Máy móc và dụng cụ thí nghiệm

- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag bao gồm máy Linomat 5, ADC2, TLC Visualizer, phần mềm winCATS, phần mềm VideoScan.

+ Linomat 5 là hệ thống phun mẫu lên bản mỏng, ADC2 là hệ thống máy khai triển bản mỏng, TLC Visualizer là hệ thống máy soi tại các bước sóng 254nm và 366nm.

Hình 2.2. Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC

- Bộ chiết hồi lưu. - Bình triển khai sắc ký.

- Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merk) dành cho HPTLC và TLC. - Tủ sấy WiseVen (R) WOF.

- Máy cất quay Buchi R-210

- Máy đo hàm ẩm A&D Scales MF-50. - Cân phân tích Shimadzu (AY220). - Nồi đun cách thủy.

- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 100 và 200 ml; bình định mức 100 ml; pipet bầu chính xác 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh.

2.1.2.2.Hoá chất

- Ethanol 96, methanol, ethyl acetat, nước cất, acid formic, n-butanol, acid acetic. - Chất chuẩn rutin độ tinh khiết 99,90% (chuẩn đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương).

2.2.NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin bằng HPTLC:

 Khảo sát hệ dung môi khai triển và các biện pháp xử lý mẫu để chọn ra các điều kiện thực nghiệm cho các vết trên bản mỏng gọn, tròn, vết rutin tách được khỏi các vết khác. Khảo sát khoảng nồng độ của chuẩn rutin trong các mẫu thử.

 Đánh giá tính tuyến tính, độ đặc hiệu, độ thích hợp của phương pháp.

- Đánh giá sự tích luỹ hàm lượng của rutin trong quá trình phát triển của hoa hoè và trong các dạng chế biến của nụ hoa Hoè theo phương pháp YHCT

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1.Xây dựng phương pháp định lượng

- Xử lý mẫu thử:

 Chiết xuất dược liệu [12], [20]:

Mẫu sau khi làm khô được nghiền thành bột thô. Sau đó chiết theo quy trình sau: Bột dược liệu cân

m ≈ 1,00g

Dịch lọc

Cô cắn - Dung môi ethanol 96%

- Phương pháp chiết hồi lưu - Chiết 3 lần lấy dịch lọc loại

bỏ bã.

Hoà tan lại trong 100ml methanol

 Phương pháp chế biến YHCT [22], [23]

Chọn mẫu nụ non loại bỏ các nụ bánh tẻ, nụ sắp nở, hoa đã nở, cành, quả và đem đi sao theo YHCT:

- Sao vàng: Cho hoa hòe vào chảo, lửa nhỏ, vừa đun vừa đảo đều tay cho đến khi mặt ngoài vàng đậm. Đổ ra, trải mỏng cho nguội. Sau khi sao, Hoa hòe sao vàng có màu vàng đậm, mùi thơm, bên trong vàng sáng [22].

- Sao đen (thán sao): Cho hoa hòe vào chảo, lửa nhỏ đến vừa, đun từ từ, vừa đun vừa đảo đều cho đến khi toàn bộ phía ngoài bị đen, bên trong có màu nâu hơi vàng, có mùi thơm. Đổ ra, trải mỏng cho khỏi cháy. Sau khi sao, nụ hoa hòe sao đen toàn bộ phía ngoài đen đều, không bị cháy, bên trong có màu nâu hơi vàng [22].

 Lựa chọn độ pha loãng phù hợp cho dung dịch thử:

Dịch chiết sau khi pha loãng 100 lần tiến hành pha loãng các nồng độ khác nhau như sau lấy lần lượt thể tích dịch A là 5-4-3-2-1 ml dung dịch A pha loãng trong vừa đủ 25ml methanol. Thu được các dung dịch có nồng độ pha loãng lần lượt như sau dung dịch pha loãng 500 lần (dung dịch B), pha loãng 625 lần (dung dịch C), pha loãng 833.33 lần (dung dịch D), pha loãng 1250 lần (dung dịch E).

Đem khai triển trên bản mỏng và so sanh xem nồng độ pha loãng nào phù hợp với dãy chất chuẩn và hiện vết tròn, rõ nét, màu thay đổi theo nồng độ.

 Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch chuẩn:

Cân chất chuẩn trên cân phân tích có độ chính xác 0.1 mg và pha trong methanol, có thể đun nóng nhẹ. Pha các dãy nồng độ dung dịch chuẩn rutin có các nồng độ khác nhau như bảng 2.2.

Bảng 2.2. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)

Nồng độ RU1 RU2 RU3 RU4 RU5 RU6

Dãy 1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Dãy 2 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Triển khai sắc ký lớp mỏng các mẫu thử và mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng. Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên mối liên hệ giữa nồng độ rutin và diện tích pic đáp ứng. Từ đường chuẩn định lượng, khảo sát khoảng nồng độ rutin trong các mẫu thử, từ đó lựa chọn được dãy nồng độ chất chuẩn phù hợp. - Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC [32], [34]:

 Bản mỏng: Bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110˚C trong 60 phút. Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm.

 Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat5. Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 1.5 cm, cách mép dung môi từ 0.8 – 1 cm. Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 1.5 cm. Độ dài băng chấm 6 mm và thể tích chấm mỗi vết là 6 µl. Tốc độ phun là 100µl/s. Mỗi bản mỏng kích thước 20 × 10 cm chấm tối đa 15 vết.

 Hệ dung môi khai triển [3], [12], [24], [28] :

Tiến hành triển khai bản mỏng trên một số hệ dung môi: Hệ 1 : N-butanol : acid acetic : nước = 4:1:5.

Hệ 2 : Ethyl acetat : acid formic : methanol = 7:1:1. Hệ 3 : Ethyl acetat : acid formic : nước = 8:1:1.

- Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ rutin của các mẫu chuẩn. Xác định nồng độ rutin trong các mẫu thử. Từ đó tính hàm lượng rutin trong dược liệu theo công thức sau :

% Rutin = C × P

m×(100−a)/100 × 100 Trong đó : C là nồng độ dung dịch thử (% g/mL).

m là khối lượng bột dược liệu (g)

a là 100 lần độ ẩm của bột dược liệu (%). P là độ pha loãng của mẫu.

-Thẩm định phương pháp định lượng :

Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác có trong mẫu thử .

Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau: a. Mẫu trắng: dung dịch methanol;

b. Mẫu thử: dịch chiết methanol của nụ hoa sấy 60C. c. Mẫu chuẩn rutin hòa tan trong methanol

Triển khai sắc ký với mẫu bằng hệ dung môi khai triển được lựa chọn ở trên. Soi và chụp ảnh bản mỏng tại ánh sáng trắng, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết và so sánh giá trị RSD của Rf [32].

Đánh giá kết quả: Đánh giá dựa trên giá trị RSD của Rf. Công thức tính RSD:

Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu:

a.Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf

với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.

b. Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.

Giá trị đề nghị chấp nhận khi so sánh trị số Rf: Độ lệch chuẩn tương đối của giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ dung dịch thử không quá 5%. Độ lệch giá trị Rf trên vết mẫu thử so với vết mẫu chuẩn không quá 5% [4], [30].

 Tính tuyến tính:

Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử[4].

Cách tiến hành: Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn với nồng độ: 0.1-0.15-0.2-0.25- 0.3(mg/ml). Tiến hành triển khai HPTLC với dãy dung dịch chuẩn trên. Xây dựng

phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu [4], [30].

Đánh giá: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính.

Thông thường với giá trị r > 0.90 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến tính tốt [17].

 Độ thích hợp của hệ thống:

Khái niệm: Độ thích hợp của hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết bị, dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích. Độ thích hợp của hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thử nghiệm [17].

Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn rutin có nồng độ 0.2 mg/ml. Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn, triển khai HPTLC [4], [30].

Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic. Giá trị RSD của diện tích (chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2.0% [4], [30].

 Độ đúng [4], [30]:

Khái niệm: Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết.

Cách tiến hành: Độ đúng của phương pháp HPTLC đối với định lượng hoạt chất

trong dược liệu được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Chuẩn bị mẫu thử từ nụ non, tiến hành theo quy trình :

- Mẫu thử 1: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn rutin có nồng độ 0.10 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên.

- Mẫu thử 2: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn rutin có nồng độ 0.15 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên.

- Mẫu thử 3: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn rutin có nồng độ 0.20 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên.

Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn có nồng độ: Tiêm lần lượt các mẫu theo quy trình định lượng thông thường, xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp theo công thức:

Tỷ lệ thu hồi (%) = tổng lượng tìm lại

tổng lượng thêm vào

Đánh giá: Độ đúng của phương pháp dựa vào tỷ lệ thu hồi và các giá trị RSD của tỷ lệ thu hồi. Không có các giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương pháp phải đạt được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ % và/hoặc khối lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử. Nói chung, đối với phương pháp định lượng hàm lượng dược chất trong dược liệu, độ đúng của phương pháp có thể được chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chiết tách phức tạp, giới hạn RSD có thể dao động từ ± 2.0% đến ± 10.0% hoặc hơn, tuy nhiên cần có biện giải về giới hạn này.

2.2.2.2. Định lượng sự thay đổi hàm lượng của rutin trong nụ hoa và trong các mẫu chế biến theo YHCT

- Tính tung bình hàm lượng rutin giữa các lần đo.

- So sánh giữa các mẫu chọn mẫu có hàm lượng cao nhất để tính so sánh với các mẫu.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC

Xử lý mẫu thử như phần 2.2.2.1 thu được kết quả như sau:

3.1.1.1. Lựa chọn hệ dung môi khai triển

Triển khai 3 hệ dung môi trên và kết quả thu được như sau :

Hình 3.1. Sắc ký đồ mẫu chuẩn và thử tại 3 hệ dung môi soi tại ánh sáng trắng và bước sóng 254nm.

Trong đó: C1 là chuẩn 0.2 mg/ml.

T1 là mẫu nụ hoè pha loãng 100 lần. T2 là dịch hoa hoè nở pha loãng 100 lần. Hệ 1 : N-butanol : acid acetic : nước = 4: 1: 5. Hệ 2 : ethyl acetat : acid formic : nước = 8: 1: 1. Hệ 3 : Ethyl acetat : acid formic : methanol = 7: 1: 1.

Nhận xét :

 Hệ 1 chạy có vết kéo dài nên không lựa chọn

 Hệ 3 chạy có vệt kéo đều nhưng khi xử lý dữ liệu bằng phần mềm video scan thấy có hiện tượng pic nền lớn và không thể loại được pic nền này nên không thể chọn vì gây sai số hệ thống.

Hình 3.2. Pic sắc ký chuẩn Rutin tại hệ dung môi 3.

 Hệ 2 cho vết gọn hơn, không bị kéo vết và vẫn có hiện tượng pic nền nhưng loại được bằng cách sấy khô bản mỏng ở 110C trong 10-15 phút và pic nền giảm đi rõ rệt.

Hình 3.3. Pic sắc ký chuẩn Rutin tại hệ dung môi 2

Kết luận : Lựa chọn hệ 2 làm hệ dung môi khai triển.

 Điều kiện chạy HPTLC

- Hoạt hoá bản mỏng ở 110C trong 2 giờ.

- Nhiệt độ phòng chạy là 25C, độ ẩm từ 50-60%.

- Vết chấm từ 6 mm và có lượng chấm 6 µl, tốc độ phun dịch chấm là 120nl/s. - Thời gian bão hoà dung môi là 20 phút.

- Thời gian bão hoà dung môi với bản mỏng 2 phút. - Thời gian sấy bản mỏng là 15-20 phút gồm 2 bước :

+ Sấy gió trong thời gian 5 phút.

+ Sấy tĩnh ở nhiệt độ 110C trong 10-15 phút. - Bước sóng đo là 254nm.

3.1.1.2. Lựa chọn dãy nồng độ chuẩn.

Tiến hành pha chuẩn rutin với methanol thu các nồng độ như bảng 2.2, sau đó chấm sắc ký trên cùng 1 bản mỏng Silicagel GF254 20x10 cm và đo tại bước sóng 254nm. Kết quả thu được như sau :

Hình 3.4. Đường chuẩn của dãy chuẩn 1

Hình 3.5. Đường chuẩn của dãy chuẩn 2

Nhận xét :

 Với dãy chuẩn 1 (hàm lượng chuẩn rutin từ 0.1-0.2-0.3-0.4-0.5 mg/ml) và dãy chuẩn 3 (hàm lượng chuẩn rutin từ 0.15-0.2-0.25-0.3-0.4-0.45 mg/ml) giá trị độ lệch chuẩn thấp không phù hợp.

 Với dãy chuẩn 2 (hàm lượng chuẩn rutin từ 0.1-0.15-0.2-0.25-0.3 mg/ml) thì cho đường chuẩn có độ lệch chuẩn thấp, kết quả R2 > 0.99 nên lựa chọn dãy chuẩn này.

Kết luận:

Lựa chọn dãy chuẩn 0.1-0.15-0.2-0.25-0.3 mg/ml làm dãy chuẩn để định lượng. Kết quả về diện tích pic lập đường chuẩn trên excel thu được lập đường chuẩn có phương trình như sau :

𝑦 = 184526𝑥 + 2270.5 Trong đó: y: là giá trị đo của diện tích pic

x: là nồng độ rutin trong mẫu Với độ lệch R2 = 0.9975. lập đồ thị

Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn rutin theo chiều cao pic

- Đường chuẩn theo chiều cao pic:

y = 6908.6x + 258.43 R² = 0.9977 0 500 1000 1500 2000 2500 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 ch iề u c ao p ic nồng độ rutin (mg/ml)

Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn rutin theo diện tích pic

- Đường chuẩn theo diện tích pic:

Nhận xét : Đường chuẩn xây dựng theo diện tích pic và chiều cao pic đều có giá trị R2 > 0.99 do đó có thể sử dụng cả 2 phương pháp tính này.

3.1.1.3. Lựa chọn độ pha loãng thích hợp

Khảo sát các độ pha loãng đối với từng mẫu thử thu được kết quả như phụ lục 3 sau :

 Với nụ non, nụ bánh tẻ, nụ sắp nở ở độ pha loãng 1250 lần thì vết rutin lên gọn không bị kéo và nồng độ rutin tính theo diện tích pic và chiều cao pic đều nằm trong khoảng nồng độ từ 0.1 – 0.3 mg/ml.

 Với mẫu hoa nở ở độ pha loãng 625 lần, 833.33 lần và 1250 lần đều cho nồng độ rutin nằm trong đường tuyến tính của dãy chất chuẩn tuy nhiên do ở độ pha loãng 833.33 lần và 1250 lần nằm sát ở giới hạn dưới của dãy chuẩn dễ gây ra sai sô nên đề tài lựa chọn độ pha loãng 625 lần.

 Với mẫu quả thì độ pha loãng 200 lần phù hợp.

 Với sao vàng thì ở độ pha loãng 1250 cho nồng độ rutin nằm giữa khoảng nồng độ tuyến tính. y = 184526x + 2270.5 R² = 0.9975 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 d iệ n t íc h p ic nồng độ rutin ( mg/ml)

 Với mẫu sao đen chọn độ pha loãng 625 lần.

Kết luận : chọn các nồng độ pha loãng cho từng mẫu như sau

Bảng 3.1. Nồng độ pha loãng từng mẫu

Nụ non

Nụ bánh tẻ

Nụ sắp

nở Hoa nở Quả Sao vàng Sao đen

Độ pha loãng

1250 1250 1250 625 200 1250 625

3.1.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng

 Độ đặc hiệu

Triển khai sắc ký trên 3 mẫu trắng, thử, chuẩn thu được kết quả như sau: Sắc ký