Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng rutin trong phát triển của hoa hòe và nụ hoa hòe chế biến theo y học cổ truyền bằng phương pháp HPTLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TỐNG XUÂN QUANG NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG PHÁT TRIỂN CỦA HOA HOÈ VÀ NỤ HOA HOÈ CHẾ BIẾN THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ KHOÁ 65 HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TỐNG XUÂN QUANG NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG PHÁT TRIỂN CỦA HOA HOÈ VÀ NỤ HOA HOÈ CHẾ BIẾN THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn 1. TS. Nguyễn Quốc Huy. 2. PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển Nơi thực hiện Bộ môn Thực Vật HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Quốc Huy và PGS.TS. Nguyễn Mạnh Tuyển, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới: Khoa Kiểm nghiệm Đông dược của viện Kiểm nghiệm Trung ương đã hỗ trợ và cung cấp nguyên liệu tôi trong quá trình làm. DS Nguyễn Thị Thuỳ Linh đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi rất nhiều kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn. Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật và bộ môn Dược học cổ truyền đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Bạn Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, bạn Lương Thị Lan – M1K65, Quách Thị Thuý Nga – M2K65, đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn. Và tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học qua, cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Tống Xuân Quang MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang ĐẶT VẤN ĐỀ…………….………………………………………………… … 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN….…………………………………………… … 3 1.1. HOÈ…… ………… ……………………………………………………. 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố.……………………………………….…… 3 1.1.2. Thành phần hoá học…….…………………………………………….… 4 1.1.3. Tác dụng sinh học , chế biến và công dụng ……….……………….…… 5 1.1.3.1. Tác dụng sinh học……………………………………………….……. 5 1.1.3.2. Chế biến theo YHCT và công dụng …………………………………. 6 1.2. TỔNG QUAN VỀ RUTIN……………………………………….………. 7 1.2.1. Tính chất vật lý rutin ……………………………………………….……. 7 1.2.2. Định tính rutin …………………………………………………….…… 8 1.2.3. Định lượng rutin………………………………………………….………. 9 1.2.4. Một số nghiên cứu về rutin ….…………………………………………… 11 1.3. SẮC KÝ LƠP MỎNG HIỆU NĂNG CAO ….………………………… 11 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng ………………………………………… …… ……… 11 1.3.1.1. Nguyên tắc………………………………………………………… … 11 1.3.1.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng…………………………………….………… 13 1.3.2. Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao-HPTLC… 15 1.3.3. Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu……………………… 16 1.3.2.1. Định tính ………………………………………………………………… 16 1.3.2.2. Bán định lượng ……………………………………………………… … 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 20 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU …………………….….… 20 2.1.1. Nguyên liệu ……………………… ……………………………… …… 20 2.1.2. Hóa chất và dụng cụ……………………………………………………… 23 2.1.2.1. Máy móc và dụng cụ thí nghiệm…………………………………… …. 23 2.1.2.2. Hóa chất………………………………………………………….………. 23 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………. 24 2.2.1. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………….……… 24 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………… ……. 24 2.2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng……………………………………… 24 2.2.2.2. Định lượng hàm lượng Rutin trong quá trình phát triển hoa và trong các mẫu chế biến theo YHCT………………………………… 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………………………………………. 30 3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM……………………………….……………… 30 3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC ……………………… 30 3.1.1.1. Xử lý mẫu thử …………………………………………………….…… 30 3.1.1.2. Lựa chọn dãy nồng độ chuẩn ……………………………………………. 32 3.1.1.2. Lựa chọn độ pha loãng thích hợp ……………………………………… 34 3.1.1.3. Thẩm định phương pháp ………………………………………………… 35 3.1.2. Định lượng hàm lượng hoạt chất rutin trong phát triên hoa hoè và sau khi chế biến theo YHCT …………………………………………………………………… 39 3.1.3. Đánh giá hàm lượng rutin trong chế biến nụ hoa hoè theo YHCT………… 40 3.1.3.1. Kết quả so sánh hàm lượng rutin trong phát triển của hoa hoa hoè ……. 41 3.1.3.2. Kết quả so sánh hàm lượng rutin trước và sau khi chế biến theo YHCT 41 3.2. BÀN LUẬN ……………………………………………………………………… 42 3.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng ….…………………………………………… 42 3.2.2. Sự thay đổi hàm lượng rutin của hoa hoè trong phát triển hoa hoè và trong chế biến theo YHCT ………………………….…………………………………………… 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………………………… 46 KẾT LUẬN …………… ……………………………………………………………… 46 KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………… 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐC Đối chiếu IR Infrared Radiation HPTLC High Performance Thin Layer Chromatigraphy HPLC High Performance Liquid Chromatography MS Mass spectrometry NMR Nuclear magnetic resonance Rf Retention factor (Hệ số lưu) RSD Độ lệch chuẩn SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự S. Stypholobium TB Trung bình TT Thuốc thử TLC Thin Layer Chromatography YHCT Y học cổ truyền UV Ultraviolet DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các nguồn có chứa rutin khác .……………………………………… 12 Bảng 1.2 Một số chất làm pha tĩnh cho TLC ………………………………… 13 Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong nghiên cứu dược liệu ……………… 15 Bảng 2.1 Các mẫu nghiên cứu ………………………………………………… 21 Bảng 2.2 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml) ……………… 25 Bảng 3.1 Độ pha loãng của các mẫu ………………………………………… 35 Bảng 3.2 Nồng độ rutin chuẩn và diện tích pic đáp ứng ………………………. 36 Bảng 3.3 Giá trị R f và diện tích pic của các vết ………………………………. 37 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng …………………………………………… 38 Bảng 3.5 Hàm lượng rutin tích luỹ trong quá trình phát triển hoa và sau khi chế biến theo YHCT ………………………………………………… 39 Bảng 3.6 So sánh hàm lượng rutin giữa các mẫu với nụ non …………………. 41 Bảng 3.7 So sánh hàm lượng rutin trước và sau khi chế biến theo YHCT …… 42 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Cây hoè và hoa hoè .……………………………………………… 3 Hình 1.2 Các thành phần hoá học có trong nụ hoa ………………………… 4 Hình 1.3 Cấu trúc hoá học của Rutin và Quercetin …………………… … 7 Hình 2.1 Cây hoè tại vườn …………………………………………………. 20 Hình 2.2 Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC …………………………… 23 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn và thử tại 3 hệ dung môi soi tại ánh sáng trắng và bước sóng 254nm ………………………………………… 30 Hình 3.2 Pic sắc ký chuẩn rutin tại hệ dung môi 3 …………………….… 31 Hình 3.3 Pic sắc ký chuẩn rutin tại hệ dung môi 2 ………………………… 31 Hình 3.4 Đường chuẩn của dãy chuẩn 1 …………………….……………… 32 Hình 3.5 Đường chuẩn của dãy chuẩn 2 …………………….……………… 32 Hình 3.6 Đường chuẩn của dãy chuẩn 3 ……………………… ………… 32 Hình 3.7 Đồ thị đường chuẩn rutin theo chiều cao pic ……………… …… 33 Hình 3.8 Đồ thị đường chuẩn rutin theo diện tích pic …………………….… 34 Hình 3.9 Sắc ký đồ tại bước sóng 254nm ………………………………… 35 Hình 3.10 Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng ……… 36 Hình 3.11 Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic ………………………… 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là nước có hệ thực vật phong phú, trong đó có khoảng 4000 loài thực vật có thể làm thuốc trong các nền y học dân gian, 800 loài thường được dùng trong y học cổ truyền (YHCT) chính thống và 300 loài dùng trong công nghiệp dược [38]. Như vậy có thể thấy tiềm năng về cây thuốc ở Việt Nam còn rất lớn. Tìm chất mới cũng như nâng cao giá trị các dược liệu đã có là việc làm cần thiết phát triển nền YHCT Việt Nam. Hoè (Styphnolobium japonicum (L.) Schott.) là vị thuốc YHCT rất phổ biến tại Việt Nam nhất là một số tỉnh duyên hải Bắc bộ như Thái Bình, Nam Định, hoè được trồng làm cảnh, làm thuốc chữa bệnh… Từ xa xưa nụ hoa hoè đã được sử dụng làm thuốc và chế biến nhiều cách như sao vàng, sao cháy hay thán sao để sử dụng trong các bài thuốc. Rutin là một flavonoid có nhiều trong các loài thực vật. Trong Công nghiệp Dược, rutin được chiết xuất từ các phần của cụm bông hoa hoè cho hiệu suất cao, là nguồn nguyên liệu, vị thuốc được sử dụng nhiều trong đời sống và y học do đó hoa hoè được chuẩn hoá về dược liệu và hàm lượng rutin trong dược liệu trong Dược Điển Việt Nam và trong 1 số dược điển nước khác như Trung Quốc, Nhật Bản [3]. Hoa hòe được sử dụng trong YHCT và chiết rutin cho công nghiệp dược. Thực tế hiện nay, người dân thu hái tự phát chưa theo quy trình chuẩn về thời điểm thu hái và tiêu chuẩn của nụ hòe để có nguồn nguyên liệu chất lượng. trong YHCT thì nụ hoè có thể vi sao, sao vàng hay là thán sao (sao đen) [5], [7.] Với mỗi dạng chế biến có nhưng công dụng chỉ định, cách dùng trong các bài thuốc trong YHCT khác nhau như hạ huyết áp cho người cao huyết áp, thanh nhiệt, cầm máu, chỉ huyết. Toàn bộ quá trình này chưa có những đánh giá chuẩn hóa từ thu hái đến chế biến cũng như đánh giá hàm lượng rutin trong nụ hòe. DĐVN [3] đã hướng dẫn sử dụng phương pháp đo quang để định lượng rutin [3]. Nhưng đo quang thì có nhiều bất lợi với phân tích dược liệu do dịch chiết tổng chứa nhiều chất gây tạp. Nếu sử dụng phương pháp HPLC cho đánh giá thì chi phí cao hơn nhiều. Hiện nay HPTLC là phương pháp, đã và đang được sử dụng trong phân tích dược liệu và đánh giá 2 nhanh hàm lượng các chất hiện. Do đó, đề tài “Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng Rutin trong sự phát triển của hoa hòe và nụ hoa hòe chế biến theo YHCT bằng phương pháp HPTLC” với mục tiêu sau : 1. Xây dựng phương pháp bán định lượng hoạt chất rutin trong hoa hoè bằng phương pháp HPTLC. 2. Đánh giá sự tích luỹ hàm lượng hoạt chất rutin trong một số mẫu hoa hoè trong quá trình phát triển và nụ sau khi chế biến theo YHCT [...]... khác nhằm đánh giá hàm lượng rutin trong các thành phần của c y và như trong nụ - Một số nghiên cứu gần đ y đã thành công trong việc chuyển hoá rutin thành troxerutin – một dẫn xuất của rutin có nhiều tác dụng trong chống oxy hoá Và có nhiều nghiên cứu về phản ứng thuỷ phân rutin thành quercetin thiết lập chất chuẩn định tính các hợp chất - Năm 2010, có nghiên cứu chỉ ra hàm lượng rutin trong hoè thu hái... 1.1.3.2 Chế biến theo YHCT và công dụng [5], [10], [16], [19] - Chế biến theo YHCT [23] :  Khi trời khô ráo (thường vào buổi sáng), ngắt các chùm hoa chưa nở, tuốt l y nụ, loại bỏ các bộ phận khác của c y, phơi nắng hoặc s y nhẹ cho đến khô  Hoa hoè chủ y u sử dụng nụ hoa để chế biến, ngoài ra quả được sử dụng  Các dạng chế biến của nụ hoa hoè gồm sao vàng, sao đen - Công dụng [7], [19] :  Tính chất hoa. .. 6 H06 Nụ sao vàng vàng sáng Chế biến theo quy trình ở mục 2.2.2.1 phần chế biến theo YHCT Nụ non sao đen toàn bộ phía ngoài đen đều, không bị ch y, 7 H07 Nụ sao đen bên trong có màu nâu hơi vàng Chế biến theo quy trình ở mục 2.2.2.1 phần chế biến theo YHCT Ảnh mẫu 23 2.1.2 Hoá chất và thiết bị 2.1.2.1 M y móc và dụng cụ thí nghiệm - Hệ thống m y sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag bao gồm m y Linomat... lại trong 100ml methanol 25  Phương pháp chế biến YHCT [22], [23] Chọn mẫu nụ non loại bỏ các nụ bánh tẻ, nụ sắp nở, hoa đã nở, cành, quả và đem đi sao theo YHCT: - Sao vàng: Cho hoa hòe vào chảo, lửa nhỏ, vừa đun vừa đảo đều tay cho đến khi mặt ngoài vàng đậm Đổ ra, trải mỏng cho nguội Sau khi sao, Hoa hòe sao vàng có màu vàng đậm, mùi thơm, bên trong vàng sáng [22] - Sao đen (thán sao): Cho hoa hòe. .. trình phát triển của hoa hoè và trong các dạng chế biến của nụ hoa Hoè theo phương pháp YHCT 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1 X y dựng phương pháp định lượng - Xử lý mẫu thử:  Chiết xuất dược liệu [12], [20]: Mẫu sau khi làm khô được nghiền thành bột thô Sau đó chiết theo quy trình sau: Bột dược liệu cân m ≈ 1,00g - Dung môi ethanol 96% Phương pháp chiết hồi lưu Chiết 3 lần l y dịch lọc loại bỏ... pháp y, môi trường [11] Trong nghiên cứu dược liệu, theo xu hướng phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc thực vật, định lượng hoạt chất trong dược liệu bằng HPTLC là một nội dung nghiên cứu được quan tâm phát triển Năm 2010 nghiên cứu định lượng berberin bằng HPTLC được tiến hành ở Ấn Độ Kết quả hàm lượng berberin là khoảng 4.0% Thẩm định độ chính xác và độ lặp lại của. .. rutin trong nụ) [8] 1.1.2.1 Nụ hoa [5], [8], [16], [19] - Nụ hoa hoè chứa nhiều và chủ y u là rutin, Hoè Việt Nam có hàm lượng rutin cao, có tỉ lệ từ 6-30% có thể lên tới 38% trong nụ Phần aglycon của rutin là quercetin (= Quercetol) thuộc nhóm flavonol, phần đường là Rutinose [5] Rutin Betuin Sophoradiol Hình 1.2 Một số hợp chất hoá học có trong nụ hoa hòe 5 - Ngoài ra trong Hoa hoè còn có các hoạt chất... phương pháp định lượng rutin bằng HPTLC:  Khảo sát hệ dung môi khai triển và các biện pháp xử lý mẫu để chọn ra các điều kiện thực nghiệm cho các vết trên bản mỏng gọn, tròn, vết rutin tách được khỏi các vết khác Khảo sát khoảng nồng độ của chuẩn rutin trong các mẫu thử  Đánh giá tính tuyến tính, độ đặc hiệu, độ thích hợp của phương pháp - Đánh giá sự tích luỹ hàm lượng của rutin trong quá trình phát triển. .. trưng của dược liệu Ứng dụng n y giúp x y dựng “dấu vân tay” hóa học của từng dược liệu và từ đó xác định tính đúng của dược liệu, phát hiện sự nhầm lẫn, giả mạo, đánh giá chất lượng dược liệu Bằng “dấu vân tay” hoá học của từng dược liệu, năm 2013, Nguyễn Ngọc Tú đã xác định sự tương đồng về thành phần hoá học của một số loài trong chi Gymnena R.Br trồng tại một số nơi khác nhau và dựa vào đó để x y dựng... những nghiên cứu các nguồn nguyên liệu chiết xuất rutin khác nhau trong c y cỏ và nghiên cứu so sánh hàm lượng rutin tích luỹ giữa các vùng trồng với nhau - Năm 1842, lần đầu tiên rutin được phân lập từ c y cửu lý hương – Ruta graveolens L bởi dược sĩ người Đức – Weyb Nhưng 100 năm sau, rutin mới được sử dụng nhiều trong Y học - Hlasiwetz và nhiều người khác đã tiến hành nghiên cứu cấu trúc của rutin . BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TỐNG XUÂN QUANG NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG PHÁT TRIỂN CỦA HOA HOÈ VÀ NỤ HOA HOÈ CHẾ BIẾN THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN BẰNG PHƯƠNG PHÁP. nhanh hàm lượng các chất hiện. Do đó, đề tài Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng Rutin trong sự phát triển của hoa hòe và nụ hoa hòe chế biến theo YHCT bằng phương pháp HPTLC với mục tiêu. ……………………………………………………………………… 42 3.2.1. X y dựng phương pháp định lượng ….…………………………………………… 42 3.2.2. Sự thay đổi hàm lượng rutin của hoa hoè trong phát triển hoa hoè và trong chế biến theo YHCT ………………………….……………………………………………