1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây trồng loài stephania dielsiana y c wu tại ba vì ( hà nội ) bằng phương pháp HPTLC

82 544 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 82
Dung lượng 2,63 MB

Nội dung

Định tính - Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được: Chấm tương đối đậm mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau.. Bán đ

Trang 1

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG CÂY TRỒNG

LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y C WU

TẠI BA VÌ (HÀ NỘI) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

Trang 2

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG CÂY TRỒNG

LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y C WU

TẠI BA VÌ (HÀ NỘI) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân

thành tới TS Nguyễn Quốc Huy, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ

bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới:

DS Nguyễn Vũ Minh, người đã hướng dẫn tận tình, đóng góp những ý kiến

quý báu và luôn tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

DS.Nghiêm Đức Trọng, DS Tạ Khắc Công đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi

rất nhiều kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn

Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật đã hết lòng giúp đỡ và tạo

mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận

Em Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, em Lê Thiên Kim – A1K66, em Lê

Trọng Sơn - A2K66 đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên

cứu khoa học tại bộ môn

Và tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu, các

thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5

năm học qua, cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi

Hà Nội, 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Thùy Linh

Trang 4

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……… 3

1.1 LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y C WU……… 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố……… 3

1.1.2 Thành phần hóa học……… 4

1.1.3 Tác dụng sinh học và công dụng……… 5

1.1.3.1 Tác dụng sinh học……… 5

1.1.3.2 Công dụng……… 5

1.2 OXOSTEPHANIN……… 5

1.2.1 Công thức phân tử và tính chất vật lý……… 6

1.2.2 Tác dụng dược lý……… 6

1.3 SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO……… 6

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng……… 6

1.3.1.1 Nguyên tắc……… 6

1.3.1.2 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng……… 8

1.3.2 Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao – HPTLC……… 10

1.3.3 Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu……… 10

Trang 5

1.3.2.1 Định tính……… 10

1.3.2.2 Bán định lượng……… 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 14

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU……… 14

2.1.1 Nguyên liệu……… 14

2.1.1 Hóa chất và dụng cụ……… 17

2.1.1.1 Máy móc và dụng cụ thí nghiệm……… 17

2.1.1.2 Hóa chất……… 18

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 18

2.2.1 Nội dung nghiên cứu ……… 18

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 18

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng……… 18

2.2.2.2 Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây……… 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 24

3.1 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM……… 24

3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC……… 24

3.1.1.1 Xử lý mẫu thử……… 24

3.1.1.2 Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn…… 25

3.1.1.3 Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC……… 26

3.1.1.4 Thẩm định phương pháp định lượng……… 26

3.1.2 Định lượng oxostephanin trong cây trồng loài S.dielsiana……… 29

Trang 6

3.1.3 Đánh giá hàm lượng oxstephanin trong cây trồng loài S.dielsiana……… 30

3.1.3.1 Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong các bộ phận khác nhau của cùng 1 cây……… 30

3.1.3.2 Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong các mẫu theo các độ tuổi khác nhau……… 32

3.1.3.3 Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin tích lũy trong mẫu cây trồng từ hạt và cây trồng từ hom……… 33

3.1.3.4 Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong mẫu củ trưởng thành theo các mùa khác nhau……… 34

3.2 BÀN LUẬN……… 35

3.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng ……… 35

3.2.2 Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây……… 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 39

KẾT LUẬN……… 39

KIẾN NGHỊ……… 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

PHỤ LỤC 4

PHỤ LỤC 5

PHỤ LỤC 6

Trang 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

GACP Good Agricultural and Collection Practices

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatigraphy

HPLC High Performance Liquid Chromatography

Trang 8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chất làm pha tĩnh cho TLC……… 7

Bảng 1.2 Một số thuốc thử tạo màu trong nghiên cứu dược liệu……… 9

Bảng 2.1 Danh mục các mẫu cây nghiên cứu……… 16

Bảng 2.2 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)……… 19

Bảng 3.1 Nồng độ oxostephanin chuẩn và diện tích pic đáp ứng………… 27

Bảng 3.2 Giá trị Rf và diện tích pic của các vết……… 28

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ đúng……… 29

Bảng 3.4 Kết quả định lượng oxostephanin bằng HPTLC……… 30

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phương sai……… 31

Bảng 3.6 So sánh hàm lượng oxostephanin theo các cặp mẫu cây trồng từ hạt và cây trồng từ hom……… 34

Trang 9

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cụm hoa đực và hoa đực……… 3

Hình 1.2 Cụm hoa cái……… 3

Hình 1.3 Quả xanh và hạt……… 4

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của oxostephanin……… 6

Hình 2.1 Vườn trồng củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội……… 14

Hình 2.2 Củ loài S dielsiana……… 15

Hình 2.3 Thân lá non loài S dielsiana……… 15

Hình 2.4 Thân lá bánh tẻ loài S dielsiana……… 15

Hình 2.5 Thân lá già loài S dielsiana……… 16

Hình 2.6 Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC……… 18

Hình 3.1 Sắc ký đồ tại độ pha loãng 50 lần……… 25

Hình 3.2 Sắc ký đồ tại độ pha loãng 100 lần……… 25

Hình 3.3 Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 1……… 26

Hình 3.4 Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 2……… 26

Hình 3.5 Đường chuẩn định lượng xây dựng được từ dãy chuẩn 3……… 26

Hình 3.6 Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng……… 28

Hình 3.7 Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic……… 29

Hình 3.8 Biểu đồ hàm lượng oxostephanin trung bình trong các mẫu của cây

Trang 11

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước có hệ thực vật phong phú, trong đó có khoảng 4000 loài thực vật có thể làm thuốc trong các nền Y học dân gian, 800 loài thường được dùng trong Y Học cổ truyền chính thống và 300 loài dùng trong công nghiệp dược [40] Như vậy có thể thấy tiềm năng về cây thuốc ở Việt Nam còn rất lớn Nghiên cứu để tìm ra cây thuốc mới cùng những hoạt chất mới từ dược liệu là việc làm cần thiết để nâng cao giá trị sử dụng cũng như phát triển nền Y học cổ truyền Việt Nam

S dielsiana Y C Wu là một loài Bình vôi được ghi trong Sách đỏ Việt Nam,

thường được gọi là củ dòm hay củ gà ấp [24] Người dân địa phương tại Ba Vì thường dùng cả củ và thân lá để điều trị tê thấp đau nhức, đau dạ dày Oxostephanin

một alkaloid quan trọng đã được phân lập từ củ và lá loài S dielsiana Y C Wu

trồng ở Ba Vì, Hà Nội [11], [17] Hoạt chất này sau đó đã được thử tác dụng gây độc trên 3 dòng tế bào ung thư: ung thư gan (Hep-2), phổi (LU) và màng tim (RD) cho kết quả IC50 lần lượt là: 0.566; 0.755 và 1.404 [22] Một số nghiên cứu trên thế giới cũng đã chứng minh oxostephanin có tác dụng trên 2 dòng tế bào ung thư là ung thư da (Epidermoid carcinoma-KB) và ung thư vú (Breast cancer-BC) [35] Với

những kết quả trên có thể thấy tiềm năng phát triển của loài S dielsiana là rất lớn

Hiện nay chúng tôi đã tiến hành trồng và theo dõi sự phát triển của loài cây này tại

Ba Vì (Hà Nội), với định hướng trồng phát triển một loài cây thuốc mới theo hướng

“Thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc (GACP)” của tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO)

Chính vì vậy, nghiên cứu hàm lượng oxostephanin tích lũy trong cây, đặc biệt là đánh giá hàm lượng của alkaloid này ở các bộ phận khác nhau của cây có ý nghĩa quan trọng để xác định bộ phận thu hái, thời điểm thu hái phù hợp Hoạt động này cũng là bước đầu trong lộ trình tiêu chuẩn hóa dược liệu

Với các lý do như trên, đề tài: “Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây trồng loài Stephania dielsiana Y C Wu tại Ba Vì (Hà Nội) bằng phương pháp HPTLC” đã được thực hiện với 2 mục tiêu sau:

Trang 12

1 Xây dựng quy trình định lượng oxostephanin trong cây trồng loài S dielsiana Y

C Wu bằng phương pháp HPTLC

2 Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây trồng loài S dielsiana

Y C Wu

Trang 13

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y C WU

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Loài S dielsiana Y C Wu thuộc chi Stephania Lour., họ Tiết dê

(Menisperaceae), bộ Hoàng Liên (Ranunculaceae), phân lớp Hoàng Liên (Ranunculidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [2], [3], [6], [7]

S dielsiana Y.C.Wu có tên thường dùng là củ dòm [22], [24], tên khác là

bình vôi nhựa tím, cà tòm ( dân tộc Tày - Tuyên Quang), củ gà ấp [22], [24] Củ dòm là dạng cây dây leo nhỏ, sống nhiều năm Rễ củ to Thân leo cuốn dài khoảng 3

m Thân non màu tím hồng nhạt Ngọn non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím hồng [23], [24] Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực do 3-5 xim nhỏ hợp thành xim tán kép Hoa nhỏ, có cuống ngắn; đài 6, màu tím, xếp 2 vòng, cánh hoa 3, hình quạt tròn, màu vàng cam Cột nhị ngắn, bao phấn 6, dính thành đĩa 6 ô [12] Cụm hoa cái gồm 7-8 đầu nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng đầu Hoa nhỏ; đài 1, màu tím hồng; cánh hoa 2, hình quạt tròn, màu vàng cam và có các vân tím; bầu hình trứng, đầu nhụy có 4-5 thùy dạng dùi [24]

Hình 1.1 Cụm hoa đực và hoa đực

Hình 1.2 Cụm hoa cái

Trang 14

Quả hình trứng đảo, hơi dẹt Hạt hình trứng ngược cụt đầu, có lỗ thủng ở giữa, trên lưng hạt có 4 hàng gai nhọn, cong [24]

Hình 1.3 Quả xanh và hạt

Loài S dielsiana Y.C.Wu phân bố nhiều ở Việt Nam và Trung Quốc Tại

Việt Nam, loài này phân bố chủ yếu ở Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang (Na Hang, Chiêm Hóa), Bắc Kạn, Thái Nguyên (Đại Từ, Tam Đảo), Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hà Nội (Ba Vì), Quảng Nam (Trà My, Trà Mai, Trà Giác) [10], [12], [13], [22], [24], [27]

1.1.2 Thành phần hóa học

Alkaloid là thành phần chính của loài nghiên cứu, ngoài ra còn có một số thành phần khác như tinh bột, đường khử tự do, acid hữu cơ [17] Theo Nguyễn Linh Chi, hàm lượng alkaloid toàn phần trong mẫu củ tăng dần từ 2.68% ở cây 8 tháng tuổi lên 4.85% ở cây 28 tháng tuổi đối với cây trồng từ hạt; từ 2.06% ở cây 7 tháng tuổi lên 4.52% ở cây 34 tháng tuổi đối với cây trồng từ hom [11]

Trong một số nghiên cứu trên thế giới, các alkaloid đã được phân lập từ loài bao gồm: Magnoflorin (C20H24NO4) [32], [39]; Cyclanolin (C20H24O4N+) [39]; L-

tetrahydropalmatin (C21H25NO4) [33], [34], [38], [39]

Từ loài S.dielsiana thu hái ở Ba Vì (Hà Nội) đã phân lập được 4 alkaloid từ củ là:

L-tetrahydropalmatin, oxostephanin, dehydrocrebanin [17], thailandine [21] Kết quả định lượng bằng phương pháp HPLC cho hàm lượng L-tetrahydropalmatin trong mẫu củ cây 20 tháng tuổi, 34 tháng tuổi và cây trưởng thành lần lượt là

0.035%, 0.33% và 0.4% [11], [17]

Trang 15

1.1.3 Tác dụng sinh học và công dụng

1.1.3.1 Tác dụng sinh học

- Nước sắc từ củ loài S dielsiana phơi khô đem thử tác dụng sinh học trên

động vật thí nghiệm cho thấy với liều 2.5 g và 5 g/kg ttc có tác dụng giảm đau ngoại biên theo kiểu aspirin, không có tác dụng giảm đau trung ương theo cơ chế tương tự morphin; với liều 50 mg/kg, tác dụng giảm đau đến chậm từ 10-30 phút sau khi cho chuột uống [17]

- Tác dụng chống viêm cấp được thực hiện trên 2 mô hình: (i) Mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin: Kết quả cho thấy tác dụng chống viêm cấp của dịch

chiết loài S dielsiana ở liều 1.5 g và 3 g/kg chỉ có tác dụng sau 24 giờ, tác dụng

chống viêm này chậm, không giống tác dụng của indomethacin với liều 5 mg/kg;

(ii) Mô hình gây tràn dịch màng bụng: củ loài S dielsiana với liều 1.5 g và 3 g/kg

không có tác dụng Ở tác dụng chống viêm mạn dùng mô hình gây u hạt, với liều thí

nghiệm 5 g/kg củ loài S dielsiana có tác dụng làm giảm u hạt, kết quả cho thấy củ

dòm có tác dụng gần tương tự tác dụng chống viêm của prednisolon với liều

5mg/kg Như vậy củ loài S dielsiana có tác dụng giảm đau ngoại biên và chống

viêm, tuy nhiên tác dụng này còn phụ thuộc vào liều dùng và thời gian tác dụng chậm [22]

1.1.3.2 Công dụng

Theo Võ Văn Chi [9], [10], rễ loài được dùng uống, chữa đau lưng, mỏi nhức chân, đau lưng, đau bụng, giúp ngủ rất say Còn dùng đắp chỗ sưng bắp chuối, nhọt cứng, apxe do viêm Người ta thường giã lẫn với muối và gừng Nhân dân ở Bắc Thái (Thái Nguyên và Bắc Cạn), Hà Tây (Hà Nội) thường dùng củ thái nhỏ nấu nước uống, chữa kiết lỵ ra máu, đau bụng kinh niên và đau dạ dày

1.2 OXOSTEPHANIN

Oxostephanin là alcaloid đã được phân lập từ 3 loài: S zippeliana, S

japonica, S suberosa [31], [32] Ở Việt Nam, oxostephanin có trong loài S dielsiana Y C Wu [17]

Trang 16

1.2.1 Công thức phân tử và tính chất vật lý

Oxostephanin thuộc nhóm aporphin, có công thức phân tử là C18H11NO4 (Hình 1.4), tồn tại ở dạng tinh thể hình kim, màu vàng, nóng chảy ở 160-162˚C Phổ UV có 3 cực đại hấp thụ tại các bước sóng (nm): 217, 249, 270, 358, 421 [20]

N O

O

O OCH3

5 4 3

2 1

7

8 9 10 11

3a

6 6a 6b

7a 11a 11b

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của oxostephanin 1.2.2 Tác dụng dược lý

Nghiên cứu trên thế giới cho kết quả oxostephanin có tác dụng gây độc trên 2 dòng

tế bào là ung thư da (Epidermoid carcinoma-KB) và ung thư vú (Breast cancer-BC) [43] Ngoài ra, oxostephanin còn có tác dụng gây độc trên dòng tế bào ung thư gan (Hep-2), ung thư phổi (LU) và ung thư cơ vân (RD) [17]

1.3 SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng

1.3.1.1 Nguyên tắc

- Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một lớp mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp

và được hút lên bản sắc kí bởi lực mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1]

- Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ

số lưu giữ Rf Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Trang 17

Rf = Trong đó:

dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf có giá trị dao động từ 0 đến 1

- Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 – 30 µm, được rải đều và kết

dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông Bản mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5 – 20 cm, nhiều khi

có thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích [1] Chất hấp phụ thường dùng nhất là các loại silica gel (>90%) rồi đến nhôm oxyd (<5%) Các loại khác (than hoạt, Polyamid, Florisil, Celite, Kieselguhr)…ít được sử dụng [5]

Bảng 1.1 Một số chất làm pha tĩnh cho TLC [5]

Pha tĩnh Cơ chế sắc ký Ứng dụng phân tích

Silica Hấp phụ Acid amin, hydrocarbon, alkaloid, vitamin Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực

Cellulose Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid

Alumina Hấp phụ Hydrocarbon, alkaloid, chất màu thực phẩm,

lipid

Cellulose trao đổi

ion Trao đổi ion Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,

halogenid Gel Sephadex Loại cỡ Polymer, protein, phức kim loại

- Pha động cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường rửa giải, thường kết hợp 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa 2 pha Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường chủ yếu dựa vào kinh nghiệm Một số gợi ý chung nhất cho pha động TLC [1]:

+ Dung môi cần có độ tinh khiết cao

Trang 18

+ Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0.2 – 0.8, đạt độ phân giải cực trị

+ Chất phân tích dạng ion hay phân cực rửa giải tốt bằng dung môi phân cực như hỗn hợp n-butanol – nước Thêm một ít acid acetic hoặc ammoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng

+ Khi dùng silica hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng Nếu thêm một ít dung môi phân cực như ethyl ethylic vào dung môi không phân cực như methylbenzene sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf

+ Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ hoàn toàn có thể sử dụng cho TLC với pha tĩnh là silica hoặc alumina

1.3.1.2 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

Đầu tiên là lựa chọn bản mỏng sắc ký có kích thước phù hợp, hoạt hóa trong thời gian và nhiệt độ thích hợp Sau đó, thực hành sắc ký lớp mỏng có 4 bước sau Bước 1: Đưa chất phân tích lên bản mỏng

- Lượng và thể tích mẫu chấm: Lượng mẫu đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan

trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến trị số Rf Nếu lượng chất quá lớn, vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó các vết có trị số Rf gần nhau sẽ chồng lên nhau và không tách riêng được Nếu lượng chất quá nhỏ có thể khó phát hiện vết Lượng mẫu đưa lên bản mỏng khoảng 0.1 – 50 µg Tùy theo kiểu đưa mẫu lên bản mỏng

mà thể tích mẫu cũng khác nhau Trường hợp mẫu đưa dưới dạng điểm, thể tích mẫu khoảng 1-5 µl; còn trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dạng vạch thì lượng

mẫu đưa lên khoảng 0.1 – 0.2 µl [1], [5]

- Vị trí đưa mẫu lên bản mỏng: Đường xuất phát cách mép dưới bản mỏng và mép

của dung môi pha động đủ lớn để tốc độ di chuyển của dung môi từ khi bắt đầu đến điểm đưa mẫu lên bản mỏng đã khá ổn định Tốt nhất là cách mép dưới bản mỏng 1.5 cm và cách mép dung môi từ 0.8 - 1cm Khoảng cách giữa các vết và giữa vết với mép ngoài bản mỏng tốt nhất nên là 1 cm để tránh hiệu ứng bờ [1], [5]

Trang 19

Bước 2: Khai triển sắc ký

- Thiết bị triển khai sắc ký thường là bình thủy tinh có nắp đậy kín, kích thước phù hợp với bản mỏng Để tăng độ bão hòa dung môi pha động trong bình (nhất là đối với dung môi có độ nhớt cao, khó bay hơi), người ta đặt tờ giấy lọc áp sát thành bình

- Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô được cho vào bình sắc ký đã bão hòa pha động Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm vẫn cách

bề mặt pha động khoảng 1 cm [5]

Bước 3: Hiện sắc ký đồ, dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất cần phân tích

để lựa chọn cách phát hiện thích hợp vết sắc ký

- Sử dụng thuốc thử hiện màu [5]: Sau khi khai triển, muốn quan sát đầy đủ nhất tất

cả các vết, thường phải phun thuốc thử lên bề mặt bản mỏng hoặc nhúng cả bản mỏng vào thuốc thử Đôi khi làm nóng bản mỏng để làm tăng tốc độ phản ứng tạo màu và cường độ vết màu

Bảng 1.2 Một số thuốc thử tạo màu trong nghiên cứu dược liệu

STT Hợp chất Thuốc thử hiện màu

5 Hữu cơ nói chung H2SO4 20% ( không đặc hiệu)

- Soi dưới ánh sáng đèn UV [1]: Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ trở nên tối

hoặc phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 hoặc 366 nm Một số

Trang 20

bản mỏng tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh quang

- Dùng densitometer [1]: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng

khi soi dưới đèn UV-VIS Chất phân tích bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký Bước 4: Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm [1]

1.3.2 Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao – HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kỹ thuật SKLM Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động như: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc

ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết (TLC Scanner 3,4), và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [39]

Ưu điểm của phương pháp này so với SKLM thông thường là [14]:

- Khả năng phân tách tốt hơn Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng cao có kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản mỏng cũng tốt hơn

- Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản mỏng

có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn

- Thời gian triển khai ngắn hơn

- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc ký tự động, buồng triển khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu Các yếu tố về môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được kiểm soát và hạn chế tới tối đa các thay đổi

HPTLC ngày càng đươc ứng dụng nhiều trong định tính, định lượng

1.3.3 Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu

1.3.3.1 Định tính

- Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được: Chấm tương đối đậm mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau Nếu cả 3 sắc ký đồ đều cho một vết gọn trong một vùng Rf = 0.30 – 0.75 thì có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết Việc khẳng định sự

Trang 21

tinh khiết của mẫu thử sẽ được kiểm tra bằng phương pháp phổ học khác (UV, IR, NMR, MS) [5]

- So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất 3 vết: vết I (mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn) Nếu trên cả

3 sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số Rf, về hình dạng vết, về màu sắc vết trước và sau khi hiện màu) thì có thể sơ bộ kết luận mẫu thử và mẫu chuẩn là đồng nhất [5]

- Kiểm nghiệm dược liệu: Cùng với một quy trình chiết xuất như nhau, dịch chiết của mẫu thử dược liệu được chấm song song với dịch chiết của mẫu dược liệu chuẩn (thực hiện trên 3 bản mỏng khác nhau, không cần chấm trùng) Sau đó so sánh các vết cùng trên 1 bản mỏng về số vết, Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược liệu chuẩn [5]

- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu: Bằng một chiết xuất nhất định, trong các điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu là không đổi về số vết, về trị số Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ

lệ tương đối giữa các vết… Sắc ký đồ được coi là tài liệu không thể thiếu trong công tác xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm các dược liệu [5]

Theo kết quả thống kê trong tài liệu [14], SKLM là một trong các tiêu chuẩn định tính có mặt trong hầu hết các chuyên luận dược liệu trong Dược điển Dược điển thảo dược Hoa Kỳ có 31 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc (2010) có 873 chuyên luận và con số này trong Dược điển Việt Nam IV là 168 Hình ảnh sắc ký

đồ SKLM cho các vết đặc trưng của dược liệu Ứng dụng này giúp xây dựng “dấu vân tay” hóa học của từng dược liệu và từ đó xác định tính đúng của dược liệu, phát hiện sự nhầm lẫn, giả mạo, đánh giá chất lượng dược liệu

Trang 22

1.3.3.2 Bán định lượng

Dựa trên diện tích hoặc dựa trên cường độ màu (khi phun thuốc thử hoặc khi soi UV) của các vết xuất hiện trên bản mỏng (đặc biệt là bản mỏng hiệu năng cao), nếu có mẫu chuẩn tương ứng, có thể bán định lượng một chất (hay một nhóm chất)

có trong mẫu thử HPTLC được ứng dụng trong bán định lượng bằng phương pháp

so sánh Một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau được pha sẵn Dựa vào mối liên hệ giữa nồng độ chất chuẩn đã biết và diện tích pic đáp ứng của chất đó trên sắc ký đồ để từ đó xây dựng đường chuẩn định lượng Đo tín hiệu đáp ứng diện tích pic của chất cần phân tích trong mẫu thử và nội suy nồng độ từ đường chuẩn đã xây dựng ở trên [5]

Trên thế giới, nhiều lĩnh vực đã ứng dụng HPTLC trong bán định lượng như: nghiên cứu lâm sàng, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp, pháp y, môi trường [14] Trong nghiên cứu dược liệu, theo xu hướng phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc thực vật, định lượng hoạt chất trong dược liệu bằng HPTLC là một nội dung nghiên cứu được quan tâm phát triển Năm 2010, nghiên cứu định lượng berberin bằng HPTLC được tiến hành ở Ấn Độ Kết quả hàm lượng berberin là khoảng 4.0% Thẩm định độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp cho RSD lần lượt là 3.0% và 2.7% [29] Cũng ứng dụng quy trình trên, năm 2012, Nguyễn Thị Thu Hằng cũng đã định lượng berberin trong thân và

rễ của 1 số cây loài Berberis bằng phương pháp HPTLC Kết quả hàm lượng

berberin trong mẫu rễ là 3.98% và trong mẫu thân là khoảng 1.6% đến 3.1% [15]

Quy trình định lượng tetrandrine trong củ S tetrandra S More (phòng kỷ, họ Tiết

dê - Menisperaceae) bằng phương pháp HPTLC là một trong số các bộ quy trình

định lượng đang được hãng Camag xây dựng [39] Tetrandrine là thành phần hoạt

chất chính, có tác dụng lợi tiểu và làm giảm tình trạng thấp khớp Dược điển Trung Quốc quy định hàm lượng của tetrandrine trong dược liệu phải trên 0.7% HPTLC không chỉ giúp xác định nhanh hàm lượng tetrandrine mà hình ảnh sắc ký đồ còn giúp phân biệt vị thuốc này với một vị thuốc khác cũng có tên là phòng kỷ nhưng

Trang 23

thuộc họ Mộc thông (Aristolochiaceae), trong thành phần có chứa acid độc aristolochic là chất gây suy thận và ung thư [18]

Trang 24

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

- Nguyên liệu nghiên cứu là củ và thân lá cây củ dòm (đã được giám định tên

khoa học là Stephania dielsiana Y.C.Wu, tiêu bản được lưu giữ ở phòng Tiêu bản –

Trường Đại học Dược Hà Nội, mã số tiêu bản là HNIP/17701/10) trồng tại Xã Tản Lĩnh, Huyện Ba Vì, Hà Nội

Hình 2.1 Vườn trồng củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội

- Mẫu nghiên cứu để xây dựng quy trình định lượng: Mẫu củ và thân lá cây trồng

loài S dielsiana trưởng thành, được thu hái nhiều lần tại các thời điểm khác nhau

trong năm

- Mẫu nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng oxostephanin theo các bộ phận khác nhau của cây, theo tuổi và theo nguồn gốc cây, lấy trên cùng một cây Các mẫu được thu

Trang 25

hái trên các cây trồng từ hạt, trồng từ hom của cây 1 tuổi, 2 tuổi, trưởng thành, thu hái các bộ phận sau:

+ Mẫu củ

Hình 2.2 Củ loài S dielsiana

+ Mẫu thân lá non: phần ngọn cây, dài 50 – 60 cm, lá và thân có màu tím hồng Thân mềm nhẵn, kích thước phát triển chưa đầy đủ

Hình 2.3 Thân lá non loài S dielsiana

+ Mẫu thân lá bánh tẻ: tiếp theo phần non, dài khoảng 150-200 cm, màu xanh đậm Thân cây dai chắc, kích thước đã phát triển đầy đủ

Hình 2.4 Thân lá bánh tẻ loài S dielsiana

+ Mẫu thân lá già: phần cuối, phía gần gốc cây Lá bắt đầu chuyển màu vàng, thân

có màu nâu xám, bề mặt xù xì, có khía dọc

Trang 26

Hình 2.5 Thân lá già loài S dielsiana

- Mẫu nghiên cứu theo mùa: Mẫu củ cây trưởng thành trồng từ hạt, thu hái vào tháng 2/2014, tháng 6/2013, tháng 8/2013, tháng 11/2013

Danh mục các mẫu nghiên cứu được ký hiệu trong bảng sau:

Bảng 2.1 Danh mục các mẫu cây nghiên cứu

Trang 27

STT Ký hiệu Mẫu

Trưởng thành

- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag bao gồm máy

Linomat 5, ADC2, TLC Visualizer, phần mềm winCATS, phần mềm VideoScan

Hình 2.5 Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC

- Bình chiết ngấm kiệt

Trang 28

- Bình triển khai sắc ký

- Bản mỏng HPTLC Silica gel 60 F254 (Merk) dành cho HPTLC và TLC

- Tủ sấy WiseVen (R) WOF

- Máy đo hàm ẩm Precisa HA60

- Cân phân tích Shimadzu (AY220)

- Nồi đun cách thủy

- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 100 và 200 ml; bình định mức 100 ml;

pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh

2.1.1.2 Hóa chất:

- Chloroform, Methanol, n-Butanol, Acid acetic, Nước cất, Ammoniac

25%, Aceton, Toluene, Ethylacetat

- Chất chuẩn oxostephanin hàm lượng 99.90% (chuẩn nghiên cứu [20]) 2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin bằng HPTLC:

+ Khảo sát hệ dung môi khai triển và các biện pháp xử lý mẫu để chọn ra các điều kiện thực nghiệm cho các vết trên bản mỏng gọn, tròn, vết oxostephanin tách được khỏi các vết khác Khảo sát khoảng nồng độ của chuẩn oxostephanin trong các mẫu thử

+ Đánh giá tính tuyến tính, độ đặc hiệu, độ thích hợp của hệ thống, độ đúng của phương pháp

- Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng oxostephanin theo các bộ phận khác nhau của cây, theo độ tuổi, nguồn gốc của cây và theo các mùa trong năm

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng

- Xử lý mẫu thử:

+ Quy trình chiết xuất dược liệu [4], [5], [8]: Cân chính xác khoảng 2.0 g bột dược liệu, ngâm trong dung môi chiết xuất MeOH, bề mặt dung môi chiết cách bề

Trang 29

mặt dược liệu khoảng 2-3 cm Sau 24h, cho toàn bộ hỗn hợp trên vào bình chiết ngấm kiệt Liên tục bổ sung dung môi và rút dịch chiết với cùng tốc độ 20 giọt/phút

+ Lựa chọn độ pha loãng phù hợp cho dung dịch thử:

Dịch chiết thu được đem cô đến cắn Hòa tan cắn trong chính xác 50ml, 100 ml MeOH để được các dung dịch chấm mẫu Tiến hành triển khai sắc ký để so sánh vết chấm về kích thước, độ đậm và độ kéo vết

- Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn: Pha các dãy dung dịch chuẩn oxostephanin có các giới hạn nồng độ khác nhau như bảng sau:

Bảng 2.2 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)

- Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC [30], [36]:

+ Bản mỏng: Bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110˚C trong 30 phút Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm

+ Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat 5 Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 1.5 cm, cách mép dung môi từ 0.8 – 1 cm Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng

là 1.5 cm Độ dài băng chấm 6 mm và thể tích chấm mỗi vết là 2 µl Mỗi bản mỏng kích thước 20 × 10 cm chấm tối đa 15 vết

+ Hệ dung môi khai triển [11], [26], [39]:

Tiến hành triển khai bản mỏng trên một số hệ dung môi:

Trang 30

1) n-Butanol : Acid acetic đặc : H2O (60:20:20)

m là khối lượng bột dược liệu (g)

a là 100 lần độ ẩm của bột dược liệu (%)

- Thẩm định phương pháp định lượng

+ Độ đặc hiệu:

Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép

xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác có trong mẫu thử [16]

Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau:

1) Mẫu trắng: dung dịch MeOH

2) Mẫu thử: dịch chiết MeOH của mẫu củ cây 2 tuổi trồng từ hạt

3) Mẫu chuẩn oxostephanin hòa tan trong MeOH

Triển khai sắc ký với mẫu bằng hệ dung môi khai triển được lựa chọn ở trên Soi và chụp ảnh bản mỏng tại bước sóng 366 nm, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết và so sánh giá trị RSD của Rf [28]

Đánh giá kết quả: Đánh giá dựa trên giá trị RSD của Rf Công thức tính RSD:

Trang 31

Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu: (i) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; (ii) Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn

Giá trị đề nghị chấp nhận khi so sánh trị số Rf: Độ lệch chuẩn tương đối của giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ dung dịch thử không quá 5% Độ lệch giá trị Rf trên vết mẫu thử so với vết mẫu chuẩn không quá 5% [28]

+ Tính tuyến tính:

Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân

tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử [16]

Cách tiến hành: Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn với nồng độ: 0.01; 0.03; 0.09;

0.135; 0.18; 0.27 (mg/ml) Tiến hành triển khai HPTLC với dãy dung dịch chuẩn trên Xây dựng phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn

có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu [28]

Đánh giá: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ

tuyến tính Thông thường với giá trị r > 0.90 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến tính tốt [16]

+ Độ thích hợp của hệ thống:

Khái niệm: Độ thích hợp của hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết bị,

dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích Độ thích hợp của hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thử nghiệm [16]

Trang 32

Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn oxostephanin có nồng độ 0.03 mg/ml Tiêm 6

lần dung dịch chuẩn, triển khai HPTLC [28]

Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic Giá trị RSD của diện

tích (chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2.0% [28]

+ Độ đúng [28]:

Khái niệm: Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với

giá trị thực của mẫu đã biết

Cách tiến hành: Độ đúng của phương pháp HPTLC đối với định lượng hoạt

chất trong dược liệu được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn

Chuẩn bị các mẫu thử từ thân lá bánh tẻ của cây trưởng thành trồng từ hạt, thân lá già của cây trưởng thành trồng từ hạt, củ của cây trưởng thành trồng từ hạt theo quy trình như trên

Mẫu thử 1: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn có nồng độ 0.018 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên

Mẫu thử 2: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn có nồng độ 0.03 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên

Mẫu thử 3: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn có nồng độ 0.045 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên

Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn có nồng độ 0.01, 0.03, 0.09, 0.135, 0.18, 0.27 (mg/ml)

Tiêm lần lượt các mẫu theo quy trình định lượng thông thường, xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp theo công thức:

Đánh giá: độ đúng của phương pháp dựa vào tỷ lệ thu hồi và các giá trị RSD

của tỷ lệ thu hồi Không có các giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương pháp phải đạt được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ % và/hoặc khối lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử Nói chung, đối với phương pháp định lượng hàm lượng dược chất trong dược liệu, độ đúng của phương pháp có thể được chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chiết

Trang 33

tách phức tạp, giới hạn RSD có thể dao động từ ± 2.0% đến ± 10.0% hoặc hơn, tuy nhiên cần có biện giải về giới hạn này

2.2.2.2 Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây trồng

Tính toán và xử lý thống kê kết quả hàm lượng các mẫu bằng Excel và phần mềm R (phần mềm sử dụng cho phân tích thống kê và vẽ biểu đồ) với 2 phân tích thống kê là phân tích phương sai ANOVA và phân tích hậu định Tukey [25]

Một số công thức sử dụng trong tính toán thống kê:

Tổng bình phương (Sum of square)

Bình phương trung bình (Mean of square)

Trong đó:

MSB: tổng bình phương giữa các nhóm MSW: tổng bình phương trong các nhóm

Trang 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC

3.1.1.1 Xử lý mẫu thử:

Thực hiện xử lý mẫu thử như ở phần 2.2.2.1 thu được kết quả như sau:

*Lựa chọn độ pha loãng phù hợp cho dung dịch thử:

Hình 3.1 Sắc ký đồ tại độ pha loãng

50 lần

Hình 3.2 Sắc ký đồ tại độ pha loãng

100 lần

Chú ý:

Oxo: chuẩn oxostephanin

Củ: mẫu củ cây 1 tuổi trồng từ hạt

TL1: mẫu thân lá non cây 1 tuổi từ hạt

TL2: mẫu thân lá bánh tẻ cây 1 tuổi từ hạt

TL3: mẫu thân lá già cây 1 tuổi từ hạt

Tại độ pha loãng 50 lần, vết oxostephanin khá to, bị kéo và vết ở vị trí chấm chưa được kéo lên hết Độ pha loãng 100 lần cho vết oxostephanin gọn, đều hơn, không còn vết ở vị trí chấm mẫu Vì vậy lựa chọn độ pha loãng 100 lần để pha các mẫu thử là phù hợp

Trang 35

3.1.1.2 Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn

Xây dựng đường chuẩn định lượng từ 3 dãy dung dịch đã chuẩn bị ở mục 2.2.2.1, thu được kết quả như sau:

Hình 3.3 Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 1

Hình 3.4 Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 2

Hình 3.5 Đường chuẩn định lượng xây dựng được từ dãy chuẩn 3

Trang 36

Đường chuẩn định lượng của dãy chuẩn thứ nhất và thứ hai vẫn còn các điểm nồng độ nằm ngoài khoảng giới hạn Đường chuẩn thứ ba có tất cả các điểm nồng

độ nằm trong khoảng giới hạn Vì vậy chúng tôi lựa chọn dãy nồng độ thứ ba với các nồng độ 0.01, 0.03, 0.09, 0.135, 0.18, 0.27 mg/ml để xây dựng đường chuẩn định lượng các mẫu thử

3.1.1.3 Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC

* Hệ dung môi khai triển:

Triển khai sắc ký trên 5 hệ dung môi đã trình bày (phụ lục 2), kết quả như sau:

* Điều kiện chạy HPTLC:

- Điều kiện môi trường: nhiệt độ 26˚C; độ ẩm tương đối 65%

- Thể tích dung môi bão hòa: 25ml; dung môi khai triển: 10ml

- Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút

- Thời gian bão hòa bản mỏng: 5 phút

- Thời gian sấy khô bản mỏng: 5 phút

- Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80 mm

3.1.1.4 Thẩm định phương pháp định lượng

*Độ đặc hiệu

Triển khai sắc ký trên 3 mẫu trắng, thử, chuẩn thu được kết quả như sau:

- Sắc ký đồ của mẫu thử cho vết oxostephanin có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf (0.53) với vết oxostephanin trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với vết oxostephanin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn

Trang 37

Hình 3.6 Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng

Nhận xét: Kết quả trên cho thấy phương pháp phân tích có tính đặc hiệu với

chất chuẩn oxostephanin

*Tính tuyến tính:

Triển khai sắc ký với các nồng độ từ 0.01 đến 0.27 mg/ml thu được các vết

có diện tích pic tương ứng như bảng sau:

Bảng 3.1 Nồng độ oxostephanin chuẩn và diện tích pic đáp ứng

STT Mẫu Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic

Trang 38

Hình 3.7 Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic

Phương trình đường chuẩn theo diện tích pic:

Nhận xét: với giá trị r > 0.90, nhận thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương

quan tuyến tính giữa nồng độ oxostephanin và diện tích pic sắc ký

*Độ thích hợp của hệ thống:

Từ 6 lần tiêm mẫu khác nhau thu được giá trị Rf và diện tích pic như sau:

Bảng 3.2 Giá trị R f và diện tích pic của các vết

Giá trị Rf 0.482 0.474 0.486 0.482 0.489 0.499 Diện tích 51308.4 51261.4 51523.4 51137.0 52723.6 53285.6 RSD giữa các giá trị Rf và diện tích pic lần lượt là 1.73% và 1.74%

Nhận xét: Giá trị RSD tính theo diện tích pic hay Rf đều nằm trong giới hạn chấp nhận được, hệ thống HPTLC có hiệu năng phù hợp với quy trình phân tích trong quá trình tiến hành thực nghiệm

Trang 39

Tỉ lệ thu hồi (%)

Nhận xét: Giá trị RSD trung bình của độ đúng là 8.499%, nằm trong giới hạn cho

phép đối với phân tích dược liệu

3.1.2 Định lượng oxostephanin trong các bộ phận cây trồng loài S.dielsiana

Từ phương pháp định lượng ở trên, ghi nhận giá trị diện tích pic của các vết và thu được nồng độ oxostephanin trong các mẫu thử (phụ lục 1) Hàm lượng

oxostephanin trong các mẫu như sau:

Trang 40

Bảng 3.4 Kết quả định lượng oxostephanin bằng HPTLC

STT Mẫu lượng Khối Hàm ẩm

(%)

Hàm lượng (%) Hàm lượng

trung bình (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3

3.1.3 Đánh giá hàm lượng oxstephanin của cây trồng loài S.dielsiana

3.1.3.1 Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong các bộ phận khác nhau của cùng 1 cây

Tiến hành phân tích số liệu bằng phân tích ANOVA, thu được kết quả sau:

Ngày đăng: 28/07/2015, 17:13

TRÍCH ĐOẠN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w