Tiến hành pha chuẩn rutin với methanol thu các nồng độ như bảng 2.2, sau đó chấm sắc ký trên cùng 1 bản mỏng Silicagel GF254 20x10 cm và đo tại bước sóng 254nm. Kết quả thu được như sau :
Hình 3.4. Đường chuẩn của dãy chuẩn 1
Hình 3.5. Đường chuẩn của dãy chuẩn 2
Nhận xét :
Với dãy chuẩn 1 (hàm lượng chuẩn rutin từ 0.1-0.2-0.3-0.4-0.5 mg/ml) và dãy chuẩn 3 (hàm lượng chuẩn rutin từ 0.15-0.2-0.25-0.3-0.4-0.45 mg/ml) giá trị độ lệch chuẩn thấp không phù hợp.
Với dãy chuẩn 2 (hàm lượng chuẩn rutin từ 0.1-0.15-0.2-0.25-0.3 mg/ml) thì cho đường chuẩn có độ lệch chuẩn thấp, kết quả R2 > 0.99 nên lựa chọn dãy chuẩn này.
Kết luận:
Lựa chọn dãy chuẩn 0.1-0.15-0.2-0.25-0.3 mg/ml làm dãy chuẩn để định lượng. Kết quả về diện tích pic lập đường chuẩn trên excel thu được lập đường chuẩn có phương trình như sau :
𝑦 = 184526𝑥 + 2270.5 Trong đó: y: là giá trị đo của diện tích pic
x: là nồng độ rutin trong mẫu Với độ lệch R2 = 0.9975. lập đồ thị
Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn rutin theo chiều cao pic
- Đường chuẩn theo chiều cao pic:
y = 6908.6x + 258.43 R² = 0.9977 0 500 1000 1500 2000 2500 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 ch iề u c ao p ic nồng độ rutin (mg/ml)
Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn rutin theo diện tích pic
- Đường chuẩn theo diện tích pic:
Nhận xét : Đường chuẩn xây dựng theo diện tích pic và chiều cao pic đều có giá trị R2 > 0.99 do đó có thể sử dụng cả 2 phương pháp tính này.
3.1.1.3. Lựa chọn độ pha loãng thích hợp
Khảo sát các độ pha loãng đối với từng mẫu thử thu được kết quả như phụ lục 3 sau :
Với nụ non, nụ bánh tẻ, nụ sắp nở ở độ pha loãng 1250 lần thì vết rutin lên gọn không bị kéo và nồng độ rutin tính theo diện tích pic và chiều cao pic đều nằm trong khoảng nồng độ từ 0.1 – 0.3 mg/ml.
Với mẫu hoa nở ở độ pha loãng 625 lần, 833.33 lần và 1250 lần đều cho nồng độ rutin nằm trong đường tuyến tính của dãy chất chuẩn tuy nhiên do ở độ pha loãng 833.33 lần và 1250 lần nằm sát ở giới hạn dưới của dãy chuẩn dễ gây ra sai sô nên đề tài lựa chọn độ pha loãng 625 lần.
Với mẫu quả thì độ pha loãng 200 lần phù hợp.
Với sao vàng thì ở độ pha loãng 1250 cho nồng độ rutin nằm giữa khoảng nồng độ tuyến tính. y = 184526x + 2270.5 R² = 0.9975 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 d iệ n t íc h p ic nồng độ rutin ( mg/ml)
Với mẫu sao đen chọn độ pha loãng 625 lần.
Kết luận : chọn các nồng độ pha loãng cho từng mẫu như sau
Bảng 3.1. Nồng độ pha loãng từng mẫu
Nụ non
Nụ bánh tẻ
Nụ sắp
nở Hoa nở Quả Sao vàng Sao đen
Độ pha loãng
1250 1250 1250 625 200 1250 625 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng
Độ đặc hiệu
Triển khai sắc ký trên 3 mẫu trắng, thử, chuẩn thu được kết quả như sau: Sắc ký đồ của mẫu thử cho vết rutin có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf (0.25) với vết rutin trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
Hình 3.9. Sắc ký đồ tại bước sóng 254nm. TR
Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với vết rutin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
Hình 3.10. Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy phương pháp phân tích có tính đặc hiệu với chất chuẩn rutin.
* Tính tuyến tính:
Triển khai sắc ký với các nồng độ từ 0.1 đến 0.3 mg/ml thu được các vết có diện tích pic tương ứng như bảng sau:
Bảng 3.2. Nồng độ rutin chuẩn và diện tích pic đáp ứng
STT Mẫu Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic
1 RU1 0.1000 21225 2 RU2 0.1500 29469 3 RU3 0.2000 38389 4 RU4 0.2500 49409 5 RU5 0.3000 57387 Hệ số tương quan r 0.9987 Mẫu chuẩn Mẫu thử Mẫu trắng
Hình 3.11. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu chuẩn Rutin
Phương trình đường chuẩn theo diện tích pic: 𝑦 = 184526. 𝑥 + 2270.5 Trong đó: y: diện tích pic.
x: nồng độ chuẩn rutin.
Hệ số tương quan r= 0.9987 (tương ứng với giá trị r2 = 0.9975).
Nhận xét: với giá trị r > 0.90. nhận thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ rutin và diện tích pic sắc ký.
Độ thích hợp của hệ thống:
Từ 6 lần tiêm mẫu khác nhau thu được giá trị Rf và diện tích pic tương ứng như sau:
Bảng 3.3. Giá trị Rf và diện tích pic của các vết
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 RSD
(%)
Giá trị Rf 0.3395 0.3381 0.3381 0.3395 0.3381 0.3395 0.2260
Nhận xét: giá trị RSD giữa các giá trị Rf và diện tích pic lần lượt là 0.2260% và 2.2580%.
Giá trị RSD tính theo diện tích pic hay Rf đều nằm trong giới hạn chấp nhận được, hệ thống HPTLC có hiệu năng phù hợp với quy trình phân tích trong quá trình tiến hành thực nghiệm.[4], [30]
Độ đúng:
Thực hiện 3 lần với mỗi nồng độ sau đó tính trung bình, tiến hành với 3 mẫu thử là nụ non, hoa nở và sao vàng với 3 nồng độ rutin chuẩn là 0.1 - 0.15 – 0.2 mg/ ml. Từ các thông số diện tích pic đo được, tính toán hàm lượng rutin trong các mẫu sau khi thêm chuẩn như sau:
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng STT Lượng ban đầu (mg) Lượng thêm vào (mg) Tổng lượng sau khi đã thêm chuẩn (mg) Tổng lượng
tìm lại (mg) Tỉ lệ thu hồi (%)
1 0.2986 0.1 0.3987 0.3942 98.89% 2 0.1418 0.1 0.2418 0.2510 103.81% 3 0.2273 0.1 0.3273 0.3641 111.23% TB 104.64% RSD 6.213% 1 0.2986 0.15 0.4487 0.4481 99.88% 2 0.1418 0.15 0.2918 0.3101 106.26% 3 0.2273 0.15 0.3773 0.3931 104.19% TB 103.44% RSD 3.26% 1 0.2986 0.2 0.4987 0.4954 99.34% 2 0.1418 0.2 0.3418 0.3960 115.85% 3 0.2273 0.2 0.4273 0.4107 96.12% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Lượng ban đầu (mg) Lượng thêm vào (mg) Tổng lượng sau khi đã thêm chuẩn (mg) Tổng lượng
tìm lại (mg) Tỉ lệ thu hồi (%)
TB 103.77%
RSD 10.59%
Trung bình chung 103.95%
RSD trung bình 6.69%
Nhận xét: Giá trị RSD trung bình của độ đúng là 6.69%, nằm trong giới hạn cho phép đối với phân tích dược liệu [4], [30].
3.1.2. Định lượng hàm lượng rutin trong các mẫu hoa hoè và các mẫu nụ hoa hoè sau khi chế biến theo YHCT.
Từ phương pháp định lượng trên hàm lượng rutin tích luỹ trong quá trình phát triển của hoa hoè và chọn mẫu nụ non đi chế biến theo YHCT. Tiến hành đo độc lập 4 lần của các dịch pha loãng từ dịch gốc ban đầu thu được kết quả trong phụ lục 4.
Tổng hợp kết quả đo được theo bảng 3.5.
Bảng 3.5. Định lượng hàm lượng rutin trong các mẫu.
STT Mẫu Khối lượng cân Hàm ẩm Độ pha loãng C (g) Hàm lượng rutin TB (% mg/mg) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 1 Nụ non 1.0125 9.07% 1250 0.2965 0.3408 0.2830 0.2743 29.86% 2 Nụ bánh tẻ 1.0015 10.22% 1250 0.2365 0.2373 0.2087 0.2748 23.93% 3 Nụ sắp nở 1.0166 11.42% 1250 0.1989 0.1874 0.1636 0.2061 18.90% 4 Hoa nở 1.0066 7.18% 625 0.1304 0.1517 0.1416 0.1434 14.18%
STT Mẫu Khối lượng cân Hàm ẩm Độ pha loãng C (g) Hàm lượng rutin TB (% mg/mg) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 5 Quả 1.0025 8.50% 200 0.0246 0.0137 0.0250 0.0303 2.34% 6 Sao vàng 1.0217 7.73% 1250 0.2568 0.1927 0.2048 0.2549 22.73% 7 Sao đen 1.0076 8.20% 625 0.0622 0.0536 0.0699 0.0806 6.66% Nhận xét:
- Hàm lượng rutin các mẫu có sự khác nhau qua các lần đo.
- Mẫu nụ non có hàm lượng rutin cao nhất (29.86% tính theo mẫu khô) và mẫu quả có hàm lượng rutin thấp nhất (2.34% tính theo mẫu khô).
- Mẫu nụ bánh tẻ (23.93%) và nụ sao vàng (22.73%) đều có hàm lượng rutin cao và đạt theo tiêu chuẩn chuyên luận hoè trong dược điển Việt Nam IV (20%) [3]. - Các mẫu nụ sắp nở và hoa nở có hàm lượng rutin tương đối (18.90% và 14.18%)
nhưng đều dưới hàm lượng trong dược liệu mà dược điển quy định. - Mẫu nụ sao đen có hàm lượng rutin thấp (6.66%).
- Như vậy có chia ra các nhóm có hàm lượng rutin cao là nụ non, nụ bánh tẻ và nụ sắp nở, sao vàng. Các mẫu có hàm lượng rutin trung bình là hoa nở và các mẫu có hàm lượng rutin thấp là quả và sao đen
3.1.3. Đánh giá hàm lượng rutin tích luỹ trong quá trình phát triển của hoa và sau khi chế biến theo YHCT.
3.1.3.1. Kết quả so sánh hàm lượng giữa các mẫu hoa trong quá trình phát triển của hoa hoè
Kết quả so sánh hàm lượng rutin tích luỹ trong quá trình phát triển của hoa hoè với dạng nụ non ban đầu
Bảng 3.6. So sánh hàm lượng rutin giữa các mẫu với nụ non
Mẫu Nụ non Nụ bánh tẻ Nụ sắp nở Hoa nở Quả
Hàm lượng TB 29.86% 23.93% 18.90% 14.18% 2.34%
So sánh với nụ non x -5.93% -10.96% -15.68% -27.52%
Nhận xét :
Hàm lượng rutin tích luỹ hoa hoè giảm dần từ cao đến thấp tới cao từ khi bắt đầu có nụ tới khi thành quả. Trong đó nụ non có hàm lượng cao do với kích thước nhỏ và sô lượng của 1 gram có rất nhiều nụ nên tính trên 1 gram dược liệu thì hàm lượng thu được là 29,86% . Đây được người dân gọi là nụ nếp tức các nụ chưa nở và hàm lượng loại nào cao hơn so với các nụ khác.
- Nụ bánh tẻ có hàm lượng rutin cao so với các mẫu, nó chiếm 23.93%. Và hàm lượng rutin có sự giảm đi khoảng 5,93% so với nụ non.
- Hàm lượng rutin trong nụ sắp nở đã giảm đi rõ rệt gần 10.96%, nhưng hàm lượng rutin trong nụ vẫn ở mức cao là 19,80%.
- Hoa nở có hàm lượng rutin thấp hơn so với nụ non ban đầu gần như giảm hơn 50% lượng rutin so với nụ non. Hàm lượng rutin tích trong hoa khoảng 14,18%. - Trong quả hàm lượng rutin tích luỹ được thấp hơn so với các dạng nụ (2,34%) . so với dạng nụ ban đầu thì tỉ lệ rutin trong đó giảm đi là 27.52% trên khối lượng khô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.3.2. Kết quả so sánh hàm lượng rutin trước và sau khi chế biến theo YHCT.
Hàm lượng rutin có trong các mẫu trước và sau khi chế biến tính theo nụ non
Bảng 3.7. So sánh hàm lượng rutin trước và sau khi chế biến theo YHCT
Mẫu Nụ non Sao vàng Sao den
Hàm lượng TB 29.86% 22.73% 6.66%
Mẫu Nụ non Sao vàng Sao den
So sánh với nụ non x -7.13% -23.20%
Nhận xét:
-Hàm lượng rutin trong các mẫu nụ sau khi sao vàng, sao đen của mẫu nụ non có sự khác biệt .
- Với sao vàng lượng rutin trong nụ còn 22.73% và giảm đi khoảng 7.13% so với ban đầu trước khi sao.
- Với sao đen thì lượng rutin (6.66%) đã chênh lệch nhiều so với ban đầu, giảm đi 23.20%, hàm lượng rutin mất đi rất lớn bị chuyển hoá rất nhiều.
- Sau khi chế biến có sự thay đổi về hàm lượng rutin và hàm lượng rutin giảm đi rõ rệt nhất là ở dạng nụ sao đen giảm đi 23.20%, và dạng sao vàng cũng giảm tương đối là trung bình 7.13%.
- Tuy nhiên do hàm ẩm của bột dược liệu điều này cho thấy khả năng bảo quản của dược liệu cao hơn, sự phân huỷ thành phần giảm. Hàm ẩm của nụ non ban đầu là từ 9.07% sau khi sao giảm còn 7.73% ở sao vàng và 8.03% ở sao đen.
3.2.Bàn luận
3.2.1. Xây dựng quy trình định lượng
Định lượng rutin trong nụ hoa hoè bằng HPTLC là 1 phương pháp mới tại Việt Nam. Đây là 1 phương pháp mới với ưu điểm là khá đơn giản trong việc tiến hành, độ nhạy cao, tính kinh tế, và phù hợp với nghiên cứu so sánh.
Nghiên cứu đã tiến hành thẩm định phương pháp phân tích dựa trên một số tiêu chuẩn theo khoá thẩm định phương pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC. Kết quả cho thấy phương pháp có khả năng phân tích đặc hiệu với chuẩn rutin, có độ tương quan tốt giữa nồng độ chất chuẩn và diện tích pic đáp ứng. Độ lặp lại của hệ thống cũng cho thấy tính tương thích phù hợp trong ngày tiến hành sắc ký. Tuy độ đúng của phương pháp cho giá trị RSD tương đối cao (6.51%), nhưng đối với phân tích dược liệu, do tiến hành trên dịch chiết tổng có lẫn nhiều tạp chất, và sai số có thể
sinh ra trong quá trình chiết tách phức tạp nên giá trị trên vẫn nằm trong khoảng chấp nhận được.
HPTLC là phương pháp bán tự động, các yếu tố về điều kiện môi trường như độ ẩm, nhiệt độ… có ảnh hưởng lớn tới hình ảnh và độ gọn của vết rutin chuẩn. Do được tiến hành trên các bản mỏng nên các chú ý khi chuẩn bị bản mỏng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng lớn tới độ lặp lại của kết quả phân tích hàm lượng rutin.
Bên cạnh đó, nguyên tắc định lượng chủ yếu dựa trên cường độ màu vết rutin ở ánh sáng trắng sau phun thuốc thử hoặc bước sóng 254nm. Với các lý do như trên, định lượng bằng HPTLC có nhiều khả năng xảy ra sai số, kết quả định lượng rutin chủ yếu mang tính định hướng nhằm xác định bộ phận thu hái phù hợp, đạt mục tiêu hàm lượng và so sánh sơ bộ giữa các mẫu dược liệu và các mẫu vị thuốc trước và sau chế biến, bước đầu đánh giá sơ bộ.
Trên hình ảnh sắc ký đồ trên bản mỏng có thể cung cấp thêm thông tin về định tính dược liệu, góp phần sơ bộ vào việc đánh giá các chất có trong các giai đoạn phát triển của hoa hoè và trong chế biến theo YHCT. Để xem xét sự thay đổi thành phần hoá học trước và sau khi chế biến, từ đó sơ bộ việc chế biến có ý nghĩa như thế nào với dược liệu và cách sử dụng của YHCT.
So sánh với đề tài nghiên cứu của một nhóm tác giả nghiên cứu Gaurav Mahesh Doshi, Sandeep Prabhakar Zine, Pratip Kashinath Chaskar và Hemant Devidas Une tại Ấn Độ về loài Polyalthia longifolia Thwaites [33] có thành phần hoá học trong cây có chứa rutin trong đó và so sánh giữa 2 phương pháp HPTLC và HPLC trong quá trình định lượng thành phần rutin với độ sai khác giữa khối lượng khai thác thực (13.94% w/w) và kết quả HPTLC (11.40% w/w). So về cách chiết xuất thì không có sự sai khác là chiết bằng dung môi ethanol nhưng về cách xử lý bản mỏng để đo tại các bước sóng thì với thiết bị đo đơn giản hơn chúng tôi đã giải quyết được các vấn đề về sai số do hiện tượng pic nền đơn giản hơn so với nghiên cứu trên nhưng thu được kết quả tương đối tốt.
Đánh giá chung
Hàm lượng rutin trong mẫu hoa cho thấy lượng rutin có sự biến đổi trong quá trình phát triển của hoa, từng giai đoạn hoa cho lượng rutin khác nhau. Trong đó theo tiêu chuẩn dược liệu hoè do dược điển Việt Nam IV quy định thì hàm lượng rutin đạt không dưới 20% trên lượng mẫu khô. Hàm lượng rutin trong mẫu nụ non và bánh tẻ, nụ sao vàng đều đạt theo tiêu chuẩn dược điển. Với nụ sắp nở, hoa nở và quả không đạt hàm lượng. Từ đó đưa ra mẫu thu hái tại thời điểm bông bắt đầu có nụ bánh tẻ có hàm lượng đạt theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam về dược liệu. Bên cạnh đó khi thu hái hạn chế hoa nở và sắp nở nếu nhiều dạng nụ và hoa này sẽ giảm chất lượng dược liệu.
So sánh với các phương pháp định lượng khác như HPLC thì tôi thấy phương pháp này đưa ra có thể định lượng nhanh, nhiều mẫu trong cùng 1 lúc, và thuận tiện hơn. So với phương pháp định lượng ghi trong dược điển Việt Nam thì tôi thấy về mặt nguyên tắc đều là đo quang phổ hấp thụ vết nhưng so với cách tiến hành như dược điển quy định thì phương pháp đưa ra cải thiện hơn, có thể phân tích tránh tạp