(chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2.0% [4], [30]

 Độ đúng [4], [30]:

Khái niệm: Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị

thực của mẫu đã biết

Cách tiến hành: Độ đúng của phương pháp HPTLC đối với định lượng hoạt chất

trong dược liệu được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn Chuẩn bị mẫu thử

từ nụ non, tiến hành theo quy trình :

- Mẫu thử 1: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn rutin có nồng độ 0.10 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên

- Mẫu thử 2: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn rutin có nồng độ 0.15 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên

- Mẫu thử 3: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn rutin có nồng độ 0.20 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên

Làm tương tự như trên với các mẫu thử khác là hoa nở và sao vàng

Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn có nồng độ: Tiêm lần lượt các mẫu theo quy trình định lượng thông thường, xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp theo công thức:

Tỷ lệ thu hồi (%) = tổng lượng tìm lại

tổng lượng thêm vào

Đánh giá: Độ đúng của phương pháp dựa vào tỷ lệ thu hồi và các giá trị RSD của tỷ

lệ thu hồi Không có các giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương pháp phải đạt được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ % và/hoặc khối lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử Nói chung, đối với phương pháp định lượng hàm lượng dược chất trong dược liệu, độ đúng của phương pháp có thể được chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chiết tách phức tạp, giới hạn RSD có thể dao động từ ± 2.0% đến ± 10.0% hoặc hơn, tuy nhiên cần

có biện giải về giới hạn này

2.2.2.2 Định lượng sự thay đổi hàm lượng của rutin trong nụ hoa và trong các mẫu chế biến theo YHCT

- Tính tung bình hàm lượng rutin giữa các lần đo

- So sánh giữa các mẫu chọn mẫu có hàm lượng cao nhất để tính so sánh với các

mẫu